시토크롬을 캡슐화<em&gt; C</em&gt; 금속 나노 입자없이 실리카 에어로젤 Nanoarchitectures에 가스 상 생체 활성을 유지하면서

요약

이 절차 bioaerogels을 형성하는 _(SiO2를) 졸 - 겔 공정이 겔 실리카 시토크롬 C (CYT. C)를 캡슐화하고 신속 가스상 반응을 통해 산화 질소 (NO) 인식이 bioaerogels를 사용하는 방법을 설명한다. 프로토콜이 종류의 생체 시료의 바이오 센서 또는 다른 장치의 향후 개발에 도움이된다.

초록

기능성 화합물 에어로젤 내에 캡슐화 될 때 센서, 전지,​​ 연료 전지 등의 애플리케이션 다공성 에어로젤의 사용을 통해 개선되었다. 그러나, 에어로겔을 형성하도록 처리 된 졸 - 겔 내에 단백질을 캡슐화하는 몇몇보고에 존재한다. 실리카 시토크롬 C (CYT. C)를 캡슐화하는 방법 _(SiO2로) supercritically 질소 산화물 기상 활성 bioaerogels를 형성하도록 처리되는 졸 - 겔 (NO) 제공된다. CYT. C 제어 단백질 농도 하에서 혼합 실리카 졸에 첨가하고, 강도 조건 버퍼이다. 졸 혼합물을 겔화 및 겔 공극을 채우는 액체는 액체 이산화탄소와 용매 교환 일련 대체된다. 이산화탄소의 임계점을 가져다 CYT 건조 에어로젤을 형성하는 떨어져 배출된다. 안에 캡슐화 하였다. 이 bioaerogels는 자외선 - 가시 분광와 특징D 색성 분광법 및 기상 산화 질소의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 절차의 성공 CYT. C 농도 및 완충액의 농도에 따라 조절 및 금속 나노 입자와 같은 다른 요소를 필요로하지 않는다. 잠재적 인 미래 생물 분석 장치의 개발이 중요한 결정 절차와 유사한 방식을 사용하여 다른 단백질을 캡슐화하는 것이 가능할 수있다.

서문

시토크롬 C (CYT. c)는 신체의 세포 호흡 반응에 관여하는 주요 전자 수송 단백질이다. 이는 아폽토시스 세포 사멸의 제어 형태에 관여하는 것으로 도시되었으며, 이는 산화 질소 및 일산화탄소 ^1-3과 같은 작은 독성 분자를 검출 할 수있다. 질소 산화물 (NO), 심혈관 신경 및 면역 체계에서 발생하는 생리 학적 과정의 다양한 역할을한다. CYT가. c를 일반적으로 구조적 손상과 활성 상태로 유지하기 위해 pH를 중성 값으로 버퍼 수성 환경이 필요하지만, 연구는 CYT을 보여 주었다. C는 특정 조건 ^4-9에서 에어로젤로 알려진 고체 물질의 구조와 기능을 유지할 수 있습니다.

에어로젤은 종종 금속 산화물 에어로젤은 매우 일반적이지만, 탄소 에어로젤 다른 유형의 합성 된 (졸 - 겔 금속 산화물을 합성함으로써 형성된 다공성 재료이다. 일 예이다 InP를 AERogels) ^(10)과 같은 방식으로 이러한 졸 - 겔을 건조 다공성 고체 기질은 ^11-14 그대로 남아있다. 고체 에어로젤의 기공의 모든 표면 반응이 중요한 어떤 애플리케이션에 매우 유용하게 사용할 수 많은 표면적 에어로젤 제조 될. 화학적 또는 생화학 적 기능은 에어로겔 나노 구조 내에 조립 될 때, 물리적 인 다공성 및 에어로젤의 향상 표면적 센서뿐만 아니라, 전지의 전극, 연료 전지, 및 수퍼 애플리케이션 ^11,15-23을 개선하는 데 도움이 있다고 밝혀졌다 . 불변 다공성 고체 기질 잎 방식 에어로젤을 건조시키기 위해, 초 임계 용매 추출을 통해 졸 - 겔 합성 후 공극 유지하여 용매를 제거 전형적이다. 겔로부터 용매를 증발로 표면 장력에 의해 야기 될 수있는 임의의 세공 붕괴 때문에 초 임계 건조 액체 - 증기 계면 결코 형태 최소화된다.

같은 CYT 등의 헴 (heme) 단백질의 많은보고가있다. 젖은 보관할 것 또는 그 ambiently ^24-30 건조 된 졸 - 겔에 캡슐화되고 c를. 다음 supercritically 건조 된 졸 - 겔 캡슐화에 생체 분자의 리포트 에어로젤 인해 많은 단백질의 구조에 유해 할 수있는 필요한 처리 드물며 형성한다. CYT. (C)의 경우, 특정 조건은 가능한 감지 에어로젤 내에 기상 산화 질소 반응 중 CYT. C 능력을 유지하도록 만든다. 일단 에어로겔 안정화, 에어로겔의 고품질 기공 구조 CYT. C 및 산화 질소 ^4,8,9 사이의 반응을 용이하게한다. CYT. C는 최초의 솔루션 ^4-8에 금 또는은 나노 입자 주변의 여러 계층에 연결하여 에어로겔 내에 캡슐화 할 수 있습니다. 이러한 다층 선루는 에어로겔 매트릭스 내의 단백질을 보호하는 역할을한다. 가장 최근 approac에서단백질 농도 및 버퍼 강도가 다른 합성 조건에 따라 제어되는 우리가 개발 한 시간은 CYT. C도 금속 나노 입자 초기 협회 ^9없이 에어로젤 내에서 무결성을 유지합니다.

많은 에어로젤 합성 시간이 설정된 시간 동안 실리카 졸 - 겔 전구 물질을 혼합하여하기와 같은 합성이 시작된다. 그것은 C는 혼합물에 완충 용액으로 추가됩니다 CYT. 시간을 혼합 세트 후입니다. 겔화 후, 기공을 물, 메탄올, 나머지 반응물 및 부산물 충전되는 다공질 실리카 고체 구조를 형성 일어난다. 이 공극을 채우는 액체는 용매 교환 일련의 각종 용매로 세정 할 수 밖에 액체 이산화탄소 임계점 건조 장치 내에서 발생하는 마지막으로 교환은 낮은 온도로 유지. 이산화탄소의 임계 온도 (31.1 ℃) 상기 겔을 잡는 등의 형성을 용이마른 다공성 에어로젤을 형성하도록 배출 될 수있는 가압 장치 내부 upercritical 유체. 그것이 변성 수있는 온도 이하로 단백질을 유지하기 때문에, 초 임계 유체를 형성하도록 이산화탄소에 필요한 상대적으로 낮은 온도는 다른 용매와 비교하여 유리하다.

그것뿐만 아니라 다른 단백질을 캡슐화하기위한보다 일반적으로 해당 프로토콜의 개발로 이어질 수있는 간단한 방법이기 때문에, 에어로겔에 CYT. C 캡슐화에 대한 우리의 금속 나노 입자가없는 방식은 유리하다. 대부분의 단백질은 CYT 같은 방법으로 금속 나노 입자와 상호 작용하지 않을 수 있습니다. c를 수행하고 금속 나노 입자 합성 또는 구매 절차에 추가적인 시간과 비용을 추가합니다. 에어로젤 단백질을 캡슐화에 몇보고 난 도움 수 에어로젤 다른 단백질을 캡슐화하기위한 일반적인 절차를 찾는 중요한 단계 순방향 절차의 개발을n은 미래의 잠재적 생체 시료 장치.

이 원고의 프로토콜 부분은, 실리카 졸 - 겔을 합성이 졸 - 겔에 CYT. C를 캡슐화, 에어로젤을 형성하는 이러한 복합 졸 - 겔을 건조, UV-볼 원형 이색 성 분광법을 사용하여 이러한 bioaerogels의 특성과 존재를 검출하는 방법에 대해 설명합니다 이 bioaerogels와 기상 산화 질소의. 제 인산염 완충액 4.4 내지 70 mM의 수용액에 용해 될 때 CYT. C 성공적 에어로젤로 캡슐화되어왔다. 그러나, 에어로젤에 최적화 된 단백질 구조가 CYT 40 mM의 인산 버퍼 솔루션을 캡슐화 할 때 발생하는 것으로 확인되었습니다.로드 에어로젤 CYT를 생산 하였다. 5의 범위에서 C 농도를 15 μM ^9. 따라서, 아래의 프로토콜은로드 CYT 결과 CYT. (c)의 40 mM의 인산염 완충 용액을 사용하여 에어로겔을 합성하는 것입니다. 15 μM의 에어로겔의 C 농도.

프로토콜

안전 안경이나 고글, 실험실 코트, 연구용 장갑이 절차를 수행하는 동안 항상 착용해야합니다. 안전 안경이나 고글없이 임계점 건조 장치를 작동하지 마십시오. 테트라 메 톡시 실란, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 암모니아를 포함하는 모든 용액은 흄 후드 내에서 처리되어야한다.

1. 버퍼 및 CYT를 확인합니다. C 솔루션

1. 제 아웃 1 인산 칼륨 2.72 g을 계량하고 500㎖의 메스 플라스크를 사용하여 물에 용해하여 0.04 M 인산 칼륨 일 염기성 500ml의 준비, pH가 7, 40 mM의 인산 칼륨 완충액 ~ 750 mL로한다.
2. 칼륨, 인산 3.48 g을 칭량하고, 500 ㎖의 메스 플라스크를 사용하여 물에 용해하여 0.04 M 칼륨 인산 500㎖의 준비.
3. 교반 막대와 큰 비커에 이염 염 용액을 붓고 저어 접시에 솔루션을 저어.
4. 천천히 염기 소금의 일부를 추가pH가 7.00가 될 때까지 pH 전극 및 m으로 pH를 모니터링하면서 염기 염 용액 olution. 염기성 염 용액을 약 250 내지 300 ml를 사용한다.
5. 유리 섬광 유리 병에 CYT. C와 장소의 약 0.023 g을 달아. 마이크로 피펫을 사용하여 제조 된 인산 칼륨 완충액 000 μL를 추가 한 다음 부드럽게 고체 적색 CYT 모든까지 섞어 용액 소용돌이. C는 용액에 용해하고없는 입자상 물질이 남아있다.
6. 준비 CYT. C 용액 20 μl를 타고 1 cm 경로 길이의 플라스틱 큐벳에 추가 할 수 있습니다. 준비 버퍼의 3 ML을 추가합니다.
7. 기준 셀에서 버퍼를 사용하여 300-700 nm의에서 UV-힘 스펙트럼을 가져 가라. CYT를 사용한다. C 흡광도 (A)을 106,100 M ^-1 cm ^-1의 409 nm의 흡광 계수 ⁽³¹⁾ (ε)에서 큐벳 경로 길이 (L)와 비어 - 람 베르트 법칙의 농도를 결정하는 (c) 용액 (A = εlc).
8. 원래 준비된 용액의 농도를 계산한다. 이 용액은 제조 CYT. C 액 0.7-0.9 mM의 농도 사이에 일반적이다.
9. 섬광 유리 병에 0.72 mM의 준비 CYT. C 용액 117 μl를 피펫 팅에 의해 0.105 mm의 800 μL 원래 준비 CYT. C 솔루션을 희석. 이어서 제조 된 완충액 800 μL (이 경우 683 μL)의 균형을 추가한다. 혼합 소용돌이 친다. 정확한 볼륨은 원래 준비 CYT의 정확한 농도에 따라 달라집니다. CYT의 볼륨으로 C 솔루션. 피펫가 (800 μL * 0.105 밀리미터)로 계산되는 c를 / (원래 CYT. 밀리미터의 C 농도).
10. 원래 준비 및 희석 CYT를 저장합니다. C 솔루션을 2-8 ℃에서 냉장고에 최대 2 주 동안 사용할 준비가 될 때까지.

(2)를 합성 실리카 _(SiO2를) 솔

1. 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌 비이커 레이블 '한다케르 A '. 분석 저울의 냄비에 비커를 넣고 비이커에 1.88 g의 테트라을 추가 할 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 제로 균형 다음 '비커 A'로 메탄올 2.88 g을 피펫.
2. 파라 필름과 커버 '커'.
3. 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌 비이커 '비커 B'를 레이블. 분석 저울의 팬에 자기 교반 막대와 장소를 추가합니다. 0.75 g의 물 3.00 g 메탄올을 추가하는 유리 피펫을 사용합니다.
4. 파라 필름과 커버 '커 B'.
5. 다음, 교반하면서 파라 필름으로 커버를 통해 28.0-30.0 % 수산화 암모늄 용액 5 μL를 추가하는 주사기를 사용하여, 흄 후드 안쪽 교반 플레이트 "비커 B '의 내용을 저어 준다.
6. 즉시 단계 2.5이 완료되면, '비커의 B'에 '커'의 내용을 추가합니다. 파라 필름으로 덮여하면서 20 분 동안 혼합물을 교반한다.

3. 젤 금형 준비

참고 :이실리카 졸의 혼합물을 단계 2.6에서 교반하면서 겔 금형을 준비하는 시간이다.

1. 대응 캡 (바닥 오프 슬라이스와 16mm X 57mm, 볼륨 크기 6.5 ml의) 8-9 폴리 프로필렌 섬광 튜브를 획득. 젤에 형성하고 플라스틱 포장 캡 내부에 그대로 남아 있음을 확인하는 동안 뚜껑을 배치하는 평면을 만드는 데 유리 병의 캡 끝을 통해 플라스틱 포장을 넣습니다.
2. 벤치 위에 캡 끝이 병을 일렬로하고이 위를 향하도록 바닥을 열었다.

4. CYT을 준비합니다. C -silica 솔 - 젤

1. 졸 혼합 (단계 2.6)이 완료되면, 깨끗한 일회용 50 ㎖ 폴리 프로필렌 비커에 졸 혼합물의 3 ㎖를 추가합니다.
2. 천천히 0.105 mM의 희석 CYT. ~ 1 분에 걸쳐 3 ㎖ 졸 혼합물에 C 솔루션 (단계 1.9 제) 500 μl를 드롭 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. CYT을 추가하는 동안 부드럽게 혼합물을 소용돌이해야합니다. 다 큰의 형성을 방지하기 위해붉은 덩어리. 이론적으로 3,500 μL, 지금 졸이의 CYT. C 농도 15 μM에 0.105 mM의 CYT. C 용액 500 μl를 희석하여, 볼륨이 부가되어 가정.
3. 피펫 각각 준비된 금형에 얻어진 CYT. C 실리카 졸의 0.5 mL의. 또한, 초 임계 건조 공정 중 대조 시료로서 사용하여 하나 또는 두 개의 주형에 남아있는 '보통', 실리카 졸을 0.5 ml의 피펫.
4. 파라 필름으로 금형의면이 위로 구멍을 덮고 졸 - 겔을 생산하는 (~ 2-8 ° C) 하룻밤 또는 적어도 12 시간 냉장고에 넣어.
5. 냉장고에서 금형을 가져 가라. CYT를 포함하는 하나 금형의 상단에서 파라 필름을 제거 다 졸 - 겔 (sol-gel)을.; 또한 바닥에서 모자와 플라스틱 포장을 제거합니다.
6. 금형에 세척 병에서 약간의 에탄올을 첨가 한 후, 조심스럽게 틀에서 벗어나 깨끗한 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병의 계속에 젤을 밀어 주사기 플런저의 원형 디스크 끝을 사용하여에탄올의 약 5 mL를 aining.
7. CYT 모든 때까지 겔 제거 절차 (4.5 단계 4.6) 반복한다. C 겔을 바이알에 첨가하고, 실리카 겔을 모두 별개의 바이알에 첨가한다. CYT. C 젤 이상의 농도가 이루어진 경우, 별도의 튜브 내에서 함께 젤처럼 저장해야합니다. 그리고 2-8 ° C의 사이 에탄올, 모자, 상점과 상단에 튜브를 입력합니다.
8. 하루 종일 매 4 시간, 냉장고에서 젤을 제거 젤 오프 에탄올을 가만히 따르다 신선한 에탄올로 대체합니다.
9. 추가로 3 일 동안, 경사와 신선한 아세톤에게 하루에 세 번을 추가, 아세톤에 젖은 졸 겔 잠수함.

5. Supercritically 드라이 CYT. 다 -silica 솔 - 젤

1. 8 ℃로 연결된 순환의 온도를 10 ℃까지 임계점 건조 장치 (도 1 참조) 쿨.
2. 장치 (R)를 일단10 ° C를 eached 아세톤 전사 보트 채우고 장치의 내부를 밀봉하여 상기 장치에 누설 검사를 수행한다.
   1. 장치의 충전 밸브를 열고 장치는 반 가득 찰 때까지 이산화탄소를 추가 할 수 있습니다.
   2. 충전 밸브를 닫고 O 링 또는 씰이 악화 될 수있는 문 및 밸브에서 치찰음주의 깊게 듣는다.
   3. 누수가 발견되면 모든 O 링 또는 씰을 교체하십시오.
3. 누설 테스트를 완료 한 후, 흄 후드의 드레인에 아세톤 및 이산화탄소를 분리 배출 밸브를 연다. 그런 다음 장치로부터 전송 보트를 제거합니다.
4. 장치는 누설이없는 것을 확인한 후 조심스럽게 전송 보트의 세 가지 긴 섹션으로, 아세톤의 대부분과 함께 섬광 유리 병에서 젖은 젤을 부어 (표본 바구니 또는 거즈 커버 필요하지 않습니다). 섬세하게 밀어 모든 젤이 완전히 내가 침수되는 것을 보장하기 위해 집게와 보트 내에서 젤 이동n 개의 아세톤. 장치의 내부에 보트를 밀봉하기 전에 필요한 경우 더 많은 아세톤을 추가합니다.
5. 이어서, 이산화탄소를 추가 한 빨리 이산화탄소와 혼합 아세톤 장치 창을 통해 상기 장치의 바닥에 가라 앉는 것으로 관찰 된 바와 같이 5 분 동안 아세톤 해제 배수 밸브를 열어 장치의 충전 밸브를 연다. 장치가 완전하게 이산화탄소 충전 전에 충전 밸브는 배수 중에 필요한 정도 열린 상태로해야하므로 장치의 드레인은 오픈 상태에서도 기입 계속되도록 아래로 아세톤이 시운전을가 발생할 것이다.
6. 드레인 밸브를 닫습니다. 약간 오픈 금 채우기 밸브를 유지합니다.
7. 5 분 후에, 상기 장치는 전체 배수 시간 동안 완전하게 유지되도록 충분히 개방 될 다시 5 분 동안 배수 밸브를 열어 충전 밸브를 조정한다. 드레인 밸브를 닫습니다 채우기 밸브가 열려 금이 유지,이 배출 단계를 한 번 더 반복 오나중에 분.
8. 이러한 처음 세 배수 단계에 따라 약 적어도 6 시간 스팬을 통해 모든 40 분 젤 내의 액체 이산화탄소로 아세톤의 완전한 교체를 위해 한 번에 5 분 동안 배수를 엽니 다. 항상 상기 장치 내의 액체 레벨이 절대 배수 중에 보트의 상부 아래로 내려 가지 않도록 서로 배수 중에 충분히 개방하는 충전 밸브를 조정한다.
9. 일단 배수 단계를 완료, 충전 밸브를 닫고, 레벨이 장치 창을 통해보고 그냥 보트 프롱 위에 계속 표시되도록 액체 이산화탄소를 배출.
10. 보장하기 위해 40 ° C에 장치 부착 서큘 레이터의 온도를 설정하는 임계 온도와 압력 위의 액체 이산화탄소 상승 (T의 _C = 31 ° C, P의 _C = 7.4 MPa의).
11. 약 15 분 후, 액체 menisc있어서 창을 통해 초 임계 유체로의 액체의 전환을 관찰보트의 프롱 위에 우리가 사라집니다. 평형 시간의 적어도 15 분 후, 초 임계 유체를 방출하기 위해 배기 밸브를 열어 소량 허용.
12. 약 45 분에 걸쳐, 방출 유체의 상승하지만, 매우 낮은 히스들을 수 있도록 점진적으로 배출 밸브가 넓고 넓은 열고 계속 압력계 서서히 제로로 감소하는 것으로 관찰된다.
13. 장치의 압력이 제로에 간 후, 장치의 문을 열어 배를 제거하고 깨끗한 유리 섬광 유리 병에 새로 건조 된 에어로젤을 배치 집게를 사용합니다.

6. 성격을 CYT. 다 -silica UV-볼과 원 편광 이색 (CD)와 에어로젤 분광학

1. UV-눈에 보이는 분광 광도계 또는 CD 분광계의 빔 경로에 에어로겔 모노리스를 개최 판지 플랫폼을 준비합니다.
   1. 이러한 라보의 상자에서 골판지로 (경량 판지의 2.5 cm X 2.5 cm 조각을 잘라ratory 조직), 다시 절단에 의해 생성 된 두 개의 플랩, 배, 중턱 배에 잘라 반으로 접습니다.
   2. 중간에 1.5 cm X 1.5 cm 사각형 구멍으로, 경량 판지의 5cm X 5cm 조각을 잘라. 0.5 cm X 0.5 cm에 홀드의 크기를 감소시키는 검은 전기 테이프를 사용합니다.
   3. 작은 굴곡면을 에어로겔 모노리스 생성되도록 판지의 5cm X 5cm 조각에 대한 접어 절단 판지의 뚜껑이 0.5 cm X 0.5 cm의 구멍의 바로 앞에 앉아 테이프 (그림 2 참조) . 구멍이 빔 경로와 일치한다이어서 UV 가시 분광 광도계에 골판지의이면 부분을 테이프.
2. 마이크로 미터 경로 길이에 사용될 겔의 두께를 측정한다.
3. 골판지 플랫폼에서 하나의 젤을 놓고 자외선 - 가시 분광 광도계의 기준 실에서 공기와 300 ~ 800 nm의에서 스펙트럼을 측정한다.
4. 다항식, A = 맞는 λ ^N, 흡광도 (A)를 배경 산란에 주로 기인 파장 (λ) 지역, ~ 700-800 nm이다. 계수 사이의 숫자 전형적 적합 ~ 1 × 10 ⁸ × ¹⁰⁶ (1) 및 N 개의 계수가 2 ~ 3 사이의 값으로 일반적으로 적합하다.
5. 맞는에서 얻은 계수, n은을 사용하여, 다른 파장의 분산을 계산합니다.
6. 분산 보정 된 스펙트럼을 획득하기 위해 원시 스펙트럼으로부터이 계산 된 산란 배경 흡광도를 뺀다.
7. 에어로겔 Soret 피크의 피크 높이, 피크 중심 피크의 폭을 결정하는 적절한 소프트웨어 (GRAMS / AI 8.0)를 사용하여 490 내지 370의 영역에서 가우시안 곡선 캐터 감산 스펙트럼을 장착한다.
8. 경로 길이 (l), 106100 M의 흡광 계수 ⁽³¹⁾ (ε)에 대한 겔의 두께를 측정하여 비어 램버트 법칙을 적용 ^-1 cm ^-1 과 Soret 피크 높이 (A)는 에어로겔 (A = εlc)에 CYT. (C)의 농도 (C)를 ​​계산한다.
9. 계산 된 CYT 비교. C 농도를 농도에 이론적 겔 (15 μM)에 에어로젤 내 CYT. (c)의 가능성을 확인 할 수 있습니다. 전형적인 %의 생존율을 100 %에 근접하지만, 이들 생존율을 계산 CYT의 흡광 계수보다 약간 다른 것으로 추정된다 용액 ³¹ CYT. (C)의 흡광 계수를 기반으로하기 때문에 단지 추정치임을 유의해야한다. 알 수없는 에어로겔의 다.
10. 램프를 켜기 전에 최소 5 분 CD 기기에서 실행 질소.
11. 구멍이 빔 경로와 일치하므로 CD 분광계로 종이 홀더 테이프입니다.
12. 세 검사의 평균을 복용, 100 나노 미터 / 분에서 350-500 nm의에서 종이 홀더 아무것도 연속 파장 빈 스펙트럼을 측정.
13. 골판지 플랫폼에서 하나의 겔 (이전 단계 6.2로 측정 두께) 놓고 세 검사의 평균 복용, 100 나노 미터 / 분에서 350-500 nm의에서 스펙트럼을 측정한다.
14. 관심의 모든 에어로겔 모노리스의 자외선 - 가시와 CD 측정을 반복합니다.

7. CYT와 질소의 존재 산화물 (NO) 가스를 감지합니다. C -silica 에어로젤을

주의 : NO 작업은 위험하며 모든 NO 가스는 흄 후드에 흄 후드에서 처리하거나 소진해야합니다. NO에 지속적인 노출은 NO가 공기와 접촉 할 때 형성되므로 매우 유독 이산화질소 및 / 또는 사 산화 이질 소 조직에 독성이다. NO 물과 접촉하면 열 및 부식성 가스도 생산된다.

1. 환기가 잘되는 흄 후드에서 8 L 산화 질소 실린더 (10 % 산화 질소, 90 % 질소)를 놓고 4 PSI에 압력을 조정합니다.
2. 6 PS 설정 질소 실린더 (압력 모두 산화 질소 실린더 및 튜브에 연결i) 및 T-밸브 튜브의 끝을 연결 () 그림 3a를 참조하십시오.
3. 실험 에어로겔 모노리스를 선택하고 마이크로 미터와 두께 (또는 경로 길이)를 측정한다.
4. 플라스틱 캡 일회용 큐벳의 에어로젤 (~ 3mm 두께)를 놓고 분광 광도계로 큐벳을 넣어. 큐벳에 맞게 필요한 경우 약간 에어로젤을 잘라.
5. 큐벳의 플라스틱 캡, T-밸브의 출력에 연결 한과 (그림 3b 참조) 흄 후드에 배기 역할을 튜브에 연결 하나에 두 개의 주사기 바늘을 삽입합니다. 튜브 및 큐벳에 캡에 바늘을 밀봉 파라 필름을 사용합니다.
6. 기준 셀에 빈 일회용 큐벳을 놓습니다.
7. 에어로겔 전에 실험을 시작하기 빔 경로에 놓여 있는지 확인 에어로젤 큐벳 위치를 조정합니다.
8. 800에서 300 nm의 초기 스펙트럼을 가져 가라.
9. 4에서의 흡광도 차이를 모니터링14 nm 내지 408 nm에서의 흡광도를 짧은 시간에 질소, 질소 산화물 / 질소 혼합되도록 높은 유량이있는 것을 확인하고, 설정 시간 간격으로 질소 및 산화 질소 / 질소 혼합물을 전환 할 T 밸브를 돌리면서 에어로겔은 큐벳 주위에 이동합니다.
10. 노출 사이클이 완료되면, 800 ~ 300 nm의에서 최종 스펙트럼을 가져 가라.
11. 평균 검출 응답을 얻기 위해 3-4 모노리스와 절차를 반복한다.

결과

가능한 CYT. C를 포함 에어로젤에 설명 된 절차 결과. 도입 단부에 규정 된 바와 같이, CYT. (C)는 4.4 내지 70 mM의 인산 범위 수성 완충액에서 캡슐화 될 수있다. CYT의 예. C -silica (CYT. 다 -SiO ₂₎ 다른 버퍼 농도를 함유 한 용액으로 만든 에어로젤은 그림 4에 표시됩니다. (70)로 만든 젤 mM의 가장 불투명 한 버퍼에 모든 젤은 상대적으로 반투명입니다.

의 CYT. 다른 조건에서 C 분광법의 비교. 전형적인 스펙트럼 (도 5c)가 CYT 408 nm의 주위에 큰 Soret 피크를 보여줍니다. 그림 5에서 C -SiO ₂ 에어로젤을 표시하고 CYT의 스펙트럼과 매우 유사하다 . 솔루션 (그림 5a)에서 다. 또한, CYT의 스펙트럼.금속 나노 입자와 에어로겔 내에 캡슐화 C는 (그림 5B)와 CYT를받습니다. 다 -SiO ₂ 에어로젤 스펙트럼뿐만 아니라이 스펙트럼과 유사하다. 이 CYT. C _-SiO이 에어로겔은 산화 질소에 노출 될 때 피크의 Soret 전형적인 변속은 (도 5D)를 관찰한다.

CYT 만든 겔에 대한 UV-힘 스펙트럼. 다양한 완충액 농도 C 솔루션은도 6에 도시된다. 이러한 겔의 모든 특성 UV 가시 분광가 CYT. C는 겔 내의 변성 상태가 아님을 표시하는 기능을 나타낸다. 그러나, 겔의 투명도 감소 이들 스펙트럼에 대한 낮은 신호대 잡음비에서 70 mM의 버퍼 결과에서 만들었다.

CYT의 CD 스펙트럼. 다 -SiO ₂ 에어로젤은 CYT의 스펙트럼과 유사하다. 다 에어로겔 스펙트럼의 두 유형 완충 용액 CYT. C의 스펙트럼 차이가 있지만, 금속 나노 입자 에어로젤 캡슐화 (도 7).

그림 8은 CYT의 일반적인 산화 질소 모니터링 응답을 보여줍니다. C -SiO ₂ 에어로겔도 CYT. C뿐만 아니라 금속 나노 입자를 포함하는 해당 에어로젤. 408 nm에서 414 nm에서의 흡광도 및 그 사이의 차이가 증가하고 겔을 연속적으로 각각 다음 질소를 산화 질소에 노출 될 때 감소하는 것으로한다.

초 임계 이산화탄소를 충분히 느린 속도 CYT의 생존이 방출되지 않는 경우. C 형성된 에어로겔 내에 노출한다. 이것은 다른에서 이산화탄소를 방출하여 겔을 형성 한 후, 생성 된 UV 가시 스펙트럼을 비교함으로써 밝혀요금 (그림 9).

도 1 : 임계점 건조 장치 위로 장치의 후면에 도시 된 다음 전송 보트 및 장치 도어 (A) 앞 (B)에서 도시 임계점 건조 장치..

그림 2 : 골판지 플랫폼 악기의 빔의 경로에 에어로젤을 유지하기위한 조립 판지 플랫폼입니다..

그림 3 : 산화 질소 감지 설정 산화 질소 감지 설정은 (A) 10 % 산화 질소 둘러싸인 흄 후드를 포함하여 표시됩니다.90 % 질소 실린더 튜브와 T-밸브, 및 (B)를 삽입 바늘 큐벳.

그림 4 :.. 샘플 CYT C -SiO ₂ 에어로젤은 15 μM의 CYT을 캡슐화 에어로젤 C를 4.4 밀리미터, 40 밀리미터, 70 mM의 인산 칼륨 버퍼에 왼쪽에서 오른쪽으로 한푼도 비교에 표시됩니다.. 이 에어로젤은 약 0.2 ~ 0.5-cm 높다. 권한 ⁹ 재판.

그림 5 :. CYT 다 -SiO ₂ 에어로젤 분광법 ()의 50 mM 인산 완충액 졸 15 μM 시토크롬 C의 가시 스펙트럼.의 ution; (b)는 금 _{(5 나노 미터)} ~ CYT 다 -SiO ₂ 에어로젤.; (다) CYT (공기에 노출) C -SiO ₂ 에어로젤.; (d)에 CYT. (3.5 분 동안 산화 질소에 노출) C -SiO ₂ 에어로젤. 겔의 각 유형이 대표적인 스펙트럼은 명확 오프셋되며, 점선은 버퍼의 CYT. C Soret 피크의 위치를 나타낸다. 각각의 스펙트럼은 15 μM CYT. (C)의 동안, 겔의 두께 (또는 높이)가 높은 용액의 흡광도 결과 1 cm 용액 큐벳에 비해 단지 0.2~0.5-cm이다. 권한 ⁹ 재판.

그림 6 :. 캡슐화 된 버퍼 농도 에어로젤 분광법은 _ 15 캡슐 젤 젤 경로 길이로 나눈 에어로젤의 자외선 - 가시 광선 스펙트럼의 흡광도 변화 평균화6; M CYT 70 밀리미터 (블랙) (점선 녹색) (4 스펙트럼의 평균), 40 mM의 (붉은 점선) (8 스펙트럼의 평균), 4.4 밀리미터 (9 스펙트럼들의 평균)의 인산 칼륨 완충액 하였다. . 권한 ⁹ 재판.

그림 7 :... 에어로젤 원 편광 이색 분광법 (고체) 인산 나트륨 완충 용액에 CYT (c)의 원형 이색 스펙트럼, CYT의 두 대표 스펙트럼 다 -SiO ₂ 에어로젤 (점선)과 금의 두 대표 스펙트럼 _{(5 나노 미터)} ~ CYT. ㄴ _SIO-2 에어로젤 (점선). 권한 ⁹ 재판.

그림 8 : CYT와 산화 질소 검출 C -SiO _2. . 서브> 에어로젤은 변화를 모니터링 (ΔA는 _{414 나노 미터} = - _{408 ㎚).} CYT의 Soret 강도를 가스 흐름 등의 _SiO2 복합 에어로젤 nanoarchitectures에 캡슐화 C (빨강 색)과 금 ~ CYT C (파란색 점선). 질소 사이에 토글 (Soret 피크 최대입니다 ~ 408 nm의)과 (Soret 피크 최대 ~ 414 nm에서이다) 산화 질소. 각각의 곡선은 CYT 두 가지로, 3-4 시험의 평균 ΔA에서 모니터 다 -SiO ₂ 시험은 _{414 나노 미터} = -. 초기 Soret 피크 최대 이러한 시험에 대한 407 nm에서 이후 _{407 nm의.} 권한 ⁹ 재판.

그림 9 :. CYT에 대한 겔 경로 길이로 나눈 초 임계 유체 해제 시간 효과 '평균 자외선 - 가시 스펙트럼의 흡광도 C -SiO ₂ 에어로젤 ENCA.50 mM의 supercritically 건조 된 에어로젤은 45 분 (9 스펙트럼의 고체, 검은 색 (평균)) 또는 7 분 (4의 점선, 빨간색 (평균 이상 중 하나를 해제 초 임계 이산화탄소에 의해 만들어진하는 인산염 완충액 10 μM의 CYT을 psulating. 다 스펙트럼)). 권한 ⁹ 재판.

토론

한 바와 같이,이 절차는 지속적으로 실행 가능한 CYT을 생산하고있다. 에어로겔 내에 캡슐화 하였다. 에어로겔 내의 CYT. (C)의 농도는 5 내지 15 μM 및 4.4 단백질 생존에 심각한 악영향없이 70 mM의 인산을 변화시킬 수 에어로젤 캡슐화 초기 CYT. C 용액 완충액 농도에서 변화 될 수있다. 그러나, 피크 센터와 특성 CYT의 피크 폭입니다. 에어로겔의 Soret 피크 C는 40 mM의 버퍼 ⁽⁹⁾ 솔루션에서 에어로젤에 캡슐화 할 때 CYT. 그들은 솔루션 CYT. C는 무엇에 가장 가까운 수 있습니다시켰다.

CYT의 합성. 다 -SiO ₂ 에어로젤은 시작 시약 중 일부의 나이에 의해 영향을 받는다. 메탄올, 테트라 암모늄 수산화물 용액은 모두 흡습성이며 모두 ~ 2 개월 대체되어야한다. 에 축적 증가 물시간에 따른 이러한 시약은 겔 구조적 특성 및 졸 - 겔로 천이 시간에 영향을 미친다.

초 임계 건조를 수행 할 때 중요한 점 건조 장치의 전송 보트 두께 십팔 0.5 cm, 1cm 직경 젤까지 보유 할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에 설명 된대로, 특정 충전 및 배출 절차는 졸 - 겔로 이산화탄소를 전송하기 위해 따라야한다. 이 배수 프로토콜의 시작 점에 유의하는 것이 중요하다, 이산화탄소 및 아세톤의 혼합물을 배출 배액관 수분이 외부에 얼음 응축과 같은 단단한 정지 고속으로 흐른다. 아세톤 무수 아니고,이 물이 가끔 드레인 관이 실제로 나막신 정도 정지 될 수 있기 때문에 밖으로 배출 혼합물을 물이 포함되어 있습니다. 여기에는 나막신을 감시하고 흐름의 정지를 수신 할 필요가있다. 막힘이 검출되는 경우 방해 용융 있도록 배수 밸브는 몇 분 동안 폐쇄한다. 에서배출 밸브가 폐쇄되지 않으면 최악의 경우는, 막힘 너무 압력이 배액관 강제 장치를 무효로하는 것이 축적시킬 수있다. 처음 몇 배수 기간 후 아세톤의 대부분은 상기 장치에서 세정 된 것이며, 젖은 얼음 덩어리의 발생이 크게 감소 할 것이다. 배수 프로토콜 (예 : 향기)를 아세톤 존재의 잔여 증거를 계속 방전이 점진적으로 배수 처리의 말에 탐지되는 드라이 아이스 유사합니다.

장치 내의 이산화탄소가 초 임계 유체를 액체로 전환하고 배출하는 과정을 시작한 후, 상기 절차 ^9에 나타낸 바와 같이, 적어도 45 분에 걸쳐 느린 속도로 액체를 분리하는 것이 필요하다. (도 9에 도시 된 바와 같이) 더 높은 방출 속도 에어로젤 내에. C를 CYT의 가능성을 감소시킬 수 있고, 에어로젤 자체는 실질적으로 제 깨지 수도전자 유체는 젤에서 탈출 러시. 에어로젤은 장치의 도어를 개방 한 후에 그대로 유지 될 때 이들이 깨지기 쉽게 깰 수 일반적으로, 심지어는 신중하고 부드럽게 처리하는 것이 중요하다.

CYT 함께 부어 제어 실리카 겔. C -SiO ₂ 겔은 겔 내로 이산화탄소 전송이 성공적인지 여부를 판별하기 위해 초 임계 건조 후에 사용된다. 때때로 CYT. C -SiO ₂ 겔은 흐린 나타날 수 있으며 불완전 용매 전송에 의한인지 확인하는 것이 중요하다거나 CYT. C의 농도와 함께 할 또는 젤 내에 캡슐화 된 버퍼 할 수 있습니다합니다. CYT없이 실리카 젤. 걸쳐 균일 한, 투명한 외관을 가지고있는 것 같습니다 c는 경우 용매 전송이 완전히 경우에도 CYT 발생한 것으로,이 증거로 간주 될 수있다. 다 -SiO ₂ 겔은 그들에게 약간의 흐림이있다. 실리카 겔 내의 흐림없이 CYT. C 건조 후 일부 아세톤 배기 중에 젤 내부에 남아 있음을 나타냅니다.

프로토콜 섹션에 표시된 바와 같이 산화 질소 (NO)와 함께 작업 할 때, 중요한 안전 예방 조치를 취해야 할 필요가있다. 에어로겔을 사용하여 NO를 감지하기 위해, 잘 큐벳을 밀봉하고 흄 후드로 에어로겔 통해 흐르는 가스를 배출하는 것이 필요하다. 선택적으로, 전체적인 분광 광도계 NO 가스에 대한 노출을 제한하기 위해 추가 예방책으로서 NO 가스 실린더와 함께 흄 후드로 이동 될 수있다. 공기 NO 접촉 즉시 매우 유독 한 질소 이산화탄소, 질소 화이 또는 둘 모두를 생산할 예정에. NO 또한 열 및 부식성 가스를 생산하는 물과 반응 할 수 없습니다. 따라서, NO에 지속적인 노출은 직접 조직 독성이 발생할 수 있습니다.

CYT 사용시. C -SiO ₂ 에어로젤 산화 질소의 존재를 검출하기 Soret 밴드는 처음 ~ 408 nm에서되며 이동합니다산화 질소의 존재 하에서 ~ 414 nm이다. 다시 질소로 전환 한 후, Soret 밴드 ~ 408 nm에서 중심되는 다시 반대한다. 또한 CYT을 사용할 수있다. C -SiO ₂ 에어로젤은 일산화탄소 ^(27)과 같은 다른 리간드의 존재를 검출하기 위해.

다른 출판 절차 전에 졸과 혼합 supercritically 에어로젤 ^4-8를 형성하기 위해 건조에 솔루션 CYT. C와 금 또는은 나노 입자를 결합하는 추가 단계를 포함한다. CYT의 UV 가시 스펙트럼의 비교. CYT의 것과 금속 나노 입자 에어로젤 캡슐화 하였다. 금속 나노 입자없이 에어로젤로 캡슐화 된 c하는 밀봉 기술 중 두 종류 에어로젤 내의 유사한 생존 CYT. C를 생성 것을 보여준다 (도 5) . 그러나, 금속 나노 입자로 캡슐화 CYT. C는 CYT보다 약간 더 안정적이다. 캡슐화 c는에어로젤 ⁽⁹⁾ 내에서 금속 나노 입자없이 라. 모두 약간의 에어로젤 내 CYT. C의 전개 나타내는 버퍼에 CYT. (c)의 스펙트럼 (그림 7)과 다를 있지만 CYT. C 에어로젤의 두 가지 유형의 CD 스펙트럼도 비슷하다. CYT에 이전보고합니다. c를 에어로젤에 캡슐화은 원형 이색 성 분광법은 대부분 금속 나노 입자 핵 다층 CYT 중 하나에서, 실리카 겔과의 접촉에 전개, 단백질의 가장 바깥 층을 평가하는 것이 좋습니다. C 구조 또는 형성 느슨하게 조직 구조를 아무런 금속 나노 입자는 에어로젤 ^4,9에 존재하지 않을 때. 비록 UV 가시 분광 측정 에어로젤 내부 자기 조직 구조의 어느 유형 내 CYT. C의 대부분이 절첩 상태로 유지. 본원 산세 나노 설명 프로토콜의 장점은 고가의 구매 또는 금속 시간 소모적 합성나노 입자는 필요하지 않습니다. 단백질은 종종 성공적 에어로젤 캡슐화되지 않은, 그리고 미래의 생체 시료 분석 장치의 잠재적 중요성으로 에어로젤 다른 단백질을 캡슐화하기위한 일반적인 방법의 개발로 이어질 수 있다는 점에서이 절차 때문에 중요하다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium phosphate, monobasic	Fisher Scientific	P285-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisher Scientific	P288-500	Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)
Water	Millipore Direct-Q		18 MΩ cm
pH meter and electrode	Denver Instrument	UB-10
Cytochrome c from equine heart	Sigma Aldrich	C7752-100MG	≥95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20°C
Glass scintillation vials	Wheaton	03-341-25J	20 mL, O.D. x height (with cap):  28 mm x 61 mm
Disposable cuvette	Fisher Scientific	14-955-126	methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45 mm
Ultraviolet Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-1800	Uses UVProbe v 2.33 software
Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter)	JASCO	J-810
Isotemp Laboratory Refrigerator	Fisher Scientific
Polypropylene disposable beakers	Fisher Scientific	01-291-10	50 mL
Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS)	Sigma Aldrich	218472-500G	98% purity
Methanol	Fisher Scientific	A457-4	GC Resolv grade
Ammonium hydroxide solution	Sigma Aldrich	221228-25ML-A	ACS reagent, 28.0-30.0%
General purpose polypropylene scintillation vials	Sigma Aldrich	Z376825-1PAK	16 mm x 57 mm, volume size 6.5 mL, slice off bottom with sharp knife or razor
generic plastic wrap	various
Parafilm M laboratory wrapping film	Fisher Scientific	S37440
Plastic syringe plunger	various		use syringe plunger from 3 mL syringe
Ethyl alcohol	Acros	61509-0040	Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent
Acetone	Fisher Scientific	A949-4	HPLC grade
Critical point drying apparatus	Quorum Technologies		E3000 Series
Circulator	Fisher Scientific	Isotemp 3016
Carbon dioxide cylinder	Tech Air		siphon tube
Micrometer	Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0 software	Thermo Electron Corporation
Nitrogen cylinder	Tech Air		Another inert gas could be substituted
10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder	Airgas
Tygon tubing	various
T-switch valve	various
syringe needles	various