Einkapseln Cytochrome<em&gt; c</em&gt; In Silica Aerogel-Nanoarchitekturen ohne Metallnanopartikel unter Beibehaltung der Gasphase Bioaktivität

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt , wie Cytochrom c zu kapseln (cyt. C) in Kieselsäure (SiO ₂₎ Sol-Gele, Verfahren diese Gele bioaerogels zu bilden, und diese bioaerogels verwenden , um schnell Stickstoffmonoxid (NO) durch eine Gasphasenreaktion zu erkennen. Diese Art von Protokoll kann bei der zukünftigen Entwicklung von Biosensoren oder andere bioanalytische Geräte unterstützen.

Zusammenfassung

Anwendungen wie Sensoren, Batterien und Brennstoffzellen wurden durch die Verwendung von hochporösen Aerogelen verbessert, wenn funktionelle Verbindungen innerhalb der Aerogele eingekapselt sind. Jedoch nur wenige Berichte über Proteine ​​in Sol-Gelen einkapselt, die verarbeitet werden Aerogele zu bilden, existieren. Ein Verfahren zum Einkapseln von Cytochrom c (cyt. C) in Siliciumdioxid (SiO ₂₎ Sol-Gele , die überkritisch verarbeitet werden bioaerogels mit Gasphasenaktivität für Stickstoffmonoxid (NO) zu bilden , dargestellt. Cyt. C wird einem gemischten Kieselsol unter kontrollierten Proteinkonzentration zugegeben und Festigkeitsbedingungen puffern. Das Sol Mischung wird dann geliert und die Flüssigkeit in die Gelporen Füllen wird durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch mit flüssigem Kohlendioxid ersetzt. Das Kohlendioxid wird auf seinen kritischen Punkt gebracht und entlüftet trockenen Aerogele mit cyt zu bilden. C eingekapselt. Diese bioaerogels sind mit UV-VIS-Spektroskopie ein gekennzeichnetd Zirkulardichroismus-Spektroskopie und kann verwendet werden, um die Anwesenheit von Gasphasen Stickstoffmonoxid zu detektieren. Der Erfolg dieses Verfahrens beruht auf Regulieren des cyt. C die Konzentration und die Pufferkonzentration und erfordert keine andere Komponenten wie Metallnanoteilchen. Es kann möglich sein, andere Proteine ​​machen dieses Verfahren wichtig für die Entwicklung bioanalytische Geräte mögliche zukünftige Verwendung eines ähnlichen Ansatz zu verkapseln.

Einleitung

Cytochrom - c (Cyt. C) ist ein Schlüsselelektronentransferproteins in der Zellatmung Reaktionen des Körpers beteiligt. Es wurde in die Apoptose, eine kontrollierte Form des Zelltods, und es kann eine solche kleine detektieren toxische Moleküle wie Stickoxid und Kohlenmonoxid ^1-3 einbezogen werden gezeigt. Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Vorgänge im Nerven, Herz-Kreislauf nehmen, und das Immunsystem. Während cyt c . Typischerweise eine wässrige Umgebung auf einen pH-neutral gepufferte Werte erfordert strukturell intakt und aktiv bleiben, hat die Forschung , dass cyt gezeigt. C seine Struktur und Funktion in festen Materialien , bekannt als Aerogele unter bestimmten Bedingungen ^4-9 beibehalten kann.

Aerogele sind hochporöse Materialien oft gebildet durch Sol-Gel-Metalloxide Synthetisieren (Während Metalloxid Aerogele sind sehr häufig, Kohlenstoff und andere Arten von Aerogelen synthetisiert. Ein Beispiel hierfür ist InP aerogels) ¹⁰ und diese Sol-Gele derart Trocknen daß die poröse feste Matrix ^11-14 unverändert. Alle der Poren in fester Aerogele führen in viel Aerogele Bereich zur Verfügung zu Oberfläche äußerst nützlich für alle Anwendungen, bei denen Oberflächenreaktionen wichtig sind. Wenn chemische oder biochemische Funktionalität innerhalb des Aerogels Nanoarchitektur zusammengesetzt ist, wurde gezeigt, dass die physische Porosität und verbesserter Oberfläche der Aerogele Sensoren zu verbessern, sowie Elektroden zur Batterie, Brennstoffzelle und supercapacitor Anwendungen ^11,15-23 . Um Aerogele in einer Weise zu trocknen, dass die poröse feste Matrix unverändert lässt, ist es typisch, das Lösungsmittel, das in den Poren nach dem Sol-Gel-Synthese durch überkritische Lösungsmittelextraktion bleibt zu entfernen. Jede Pore collapse, die aus dem Gel als Lösungsmittel verdampft durch Oberflächenspannungskräfte verursacht werden, da in überkritischen Trocknen eine Flüssigkeit-Dampf-Grenzfläche nie Formen minimiert.

Es gibt viele Berichte von Häm Proteine ​​wie cyt. c in Sol-Gel eingekapselt ist , die gehalten wurden nass oder die getrocknet wurden bei Umgebungsbedingungen ^24-30. Berichte über Einkapseln Biomolekülen in Sol-Gele, die dann getrocknet werden kritisch Aerogele aufgrund der notwendigen Verarbeitung seltener sind zu bilden, die auf die Struktur vieler Proteine ​​nachteilig sein kann. Im Falle von cyt. C, bestimmte Bedingungen ermöglichen es , die Fähigkeit von cyt. C zu halten , um Gasphasen Stickstoffmonoxid innerhalb Aerogele zu erkennen und darauf zu reagieren. Einmal im Aerogel stabilisiert, die hochwertige Porenstruktur des Aerogels erleichtert die Reaktion zwischen cyt. C und Stickoxid - ^4,8,9. Cyt. C kann zunächst innerhalb Aerogele eingekapselt werden , indem sie in mehreren Schichten um Gold oder Silber - Nanopartikel in Lösung ^4-8 zuordnen. Diese mehrschichtige Aufbauten dienen dazu, das Protein in der Aerogel-Matrix zu schützen. In der jüngsten Approach , die wir entwickelt haben, wenn die Proteinkonzentration und Pufferstärke werden zusammen mit anderen Synthesebedingungen gesteuert, cyt. c behält Integrität innerhalb der Aerogele auch ohne Metallnanopartikel anfängliche Assoziation ^9.

Die Synthese beginnt wie viele Aerogel Synthesen beginnen mit Silica Sol-Gel-Vorstufen für einen bestimmten Zeitraum zu mischen. Es ist nach einer bestimmten Zeit das Mischen dass cyt. C als eine gepufferte Lösung in das Gemisch zugesetzt wird. Gelierung erfolgt dann eine poröse Kieselsäure feste Struktur zu bilden, in dem die Poren gefüllt sind, mit Wasser, Methanol, verbleibenden Reaktanden und Nebenprodukten. Diese Flüssigkeit, die die Poren füllt sich mit verschiedenen Lösungsmitteln ausgespült durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch werden kann, werden die letzten Austausch mit flüssigem Kohlendioxid innerhalb eines kritischen Punkt Trocknungsvorrichtung unter gehalten bei niedriger Temperatur. Bringen des Gels über der kritischen Temperatur (31,1 ° C) von Kohlendioxid erleichtert die Bildung alsupercritical Flüssigkeit im Inneren des unter Druck stehenden Vorrichtung, die entlüftet werden kann trocken, hochporöse Aerogele zu bilden. Die relativ niedrige Temperatur für Kohlendioxid benötigt, um ein überkritisches Fluid zu bilden, ist vorteilhaft im Vergleich zu anderen Lösemitteln, da es das Protein unterhalb einer Temperatur, bei der es hält denaturieren könnten.

Unsere Metallnanoteilchen freien Ansatz zur Verkapselung cyt. C in Aerogele ist vorteilhaft , da es ein einfaches Verfahren ist, die auch auf die Entwicklung eines allgemein anwendbares Protokoll zum Einkapseln anderer Proteine ​​führen kann. Viele Proteine ​​können nicht mit Metall - Nanopartikel in der gleichen Weise interagieren , die cyt. C hat und Metallnanopartikelsynthese oder Beschaffungs fügt zusätzliche Zeit und Kosten für das Verfahren. Die wenigen Berichte über Einkapseln Proteine ​​in Aerogele, um die Entwicklung dieses Verfahrens ein wichtiger Schritt nach vorne, eine allgemeinere Verfahren zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele zu finden, dass ich helfen kann,n potentielle zukünftige bioanalytische Geräte.

Das Protokoll Abschnitt dieses Manuskript beschreibt , wie Kieselsol-Gele zu synthetisieren, kapseln cyt. C in diese Sol-Gele, trocknen diese Komposit - Sol-Gel - Aerogele zu bilden, zeichnen diese bioaerogels mit UV-Vis und Circulardichroismus - Spektroskopie und die Anwesenheit erfassen von Gasphasen Stickoxid mit diesen bioaerogels. Cyt. C wurde in Aerogele erfolgreich eingekapselt wenn zuerst in 4,4-70 mM wässrige Lösungen von Phosphatpuffer gelöst. Jedoch optimierte Proteinstruktur in Aerogelen wurde , wenn 40 mM Phosphat - gepufferte Lösungen von cyt Verkapselung führt gefunden. C Herstellung loaded Aerogel cyt. C - Konzentrationen im Bereich von 5 bis 15 & mgr; M ^9. Daher angesichts der Protokoll ist unten Aerogele zu synthetisieren unter Verwendung von 40 mM Phosphat - gepufferte Lösungen von cyt. C in einer geladenen cyt resultiert. C - Konzentration in den Aerogelen von 15 uM.

Protokoll

Schutzbrille, Laborkittel und Laborhandschuhe sollten zu jeder Zeit während des Verfahrens zu tragen. Betreiben Sie den kritischen Punkt Trocknungsgerät ohne Schutzbrille. Alle Lösungen enthalten, Tetramethoxysilan, Methanol, Ethanol, Aceton und Ammoniak sollte innerhalb von einem Abzug verarbeitet werden.

1. Stellen Sie Buffer und Cyt. C - Lösungen

1. Zu machen ~ 750 ml pH 7, 40 mM Kaliumphosphatpuffer, bereiten ersten 500 ml von 0,04 M monobasisches Kaliumphosphat durch Auswiegen 2,72 g monobasisches Kaliumphosphat und Auflösen in Wasser unter Verwendung eines 500 ml-Meßkolben.
2. Bereiten Sie 500 ml von 0,04 M Kaliumhydrogenphosphat durch Auswiegen 3,48 g Kaliumhydrogenphosphat und Auflösen in Wasser unter Verwendung einer 500-ml-Messkolben.
3. Gießen Sie die zweibasige Salzlösung in einen großen Becher mit einem Rührstab und beginnen auf einer Rührplatte die Lösung gerührt wurde.
4. Langsam Teile des monobasischen Salz sÖSUNG zur Lösung dibasische Salz während der pH-Wert mit einer pH-Elektrode und Messgerät überwacht wurde, bis der pH-Wert 7,00 ist. Ungefähr 250-300 ml der monobasischen Salzlösung verwendet.
5. Man wiegt ca. 0.023 g cyt. C und in Glasszintillationsröhrchen. Hinzufügen 2.000 ul der vorbereiteten Kaliumphosphatpuffer mit einer Mikropipette und dann vorsichtig schwenken der Lösung , bis der gesamte Feststoff, rot cyt zu mischen. C wurde in der Lösung gelöst und keine Partikel bleibt.
6. Nehmen Sie 20 ul der hergestellten cyt. C Lösung und fügen Sie zu einem 1 cm Weglänge Plastikküvette. 3 ml vorbereitete Puffer.
7. Nehmen UV-Vis-Spektrum von 300 bis 700 nm-Puffer in der Referenzzelle. Verwenden Sie die cyt. C Absorption (A) bei 409 nm, der Extinktionskoeffizient ³¹ (ε) von 106.100 M ^-1 cm ^-1, die Küvette Weglänge (l) und das Beer-Lambert - Gesetz zur Bestimmung der Konzentration (c) der Lösung (A = εlc).
8. Zurück zu berechnen, die Konzentration der ursprünglichen hergestellten Lösung. Die 2 ml hergestellt cyt. C Lösung liegt typischerweise zwischen 0,7 bis 0,9 mM Konzentration.
9. Verdünnen Sie das Original vorbereitet cyt. C Lösung zu 800 & mgr; l von 0,105 mM durch Pipettieren 117 ul von 0,72 mM hergestellt cyt. C Lösung in ein Szintillationsphiole. Dann fügen Sie das Gleichgewicht der 800 & mgr; l (683 & mgr; l in diesem Fall) vorbereiteter Puffer. Swirl zu mischen. Die genauen Mengen variieren abhängig von der genauen Konzentration des ursprünglichen hergestellt cyt. C Lösung wie das Volumen des cyt. C zu pipettieren als (800 & mgr; l * 0,105 mM) berechnet wird / (original cyt. C - Konzentration in mM).
10. Bewahren Original vorbereitet und verdünnt cyt. C Lösungen bei 2-8 ° C im Kühlschrank , bis sie bereit für bis zu zwei Wochen zu verwenden.

2. Synthesize Silica (SiO ₂₎ Sol

1. Beschriften Sie eine Einweg 50 ml Polypropylen-Becher "Beaker A '. Becherglas auf der Pfanne von einer Analysenwaage und mit einem Glas Pasteur Pipette 1,88 g Tetramethoxysilan in den Becher hinzuzufügen. Null das Gleichgewicht und dann 2,88 g Methanol in 'Beaker A' Pipette.
2. Cover 'Beaker A' mit Parafilm.
3. Beschriften Sie eine Einweg 50 ml Polypropylen-Becher "Becher B '. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab und auf den Topf mit einer Analysenwaage. Verwenden Sie eine Glaspipette 0,75 g Wasser und 3,00 g Methanol hinzuzufügen.
4. Cover 'Beaker B' mit Parafilm.
5. Beginnen Sie den Inhalt des 'Beaker B' Rühren auf einer Rührplatte in einem Dunstabzug, dann eine Spritze verwendet werden 5 ul 28,0-30,0% Ammoniumhydroxidlösung durch die Parafilm in die Mischung bedecken einzufügen unter Rühren.
6. Sobald Schritt 2.5 abgeschlossen ist, den Inhalt des 'Beaker A' bis 'Beaker B' hinzuzufügen. Rühre das Gemisch 20 min, während in Parafilm bedeckt.

3. Bereiten Sie Gel-Formen

Hinweis:die Gel-Formen, während das Kieselsol Mischung rührt in Schritt 2.6 ist Zeit zur Vorbereitung.

1. Erwerben 8-9 Polypropylen Szintillationsgefäße (16 mm x 57 mm, Volumengröße 6,5 ml, mit Böden in Scheiben geschnitten aus) und den entsprechenden Kappen. Setzen Sie Plastikfolie über die Kappe Ende des Fläschchens eine ebene Fläche zu schaffen, um das Gel auf zu bilden, und legen Sie die Kappe über sie dafür sorgen, dass die Plastikfolie in der Kappe intakt bleibt.
2. Richten Sie die Fläschchen mit Kappe-Ende nach unten auf die Tischplatte und öffnete Böden nach oben zeigt.

4. Bereiten Sie Cyt. C -silica Sol-Gele

1. Nach Beendigung des Sol Mischen (Schritt 2.6), 3 ml der Sol-Mischung zu einem sauberen Einweg 50 ml Polypropylen-Becher.
2. Verwenden Pipette ein Glas Pasteur langsam 500 ul der 0,105 mM verdünnt cyt fallen. C - Lösung (hergestellt in Schritt 1.9) in die 3 ml Sol - Mischung im Verlauf von ca. 1 min. Achten Sie darauf , um die Mischung zu leicht schwenken , während die cyt Zugabe. C Bildung von großen zu vermeidenroten Klumpen. Unter der Annahme , die Volumina additiv sind, um 500 ul des 0,105 mM cyt verdünnt. Lösung C bis 3.500 & mgr; l, die cyt. C Konzentration nun in das Sol ist, in der Theorie, 15 uM.
3. Pipette 0,5 ml der resultierenden cyt. C Kieselsol in jedes vorbereitete Form. Auch pipettieren 0,5 ml verbleibenden 'schlicht' Kieselsol in ein oder zwei Formen als Kontrollproben während der überkritischen Trocknungsprozess zu verwenden.
4. Decken Sie die nach oben gerichtete Öffnungen der Formen mit Parafilm und stellen im Kühlschrank (~ 2-8 ° C) über Nacht oder für mindestens 12 Stunden Sol-Gele herzustellen.
5. Nehmen Sie die Formen aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie die Parafilm von der Spitze einer Form , die eine cyt enthält , c Sol-Gel. entfernen auch die Kappe und Plastikfolie von der Unterseite.
6. etwas Ethanol aus einer Waschflasche in die Form, verwenden Sie die kreisförmige Scheibe Ende eines Spritzenkolben vorsichtig das Gel schieben aus der Form und in einen sauberen 20 ml Glasszintillationsröhrchen cont Nach der Zugabe vonaining etwa 5 ml Ethanol gegeben.
7. Wiederholen dieses Gel Entfernungsprozedur (Schritte 4.5 und 4.6) , bis alle der cyt. C Gele werden in das Fläschchen gegeben und alle der Kieselgele werden in einen separaten Glasfläschchen hinzugefügt. Wenn mehr als eine Konzentration von cyt. C Gel gemacht worden ist , sicher sein , wie Gele zu speichern zusammen in separaten Fläschchen. Dann füllen Sie die Fläschchen an die Spitze mit Ethanol, Kappe und Lagerung zwischen 2-8 ° C.
8. Alle vier Stunden im Laufe des Tages, entfernen Sie die Gele aus dem Kühlschrank, dekantiert die Ethanol aus den Gelen und ersetzen mit frischem Ethanol.
9. Während weitere drei Tage unterzutauchen die nassen Sol-Gele in Aceton, Umfüllen und Zugabe von frischem Aceton dreimal täglich.

5. kritisch Dry Cyt. C -silica Sol-Gele

1. Kühlen Sie einen kritischen Punkt Trocknungsgerät (siehe Abbildung 1) bis 10 ° C , indem die Temperatur eines angeschlossenen Zirkulator auf 8 ° C einstellen.
2. Sobald die Vorrichtung reached 10 ° C, führen eine Dichtigkeitsprüfung auf das Gerät durch ein Transfer Boot mit Aceton Füllen und es im Inneren der Vorrichtung abdichtet.
   1. Öffnen Sie das Füllventil des Gerätes und fügen Kohlendioxid, bis das Gerät halb voll ist.
   2. Schließen Sie das Füllventil und hören Sie aufmerksam zu an den Türen zischend und Ventile, wo O-Ringe oder Dichtungen werden verschlechtert werden.
   3. Ersetzen Sie alle O-Ringe oder Dichtungen, wenn ein Leck gefunden wird.
3. Nach der Dichtigkeitsprüfung, öffnen Sie das Ablassventil das Aceton und Kohlendioxid in den Abfluss von einer Abzugshaube zu lösen. Entfernen Sie dann aus dem Gerät die Übertragung Boot.
4. Nachdem er sich vergewissert, dass die Vorrichtung leckfrei ist, gießen Sie sorgfältig die nassen Gele aus den Szintillationsgefäße, zusammen mit den meisten der Aceton, in den drei der Transfer Boot lange Abschnitte (Probenkörbe oder Gaze Abdeckungen sind nicht erforderlich). Zart schieben und die Gele im Boot mit einer Pinzette zu bewegen, um sicherzustellen, dass alle Gele i vollständig untergetaucht werdenn Aceton. Fügen Sie mehr Aceton benötigt, wenn vor dem Boot innerhalb des Gerätes abgedichtet wird.
5. Öffnen des Füllventils der Vorrichtung zu Kohlendioxid hinzu, dann öffnet das Ablassventil freizugeben Aceton für 5 Minuten, sobald das Aceton mit dem Kohlendioxid Mischens beobachtet werden Sinken auf den Boden der Vorrichtung durch die Vorrichtung Fenster. Diese kriechende des Acetons auf den Boden auftritt, bevor die Vorrichtung vollständig mit Kohlendioxid gefüllt ist, so sollte das Füllventil in dem Maße während der Entleerung notwendig offen bleiben, so dass die Vorrichtung selbst zu füllen, wird fortgesetzt, während die Drain geöffnet ist.
6. Das Ablassventil schließen. Halten Sie das Füllventil geknackt leicht geöffnet.
7. Fünf Minuten später, öffnen Sie das Ablassventil für fünf Minuten wieder und stellen Sie das Füllventil genug geöffnet werden, so dass das Gerät während des gesamten Entleerungszeit voll bleibt. Das Ablassventil schließen, halten Sie das Füllventil offen gebrochen, dann wiederholen Sie diese Trockenlegung Schritt noch einmal fünfMinuten später.
8. Nach diesen ersten drei Entwässerungsschritte, öffnen Sie den Ablauf für 5 Minuten in einer Zeit, etwa alle 40 min über den Zeitraum von mindestens sechs Stunden vollständigen Ersatz von Aceton in den Gelen durch flüssiges Kohlendioxid zu gewährleisten. Bei Einstellung des Füllventil offen genug bei jeder Entleerung zu sein, so dass der Flüssigkeitspegel in dem Gerät nie unter der Spitze des Bootes fällt beim Entleeren.
9. Sobald Trockenlegung Schritte abgeschlossen sind, schließen Sie das Füllventil, und lassen Sie das flüssige Kohlendioxid, so dass das Niveau knapp oberhalb der Zinken auf dem Boot, indem Sie durch das Gerät Fenster sichtbar bleibt.
10. Stellen Sie die Temperatur der Vorrichtung angebracht Zirkulator bis 40 ° C , um sicherzustellen , dass das flüssige Kohlendioxid steigt oberhalb seiner kritischen Temperatur und Druck (T _c = 31 ° C; P _c = 7,4 MPa).
11. Nach ca. 15 min, beobachten den Übergang vom flüssigen in den überkritischen Fluid durch die Vorrichtung Fenster als Flüssigkeit meniscuns über den Zinken des Bootes verschwindet. Sie müssen mindestens 15 min Equilibrierungszeit, dann öffnen Sie das Entlüftungsventil eine kleine Menge zu beginnen, um die überkritische Flüssigkeit zu lösen.
12. Im Laufe von etwa 45 min, weiter inkremental das Entlüftungsventil zu öffnen, immer breiter, so daß eine stetige, aber sehr geringe Rauschen des Lösens Fluid gehört werden kann und das Manometer beobachtet wird langsam auf Null zu verringern.
13. Nachdem der Druck des Gerätes auf Null gegangen ist, öffnen Sie das Gerät Tür, entfernen Sie das Boot, und Zange verwenden, um die neu getrocknete Aerogele in saubere Glas Szintillationsgefäße zu platzieren.

6. Charakterisieren Cyt. C -silica Aerogele mit UV-Vis und Circulardichroismus (CD) -Spektroskopie

1. Bereiten Sie einen Karton Plattform, um die Aerogelmonolithen in den Strahlengang des UV-VIS Spektrophotometer oder CD-Spektrometer zu halten.
   1. Schneiden Sie ein 2,5 cm x 2,5 cm großes Stück aus leichtem Karton (wie Karton aus einer Schachtel Labobor Gewebe), falten Sie es in der Hälfte, schneiden auf halber Höhe auf der Falte, dann falten Sie die beiden Klappen, geschaffen durch Schneiden, zurück.
   2. Schneiden Sie ein 5 cm x 5 cm großes Stück aus leichtem Karton, mit einem 1,5 cm x 1,5 cm großen quadratischen Loch in der Mitte. Dann mit schwarzem Isolierband um die Größe des Halte auf 0,5 cm x 0,5 cm zu vermindern.
   3. Kleben Sie die Klappen des gefalteten und geschnittenen Pappe gegen die 5 cm x 5 cm großes Stück Pappe , so dass eine kleine gebogene Oberfläche ist für einen Aerogel Monolith geschaffen zu sitzen direkt vor dem 0,5 cm x 0,5 cm Loch (siehe Abbildung 2) . Dann kleben Sie das hintere Stück Pappe auf die UV-VIS-Spektrophotometer so das Loch im Einklang mit dem Strahlengang ist.
2. Die Dicke der Gele, die für die Pfadlängen verwendet werden, mit einem Mikrometer.
3. Legen Sie ein Gel auf der Karton-Plattform und messen ein Spektrum von 300 bis 800 nm mit Luft im Referenzraum des UV-VIS-Spektrophotometer.
4. Setzen Sie ein Polynom, A = a λ ^n, auf die Wellenlänge (λ) Bereich , in dem die Absorption (A) vor allem auf Hintergrundstreuung zurückzuführen ist, ~ 700-800 nm. Der Koeffizient a ist typischerweise fit auf eine Zahl zwischen ca. 1 x 10 ⁸ und 1 x 10 ⁶ und der n - Koeffizient ist typischerweise fit auf eine Zahl zwischen ~ 2 und 3.
5. Berechnen Sie die Streuung bei anderen Wellenlängen, mit dem Koeffizienten, a und n, von der Passform erhalten.
6. Subtrahieren diese berechneten Streuhintergrundabsorption aus dem Rohspektrum ein Streu korrigierte Spektrum zu erhalten.
7. Den scatter subtrahierten Spektrum mit einer Gauß-Kurve im Bereich von 370 bis 490 nm unter Verwendung geeigneter Software (GRAMM / AI 8,0), die Peakhöhe, Peakzentrum, und die Spitzenbreite der Soret-Bande des Aerogels zu bestimmen.
8. Wenden Sie das Bier-Lambert Gesetz der gemessenen Dicke des Gels unter Verwendung von für die Pfadlänge (l), dem Extinktionskoeffizienten ³¹ (ε) von 106.100 M ^-1 cm ^-1 und die Soret Peakhöhe (A) die Konzentration (c) von cyt. c in dem Aerogel (A = εlc) zu berechnen.
9. Vergleichen Sie die berechneten cyt. C zur Konzentration theoretisch in dem Gel (15 & mgr; M) , um die Lebensfähigkeit von cyt zu ermitteln. C innerhalb des Aerogel. Typische Prozent Lebensfähigkeit sind nahezu 100%, aber es sollte angemerkt werden , dass diese Lebensfähigkeiten sind Schätzungen , nur weil die Berechnung auf der Extinktionskoeffizient von cyt. C in Lösung beruht ³¹ , die etwas anders ist als der Extinktionskoeffizient von cyt werden vermutet. c in den Aerogelen , die nicht bekannt ist.
10. Führen Sie Stickstoff in das CD-Gerät mindestens 5 Minuten vor dem Einschalten der Lampe.
11. Kleben Sie die Kartonhalter auf dem CD-Spektrometer so das Loch im Einklang mit dem Strahlengang ist.
12. Messen Sie einen kontinuierlichen Wellenlängenspektrum leer mit nichts in der Kartonhalter 350-500 nm bei 100 nm / min, im Durchschnitt drei Scans nehmen.
13. Legen Sie ein Gel (Dicke gemessen zuvor in Schritt 6.2) auf dem Karton-Plattform und messen ein Spektrum von 350 bis 500 nm bei 100 nm / min, im Durchschnitt drei Scans nehmen.
14. Wiederholen Sie die UV-Vis und CD-Messungen für alle Aerogelmonolithen von Interesse.

7. Erkennen Anwesenheit von Stickstoffmonoxid (NO) Gas mit Cyt. C -silica Aerogels

VORSICHT: Arbeiten mit NO ist gefährlich und alle NO-Gas sollte in einem Abzug oder erschöpft in einem Abzug gehandhabt werden. Anhaltende Einwirkung von NO ist toxisch an Gewebe als hochgiftige Stickstoffdioxid und / oder Distickstofftetroxid bilden wird, wenn NO in Kontakt mit Luft kommt. Hitze und ätzende Dämpfe werden auch erzeugt, wenn NO mit Wasser in Berührung kommt.

1. Legen Sie eine 8 L Stickoxid Zylinder (10% Stickstoffmonoxid, 90% Stickstoff) in einem gut belüfteten Abzugshaube und stellen Sie den Druck auf 4 bar.
2. Die Leitungen sowohl für die Stickoxid-Zylinder und zu einem Stickstoffzylinder (Druck auf 6 psi) und verbinden die Enden des Rohres mit einem T-Ventil (siehe Abbildung 3a).
3. Wählen Sie ein Aerogel Monolith für das Experiment und Messung der Dicke (oder Pfadlänge) mit einem Mikrometer.
4. Legen Sie das Aerogel (~ 3 mm dick) in einem Einweg-Küvetten mit Kunststoffkappe und setzen Sie die Küvette in das Spektralphotometer. Schneiden Sie das Aerogel leicht bei Bedarf in der Küvette zu passen.
5. Legen Sie zwei Spritzennadeln in die Kunststoffkappe der Küvette, ein mit dem Ausgang des T-Ventil verbunden ist , und ein mit einem Rohr verbunden als Abgas in den Abzug zu dienen (Abbildung 3b sehen). Verwenden Parafilm die Nadeln auf den Schlauch und die Kappe in die Küvette zu versiegeln.
6. Stellen Sie eine leere Einwegküvette in der Referenzzelle.
7. Stellen Sie die Aerogel-Küvettenposition um sicherzustellen, dass das Aerogel in dem Strahlengang liegt, bevor das Experiment zu starten.
8. Nehmen Sie ein anfängliches Spektrum von 800 bis 300 nm.
9. Überwachen der Differenz zwischen der Extinktion bei 414 nm und die Extinktion bei 408 nm, während Drehen des T-Ventils zwischen Stickstoff und Stickoxid / Stickstoff-Gemisch in festgelegten Zeitintervallen sicherstellen zu schalten, dass die Strömungsgeschwindigkeit des Stickstoff oder Stickoxid / Stickstoff-Gemisch so hoch zu keiner Zeit ist, dass das Aerogel bewegt sich in der Küvette um.
10. Nehmen Sie ein endgültiges Spektrum von 800 bis 300 nm, wenn die Belichtungszyklen fertig sind.
11. Wiederholen Sie den Vorgang mit drei vor vier Monolithen eine durchschnittliche Sensorantwort zu erhalten.

Ergebnisse

Die beschriebenen Verfahren führt zu Aerogelen , die lebensfähige cyt. C. Wie am Ende der Einleitung angegeben, cyt. C kann aus wässrigen Pufferlösungen eingekapselt werden , die 4,4 bis 70 mM Phosphat liegen. Beispiele für cyt. C -silica (cyt. C -SiO ₂₎ Aerogele aus Lösungen mit verschiedenen Pufferkonzentrationen hergestellt sind in Abbildung 4 dargestellt. Alle Gele relativ durchscheinend sind, mit den von 70 aus Gelen mM die opakste puffern.

Ein Vergleich der Spektroskopie von cyt. C unter verschiedenen Bedingungen ist in 5 dargestellt. Ein typisches Spektrum (Figur 5c) zeigt die große Soret Peak um 408 nm für cyt. C -SiO ₂ Aerogele und ist sehr ähnlich dem Spektrum von cyt . c in Lösung (Figur 5a). Zusätzlich wird ein Spektrum von cyt.c innerhalb Aerogele mit Metall - Nanopartikeln verkapselt ist auch (5b) und die cyt gezeigt. c -SiO ₂ Aerogel Spektrum ist ähnlich wie auch in diesem Spektrum. Wenn die cyt. C -SiO ₂ Aerogel zu Stickstoffmonoxid freigelegt ist, wird eine typische Verschiebung der Soret-Bande beobachtet (Figur 5d).

Die UV-Vis - Spektren von cyt gemacht Gele. C - Lösungen in verschiedenen Pufferkonzentrationen sind in 6 gezeigt. Alle diese Gele zeigen charakteristische UV-Vis - spektroskopischen Eigenschaften darauf hinweist , dass cyt. C ist nicht in einem denaturierten Zustand in den Gelen. Jedoch kann die verminderte Durchsichtigkeit der Gele aus 70 mM Puffer führt zu einem niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis für diesen Spektren vorgenommen.

Die CD - Spektren von cyt. C -SiO ₂ Aerogele sind ähnlich den Spektren von cyt c . innerhalb Aerogele mit Metall - Nanoteilchen eingekapselt, während beide Arten von Aerogel - Spektren aus einem Spektrum von cyt unterscheiden. c in gepufferter Lösung (Abbildung 7).

Figur 8 zeigt eine typische Stickoxid Überwachungsantwort für cyt. C -SiO ₂ Aerogele und entsprechenden Aerogele , die auch Metallnanoteilchen neben cyt. C enthalten. Der Unterschied zwischen der Absorption bei 414 nm und bei 408 nm gesehen wird erhöht und dann verringert wird, wenn die Gele zu Stickstoffmonoxid freigelegt sind und dann Stickstoff jeweils nacheinander.

Wenn das überkritische Kohlendioxid nicht bei einer langsam genug Geschwindigkeit freigesetzt wird, die Lebensfähigkeit des cyt. C innerhalb der gebildeten Aerogele beeinträchtigt. Dies wird durch den Vergleich resultierenden UV-sichtbaren Spektren ergab nach Gelen durch Freisetzung des Kohlendioxids bei verschiedenen FormungsRaten (Abbildung 9).

Abbildung 1: Kritischer Punkt Trocknungsvorrichtung kritischen Apparat Punkt - Trocknung von dem (A) vorne und (B) zurück mit der Transferboot und eine Vorrichtung Tür an der Rückseite des Geräts gezeigt unten gezeigt..

Abbildung 2: Karton - Plattform Die zusammengesetzte Karton Plattform ein Aerogel auf dem Weg eines Instruments des Strahls zu halten..

Abbildung 3: Stickstoffmonoxid Sensoraufbau Der Stickoxid - Messaufbau gezeigt einschließlich (A) dem Abzug von 10% Stickoxid eingeschlossen.90% Stickstoffzylinder, Schläuche und T-Ventil ist , und (B) die Küvette mit eingesetzten Nadeln.

Abbildung 4:.. Beispiel cyt c -SiO ₂ Aerogele Aerogele Einkapselung 15 uM cyt c in 4,4 mM, 40 mM und 70 mM Kaliumphosphat - Puffer sind im Vergleich zu einem Cent gezeigt von links nach rechts.. Diese Aerogele sind ca. 0,2-0,5 cm hoch. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Abb . 5: Cyt c -SiO ₂ Aerogel - Spektroskopie Sichtbare Spektren von 15 uM Cytochrom c in (a) 50 mM Phosphatpuffer Sols.ution; (B) Au _{(5 nm)} ~ cyt c -SiO ₂ Aerogel. (C) cyt c -SiO ₂ Aerogel (Luft ausgesetzt). (D) cyt. C -SiO ₂ Aerogel (ausgesetzt zu Stickstoffmonoxid für 3,5 min). Diese repräsentativen Spektren von jeder Art von Gel sind der Übersichtlichkeit halber Offset, und die gestrichelte Linie zeigt die Position der Soret-Bande des cyt. C in Puffer. Während jedes Spektrum von 15 uM cyt ist. C sind die Gelstärken (oder Höhen) nur 0,2-0,5-cm im Vergleich zu der 1-cm - Lösung Küvette in einer höheren Lösungs Extinktion ergibt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Abbildung 6: Aerogel - Spektroskopie als gekapselte Pufferkonzentration variiert Gemittelt UV-sichtbaren Spektralbereich Absorption von Aerogelen durch Gel - Weglänge für Gele geteilt Einkapselung 15 _.6; M cyt c in 70 mM (schwarz) (durchschnittlich 4 Spektren), 40 mM (rot, gepunktet) (durchschnittlich 8 Spektren) und 4,4 mM (grün gestrichelt) (durchschnittlich 9 Spektren) Kaliumphosphatpuffer. . Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Abbildung 7:... Aerogel Zirkulardichroismus - Spektroskopie Circulardichroismus - Spektren von cyt c in Natriumphosphat - gepufferten Lösung (fest), zwei repräsentative Spektren von cyt c -SiO ₂ Aerogele (gestrichelt) und zwei repräsentative Spektren von Au _{(5 nm)} ~ cyt. c SiO- ₂ Aerogele (gestrichelt). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Abbildung 8: Stickoxid - Detektion mit cyt c -SiO _2. . sub> Aerogele Überwachung der Verschiebung (& Delta; A = A _{414 nm} - A _{408 nm).} in der Soret Intensität des cyt c (fest rot) und Au ~ cyt c (gestrichelte blaue) eingekapselt in SiO ₂ Composite - Aerogel - Nanoarchitekturen als Gasstrom. umgeschaltet wird (ist wo Soret Peak-Maximum bei ~ 408 nm) zwischen Stickstoff und Stickstoffmonoxid (wo Soret Maximum bei ~ 414 nm-Spitze ist). Jede Kurve ist ein Mittelwert von 3-4 Versuchen mit zwei der cyt c -SiO ₂ Versuche bei & Delta; A = A überwacht _{414 nm} . - Ein _{407 nm} , da die anfängliche Soret Peak - Maximum bei 407 nm für diese Versuche war. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Abbildung 9:. Wirkung der überkritischen Fluid Release - Zeit Gemittelt UV-sichtbaren Spektralbereich Absorption durch Gel - Weglänge für cyt geteilt c -SiO ₂ Aerogele enca.psulating 10 uM cyt. c in 50 mM Phosphatpuffer , in dem die überkritisch getrockneten Aerogelen entweder durch Lösen kritischem Kohlendioxid über 45 min wurden (Feststoff, schwarz (durchschnittlich 9 Spektren)) oder 7 min (gestrichelte, rot (durchschnittlich 4 Spektren)). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung ^9.

Diskussion

Wie beschrieben, hat diese Vorgehensweise konsequent tragfähige cyt hergestellt. C innerhalb Aerogele eingekapselt. Die Konzentration des cyt. C innerhalb der Aerogele können , können 4,4 bis 70 mM Phosphat ohne schwere nachteilige Wirkungen auf die Protein Lebensfähigkeit variiert werden innerhalb der Aerogele eingekapselt 5 bis 15 um , und die Pufferkonzentration des anfänglichen cyt. C Lösung variiert werden. Doch die Spitzenmitte und Peakbreite des charakteristischen cyt. C Soret-Bande in Aerogele am nächsten sind , was sie sind für cyt. C in Lösung , wenn cyt. C in Aerogele aus Lösungen von 40 mM Puffer ⁹ eingekapselt ist.

Die Synthese des cyt. C -SiO ₂ Aerogele wird im Alter von einigen der Ausgangsreagenzien beeinflusst. Methanol, Tetramethoxysilan und Ammoniumhydroxidlösung sind hygroskopisch und sollte alle ein bis zwei Monate ausgetauscht werden. Die erhöhte Wasser, das nach oben baut indiese Reagenzien im Laufe der Zeit wirkt sich auf die Gel-strukturelle Merkmale und die Sol-zu-Gel-Übergangszeit.

Wenn überkritische Trocknung durchgeführt wird, die kritischen Transfer Bootes Punkt Trocknungsvorrichtung kann dick, 1 cm Durchmesser Gele bis achtzehn 0,5 cm halten. Wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, sollte eine bestimmte Füll- und Entleerungs verfahren werden, um Kohlendioxid in die Sol-Gel zu übertragen. Es ist wichtig, dass zu Beginn der Ablaufprotokoll zu beachten, das Entwässern Mischung von Kohlendioxid und Aceton fließt bei einer so hohen Geschwindigkeit, die das Ablaßrohr steif friert mit Feuchtigkeit auf der Außenseite zu Eis kondensiert. Die Mischung Ablassen aus etwas Wasser enthält, da das Aceton nicht wasserfrei ist und dieses Wasser kann gefrieren gelegentlich in einem Ausmaß, dass das Ablaufrohr tatsächlich verstopft. Es ist notwendig, für solche Verstopfungen zu beobachten und zu einem Stillstand der Strömung hört. Das Ablassventil sollte für ein paar Minuten geschlossen werden, so dass die Clog schmilzt, wenn eine Verstopfung erkannt wird. Imim schlimmsten Fall, wenn das Ablassventil nicht geschlossen ist, kann eine Verstopfung so viel Druck bewirken, dass der Ablaufschlauch knallt weg gewaltsam den Apparat aufzubauen, dass. Nach den ersten paar Ablaufzeiten wird sich die Mehrheit der Aceton wurde aus der Apparatur gespült, und das Auftreten von nassen Eisbrocken dramatisch sinken. Die Entladung wird ähnlich progressiv Trockeneis als die Trockenlegung Protokoll mit restlichem Nachweis von Aceton Gegenwart (wie Duft) immer nicht nachweisbar durch das Ende des Trockenlegung Prozess wird fortgesetzt.

Nachdem das Kohlendioxid in der Vorrichtung von der Flüssigkeit auf überkritische Fluid und der Entlüftungsvorgang begonnen hat , übergegangen ist, ist es notwendig , mindestens 45 min die Flüssigkeit freizugeben , mit einer langsamen Geschwindigkeit über als ⁹ in dem Verfahren angegeben. Eine höhere Geschwindigkeit der Freisetzung kann die Lebensfähigkeit von cyt verringern. C innerhalb der Aerogele und die Aerogele selbst brechen tatsächlich (wie in Abbildung 9 gezeigt) auseinander , wie the Fluid strömt aus den Gelen zu entkommen. In der Regel, auch wenn die Aerogele intakt bleiben, nachdem das Gerät Tür zu öffnen, ist es wichtig, sie sorgfältig und schonend zu behandeln, da sie spröde sind und leicht brechen kann.

Die Steuer Kieselgele die neben dem cyt gegossen werden. C -SiO ₂ Gele werden nach dem überkritischen Trocknung verwendet , um festzustellen , ob der Kohlendioxidübertragung in den Gelen erfolgreich war. Manchmal ist die cyt. C -SiO ₂ Gele können trüb erscheinen und es ist wichtig , zu bestimmen , ob dies zu einer unvollständigen Lösungsmittel Übertragung zurückzuführen ist oder ob es kann mit der Konzentration des cyt. C zu tun , oder innerhalb der Gele eingekapselt Puffer. Wenn die Kieselgele ohne cyt. C erscheinen eine homogene, durchscheinendes Aussehen im ganzen zu haben, kann dies als Beweis dafür genommen werden , dass das Lösungsmittel Transfer vollständig , selbst wenn die cyt aufgetreten. C -SiO ₂ Gele haben eine gewisse Trübung zu ihnen. Trübungen innerhalb der Kieselgeleohne cyt. c nach dem Trocknen zeigt an, dass einige Aceton innerhalb der Gele während des Entlüftungs blieb.

Wie in dem Protokollabschnitt angegeben ist, müssen wichtige Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden, wenn mit Stickstoffmonoxid (NO) zu arbeiten. Zur Erkennung von NO die Aerogele verwendet wird, ist es notwendig, die Küvette sehr gut zu verschließen und das Gas fließt über die Aerogele in einer Abzugshaube zu erschöpfen. Alternativ kann das ganze Spektrophotometer in einer Abzugshaube Einwirkung NO-Gas zu begrenzen, zusammen mit dem NO-Gaszylinder als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme bewegt werden. Bei Kontakt sofort mit Luft NO, um den hochgiftigen Stickstoffdioxid, Distickstofftetroxid oder beides erzeugen. NO kann auch mit Wasser reagieren auf Hitze und korrosive Dämpfe abgeben. Daher aufrechterhalten Exposition NO kann zu direkten Gewebetoxizität.

Wenn die cyt verwenden. C -SiO ₂ Aerogele die Anwesenheit von Stickstoffmonoxid zu erfassen, werden die Soret - Bande wird zunächst bei ~ 408 nm und verschiebt sichauf ~ 414 nm in Gegenwart von Stickstoffmonoxid. Nach dem Einschalten wieder zu Stickstoff sollte die Soret-Bande umkehren wieder bei ~ 408 nm zentriert ist. Es kann auch möglich sein , den cyt zu verwenden. C -SiO ₂ Aerogele ²⁷ das Vorhandensein von anderen Liganden, wie Kohlenmonoxid zu detektieren.

Verschiedene veröffentlichten Verfahren umfassen einen zusätzlichen Schritt zum Kombinieren Gold oder Silber - Nanopartikel mit cyt. C in Lösung , bevor sie mit dem Sol Mischen und kritischer Trocknung von Aerogelen zu bilden ^4-8. Vergleich des UV-VIS - Spektroskopie von cyt. C eingekapselt in Aerogele mit Metall - Nanoteilchen zu der cyt. C in Aerogelen ohne Metallnanoteilchen eingekapselt zeigt , dass diese beiden Typen von Einkapselungsverfahren erzeugen cyt. C ähnlicher Lebensfähigkeit innerhalb der Aerogele (Figur 5) . Doch die cyt. C mit Metall - Nanopartikeln verkapselt ist etwas stabiler als cyt. C kapselnd ohne Metall - Nanopartikel innerhalb der Aerogele ^9. Die CD - Spektren der beiden Arten von cyt. C Aerogele sind ebenfalls ähnlich, obwohl beide aus dem Spektrum des cyt unterscheiden. C in Puffer gewissen Entfaltung cyt. C innerhalb der Aerogele (Abbildung 7) anzeigt. Frühere Berichte über cyt. C in Aerogele eingekapselt legen nahe , dass der Zirkulardichroismus - Spektroskopie ist wahrscheinlich die äußerste Schicht der Protein Beurteilung, ungefaltet bei Kontakt mit dem Silicagel, entweder innerhalb Metallnanoteilchen nukleierten mehrlagigen cyt. C Strukturen oder lose Strukturen organisiert, bilden wenn keine Metall - Nanopartikel sind in Aerogele ^4,9. Der Großteil des cyt. C innerhalb jeder Art von selbstorganisierten Aufbau innerhalb der Aerogele bleibt durch die UV-Vis - Spektroskopie , obwohl gemessen gefaltet. Der Vorteil des beschriebenen Protokolls hier sans Nanopartikel ist, dass teure Anschaffung oder zeitaufwändige Synthese von MetallNanopartikel ist nicht erforderlich. Proteine ​​sind oft nicht erfolgreich innerhalb Aerogele gekapselt und so dieses Verfahren ist wichtig, daß es zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele mit potentiellen Bedeutung für zukünftige bioanalytische Geräte zur Entwicklung eines allgemeineren Verfahrens führen kann.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate, monobasic	Fisher Scientific	P285-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	P288-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water	Millipore Direct-Q		18 MΩ cm
pH meter and electrode	Denver Instrument	UB-10
Cytochrome c from equine heart	Sigma Aldrich	C7752-100MG	≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20 °C
Glass scintillation vials	Wheaton	03-341-25J	20 ml, O.D. x height (with cap): 28 mm x 61 mm
Disposable cuvette	Fisher Scientific	14-955-126	methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-1800	Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter)	JASCO	J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator	Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers	Fisher Scientific	01-291-10	50 ml
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS)	Sigma Aldrich	218472-500G	98% purity
Methanol	Fisher Scientific	A457-4	GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution	Sigma Aldrich	221228-25ML-A	ACS reagent, 28.0%-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials	Sigma Aldrich	Z376825-1PAK	16 mm x 57 mm, volume size 6.5 ml, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap	various
Parafilm M laboratory wrapping film	Fisher Scientific	S37440
Plastic syringe plunger	various		use syringe plunger from 3 ml syringe
Ethyl alcohol	Acros	61509-0040	Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone	Fisher Scientific	A949-4	HPLC grade
Critical point drying apparatus	Quorum Technologies		E3000 Series
Circulator	Fisher Scientific	Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder	Tech Air		siphon tube
Micrometer	Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software	Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder	Tech Air		Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder	Airgas
Tygon tubing	various
T-switch valve	various
syringe needles	various