Procedura di registrazione poligrafica per la misurazione del sonno nei topi

Riepilogo

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Abstract

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Introduzione

I progressi tecnici hanno spesso precipitato salti quantici nella comprensione dei processi neurobiologici. Ad esempio, la scoperta di Hans Berger nel 1929 che potenziali elettrici rilevati dal cuoio capelluto umano hanno assunto la forma di onde sinusoidali, la cui frequenza è direttamente correlato al livello di veglia del soggetto, ha portato a rapidi progressi nella comprensione del sonno-veglia regolazione, sia negli animali e nell'uomo simili. ¹ A tutt'oggi l'electroencephlogram (EEG), in combinazione con il elettromiogramma (EMG), cioè., attività elettrica prodotta dai muscoli scheletrici, rappresenta i dati "backbone" di quasi ogni sperimentale e clinica valutazione che cerca di correlare il comportamento e fisiologia con l'attività di neuroni corticali comportarsi animali, compresi gli esseri umani. Nella maggior parte dei laboratori di ricerca di base sonno queste registrazioni EEG sono eseguite utilizzando un sistema basato su cavo (Figura 1) in cui d acquisitoata è sottoposto off-line per modello e lo spettro di analisi [ad es., l'applicazione di una trasformata di Fourier (FFT) algoritmo] per determinare lo stato di vigilanza del soggetto in fase di registrazione. ^{2, 3} sonno è costituito da movimenti rapidi degli occhi (REM) e non-REM (NREM) del sonno. Sonno REM è caratterizzato da un rapido a bassa tensione EEG, il movimento degli occhi a caso, e atonia muscolare, uno stato in cui i muscoli sono effettivamente paralizzati. Sonno REM è noto anche come sonno paradossale, perché l'attività cerebrale assomiglia a quello di veglia, mentre il corpo è in gran parte scollegato dal cervello e sembra essere in sonno profondo. Al contrario, i neuroni motori vengono stimolati durante il sonno NREM, ma non c'è il movimento degli occhi. NREM sonno umano può essere suddiviso in 4 fasi, per cui la fase 4 è chiamata sonno profondo o sonno ad onde lente ed è identificato da grandi onde cerebrali lente con l'attività delta tra 0,5-4 Hz EEG. D'altra parte, una suddivisione tra fasi di sonno non-REM in piccoli animali, come topi unnd topi, non è stato stabilito, soprattutto perché non hanno lunghi periodi di sonno consolidati come visto negli esseri umani.

Nel corso degli anni, e sulla base dell'interpretazione EEG, diversi modelli di regolazione sonno-veglia, sia di circuito ea base umorale-, sono stati proposti. Il neurale e base cellulare della necessità di dormire o, in alternativa, "drive sonno", rimane irrisolto, ma è stato concettualizzato come una pressione omeostatica che costruisce durante il periodo di veglia ed è dissipata dal sonno. Una teoria è che i fattori endogeni somnogenic accumulano durante la veglia e che la loro graduale accumulo è il fondamento del sonno pressione omeostatica. Mentre la prima ipotesi formale che il sonno è regolato da fattori umorali è stato accreditato al lavoro di Rosenbaum pubblicato nel 1892 ^4, è stato Ishimori ^{5, 6} e Pieron ⁷ che in modo indipendente, e più di 100 anni fa, ha dimostrato l'esistenza di sostanze chimiche favorisce il sonno. Entrambi i ricercatori hanno proposto, e anzi hanno dimostrato, che le sostanze Hypnogenic o 'hypnotoxins "erano presenti nel liquido cerebrospinale (CSF) di cani privati ​​del sonno. ⁸ Nel corso dell'ultimo secolo diverse altre sostanze Hypnogenic presunti implicati nel processo omeostatico sonno sono stati identificati (per la revisione, vedi rif. 9), tra cui prostaglandine (PG) D _2, ¹⁰ citochine, ¹¹ adenosina, ¹² anandamide, ¹³ e il peptide urotensina II. ¹⁴

Il lavoro sperimentale per Economo ^{15, 16,} Moruzzi e Magoun ^17, e altri nei risultati prodotti primi e la metà del ²⁰ ° secolo che ha ispirato le teorie basate su circuiti di sonno e veglia e, in una certa misura, messo in ombra la teoria umorale allora prevalente di dormire. Ad oggi, diversi "modelli circuitali" sono stati proposti, reciprocamente informati dai dati di varia qualità e quantità (per la revisione, vedi rif. 18). Un modello, Ad esempio, propone che sonno lento è generato attraverso l'inibizione adenosina-mediata del rilascio di acetilcolina dai neuroni colinergici del proencefalo basale, un'area prevalentemente costituiti al nucleo dell'arto orizzontale della banda diagonale di Broca e inominata substantia. ¹⁹ Un altro modello popolare di regolazione del sonno / veglia descrive un meccanismo interruttore flip-flop sulla base delle interazioni reciprocamente inibitorie tra neuroni soporifera nella zona preottica ventrolaterale e neuroni-veglia indurre nel tronco ipotalamo e cerebrale. ^{18, 20, 21} Inoltre, per la commutazione in e fuori di sonno REM, una simile interazione reciprocamente inibitorio è stato proposto per aree del tronco cerebrale, che è la grigia ventrale periacqueduttale, laterale pontine tegmento, e il nucleo sublaterodorsal. ²² Collettivamente, questi modelli hanno dimostrato prezioso euristiche e conferiti importanti quadri interpretativi per gli studi di ricerca sul sonno; tuttavia, un voit più completa comprensione dei meccanismi molecolari e circuiti che regolano il ciclo sonno-veglia richiederà una più completa conoscenza dei suoi componenti. Il sistema di registrazione poligrafica descritto di seguito dovrebbe aiutare in questo obiettivo.

Protocollo

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Experiment Animal Istituzionale presso l'Università di Tsukuba.

1. Preparazione di elettrodi e cavi per EEG / EMG Recordings

1. Preparare EEG / EMG elettrodo di registrazione in base alla seguente procedura.
   Nota: L'elettrodo è monouso e può essere utilizzato solo per 1 animale. Pianificare attentamente la configurazione di cablaggio per tutti i connettori. Posizionare segni sui connettori per l'orientamento corretto.
   1. Saldare ogni pin di un colpo di testa a 4 pin per un filo di acciaio inossidabile di 2 cm. In breve, tenere un capo del filo al pin, inserire un saldatore caldo sul giunto wire-pin, e sciogliere qualche saldatura per garantire che sufficiente saldatura senza intoppi nel giunto. Fare attenzione a non applicare troppo calore al perno; altrimenti, la plastica attorno ai perni si scioglierà.
   2. Saldare l'estremità libera di ciascuna delle 2 fili collegati ai pin alla testadi una vite in acciaio inox 1,0 mm di diametro. In breve, tenere l'estremità libera del filo per il filo sotto la testa della vite, posizionare un saldatore caldo sul giunto wire-vite e sciogliere qualche saldatura per garantire che sufficiente saldatura senza intoppi nel giunto. I 2 fili con le viti servono come elettrodi di registrazione EEG, mentre i 2 fili senza viti fungono da elettrodi di registrazione EMG.
   3. Utilizzare forbici per togliere 1 mm dell'isolamento all'estremità degli elettrodi EMG per aumentare la qualità del segnale EMG.
   4. Coprire completamente tutti i perni saldati con adesivo epossidico, utilizzando un sottile bastone di legno o stuzzicadenti per ridurre il rumore elettrico durante le registrazioni di EEG / EMG.
2. Preparare un cavo per collegare l'elettrodo con l'anello di contatto come descritto di seguito. Questo cavo può essere riutilizzato.
   1. Saldare ogni pin di un connettore FFC / FPC a 4 pin con un filo di un cavo piatto da 30 cm. In breve, tenere l'estremità spelata del cavo al pin, inserire un saldatore caldosul giunto wire-pin, e sciogliere qualche saldatura per garantire che solo abbastanza solder intoppi nel giunto.
      Nota: scegliere la lunghezza del cavo piatto che è appropriato per l'altezza della gabbia animale sperimentale utilizzato per le registrazioni di EEG / EMG.
   2. Saldare crimpare socket per una punta dei fili sull'altra estremità del cavo piatto. In breve, tenere una presa crimpatura all'estremità libera spellata del cavo, inserire un saldatore sul giunto fili socket, e si fondono qualche saldatura per garantire che quel tanto che basta a saldare senza intoppi nel giunto.
   3. Inserire ogni aggraffatura presa in una posizione 4 crimpare abitazioni.
   4. Completamente coprire il socket con adesivo epossidico aggraffatura utilizzando un sottile bastone di legno o stuzzicadenti.

2. L'impianto di elettrodi in the Head Mouse (durata:. Circa 20 min)

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un cordone di sterilizzatore a caldo prima della chirurgia. Anestetizzare un topo maschio (10 - 20 settimane, 20 - 30 g)con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50 mg / kg). Dopo aver verificato che il mouse è profondamente anestetizzati pizzicando un dito del piede, radersi i capelli sulla testa e sul collo con un rasoio.
2. Muovi il mouse per il telaio stereotassico, e fissare la testa tra i 2 bar dell'orecchio. Applicare vaselina sugli occhi per prevenire la secchezza. Pulire la pelle rasata con l'alcol e tagliarlo lungo la linea mediana con un bisturi per esporre il cranio. Agganciare la pelle a mantenere l'area chirurgica a cielo aperto.
3. Utilizzando una fresa (dimensioni trapano: 0,8 mm di diametro), trapano 2 fori nel cranio, uno sopra l'area corticale frontale (1 mm anteriore al bregma, 1.5 mm lateralmente alla linea mediana) e l'altro sopra la zona parietale ( 1 millimetro anteriore al lambda 1,5 mm lateralmente alla linea mediana) dell'emisfero destro, secondo coordinate stereotassiche di Paxinos e Franklin. ²³
4. Utilizzando cacciavite una gioielleria, in acciaio inox posto viti di registrazione EEG nei fori e fare 2 - 2,5 giri per ogni schew per posizionamento epidurale sulla corteccia.
   Nota: Non inserire le viti troppo profonde per evitare di danneggiare il tessuto cerebrale. Verificare che le viti siano ben fissati sul cranio. Ciò è importante avere segnali EEG stabile durante un lungo periodo di registrazioni multiple (tipicamente, più di 1 mese). Viti Wiggly producono artefatti EEG e possono venire fuori prima della fine del programma sperimentale.
5. Fissare il gruppo elettrodi (vedi Sezione 1.1, perni rivolti verso l'alto) con colla istantanea al cranio e coprire con del cemento dentale. Fai bilateralmente piccoli fori con una pinza nei trapezio (collo) i muscoli e inserire i cavi di acciaio inossidabile che fungono da elettrodi EMG nei fori. Suturare la pelle con un filo di seta (diametro 0,1 mm) per evitare l'esposizione del muscolo.
6. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico. Somministrare ampicillina (100 mg / kg) e meloxicam (1 mg / kg) per via intraperitoneale al mouse per evitare l'infezione batterica e per ridurre il dolore post-operatorio, rispettivamente. Keep il mouse su un blocco di calore e controllare fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa il mouse individuale durante il recupero per evitare la rimozione di elettrodi da altri animali, e amministrare meloxicam (1 mg / kg) per via intraperitoneale il primo giorno dopo l'intervento chirurgico.

3. Registrazione e acquisizione EEG / EMG dati

1. Dopo un periodo di recupero di 1 settimana, casa ciascun topo individualmente in una gabbia sperimentale posto in una camera di registrazione insonorizzata. Mantenere una temperatura ambiente di 23 ± 1 ° C e automaticamente cicli di 12 ore di luce / 12 ore scuro controllare (luci accese alle 08:00, intensità di illuminazione ~ 100 lux).
2. Collegare il gruppo elettrodi EEG / EMG sulla testa del mouse di un cavo di registrazione. Assicurarsi che il cavo di registrazione è collegato ad un collettore (che è progettato in modo che i movimenti del mouse non sono limitati dalla torsione del cavo) e un amplificatore di segnale EEG / EMG. Filtro EEG / segnali EMG (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalizzare ad una frequenza di campionamento di 128 Hz da un convertitore analogico-digitale (A / D) e, infine, la registrazione su un computer con software di registrazione EEG / EMG ('Materiali' Tavolo, ⁴ ° ingresso dal basso).
3. Abituare il mouse per 2 - 3 giorni nella camera di registrazione. Se la registrazione EEG / EMG include amministrazioni droga intraperitoneali, gestire delicatamente il mouse su ogni giorno assuefazione al momento della somministrazione del farmaco.
4. Successivamente, avviare il software EEG / EMG registrazione ('Materiali' Tabella, ⁴ ° ingresso dal basso).
   1. Selezionare la scheda 'file di dati informazioni' e fare clic sulla casella accanto al nome del file. Immettere un nome file e fare clic su 'Salva'.
   2. Selezionare la scheda 'condizioni di registrazione' e selezionare tutti i canali EEG / EMG, che verranno registrate.
   3. Selezionare la frequenza di campionamento (128 Hz) nella scheda 'condizione di registrazione'.
   4. Controllare se i canali selezionati vengono visualizzati correttamente in thscheda e 'Canale informazioni'.
   5. Selezionare la scheda 'impostazione del timer' e cliccare su 'Monitor' per visualizzare EEG e EMG.
   6. Controllare se i segnali EEG / EMG vengono visualizzati correttamente.
   7. Selezionare la scheda 'impostazione del timer' e impostare l'ora per l'inizio e la fine della registrazione nell'area 'Timer principale'.
   8. Fare clic su 'Monitor' nella scheda 'impostazione del timer' per avviare la registrazione.
5. Registra segnali EEG / EMG sotto della linea di base (es., Il comportamento del sonno / veglia di un mouse liberamente comportarsi) e diverse condizioni di trattamento (ad es., Somministrazione di caffeina o trattamento simulato) per diversi giorni. Euthanize il mouse con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital (200 mg / kg) dopo l'ultimo giorno sperimentale.

4. Punteggio di Behavioral Stato Sulla base di EEG / EMG dati

1. Avviare il software per l'analisi EEG / EMG ('Materiali' Tavolo, ⁴ ° ingresso dal basso). Aprire i dati grezzi EEG / EMG (file .kcd) prodotte sotto il punto 3. Fare clic sulla scheda 'Sleep' e selezionare il tempo di Epoch. Selezionare 10 sec.
2. Fare clic sulla scheda 'Sleep' e selezionare 'Multi-screening' di segnare automaticamente tutte le epoche di 10 sec in 3 fasi (ad es., NREM e il sonno REM, e veglia), sulla base delle ampiezze di EEG e EMG e l'analisi spettrale di potenza dell'EEG. ³
3. Fare clic su 'condizioni FFT per EEG'.
4. Impostare i parametri per l'analisi spettrale di potenza [256 punti di riferimento (corrispondente a 2 secondi della EEG), funzione finestra Hanning, e la media di 5 per ogni epoca spettri]. ^{3 Fare clic su} 'OK'.
5. Fare clic su 'Start' di screening per iniziare la proiezione automatica. Aprire i dati ottenuti (file .raf).
6. Controllare i risultati dello screening automatico e, se necessario, correggere manualmente in base ai criteri standard (vedere Risultati rappresentativi Figura 1B, e Tabella 1 ). ^{2, 3} In breve, cliccare e tenere premuto il tasto sinistro del mouse su un'epoca in modo non corretto ha segnato e trascinare il cursore attraverso la stringa di epoche erroneamente segnato. Rilasciare il tasto sinistro del mouse e selezionare il corretto stato comportamentale nella finestra pop-up.
   Nota: Di tanto in tanto, epoche presso la transizione tra due stati vigili sono difficili da segnare in modo inequivocabile a uno Stato. In tali casi, l'epoca risposta deve essere allo stato apparente e gli stessi criteri dovrebbe essere applicata a epoche simili in tutto l'esperimento di garantire la riproducibilità dei dati.

Risultati

Figura 1B mostra come esempio un mouse EEG nei diversi stati di vigilanza. Come indicato nella tabella 1, sono classificati come epoche sonno REM se l'EEG mostra grandi, onde cerebrali lente con un ritmo delta è inferiore a 4 Hz e l'EMG ha solo un segnale debole o assente. Epoche sono classificati come sonno REM se l'EEG mostra onde cerebrali bassa tensione rapide nell'intervallo theta tra 6 e 10 Hz e l'EMG mostra ba...

Discussione

Questo protocollo descrive un set-up per le registrazioni di EEG / EMG che permette di valutare sonno e veglia sotto a basso rumore, condizioni di costo-efficaci e ad alto rendimento. A causa delle piccole dimensioni del gruppo testa elettrodi EEG / EMG, questo sistema può essere combinato con altri impianti per esperimenti intra-cerebrali, compresi optogenetics (fibra impiantazione ottico) o, in combinazione con simultanea cannula impiantazione, microinfusion di farmaci nel mouse cervello. ^{31 Inoltre,} il de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633