Die Verwendung von Kaninchenaugen in pharmakokinetischen Studien von intraokulare Drugs

Zusammenfassung

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Zusammenfassung

Die intraokulare Route der Arzneimittelverabreichung ermöglicht die Bereitstellung von hohen Konzentrationen von therapeutischen Arzneimitteln, während die systemische Absorption zu minimieren. Mehrere Medikamente werden in die Vorderkammer oder glasigen verabreicht und die intraokulare Injektion ist bei der Heilung von verschiedenen Krankheiten intraokularen wirksam. Kaninchenaugen wurden für ophthalmologische Forschung weit verbreitet, da das Tier leicht zu handhaben und wirtschaftlich im Vergleich zu anderen Säugetieren, und die Größe eines Kaninchenauge ist ähnlich derjenigen eines menschlichen Auges. Unter Verwendung einer 30 G-Nadel, können Medikamente in die intrakamerale und intravitreale Räume von Kaninchenaugen injiziert werden. Die Augäpfel werden dann bis zur Analyse eingefroren und kann in den Humor aquosus, glasartiger und Retina / Choroidea unterteilt werden. Die Glaskörper und Retina / Choroidea Proben homogenisiert und vor der Analyse in Lösung gebracht werden. Dann können Immunoassays, die Konzentrationen intraokulare Arzneimittel in jeder Kammer zu messen, durchgeführt werden. Entsprechende pharmakokinetische Modelle können seinverwendet, um verschiedene Parameter, wie beispielsweise die Halbwertszeit und die maximale Konzentration des Arzneimittels zu berechnen. Kaninchen Augen können ein gutes Modell für Studien zur Pharmakokinetik von intraokularen Drogen sein.

Einleitung

Vor dem Aufkommen des intraokularen Arzneimittelabgabe, war das Hauptanliegen der medizinischen Therapie für intraokulare Erkrankungen die Effizienz, mit der das Medikament in das Auge eindringen könnten. Die Blut-Augen-Schranke verhindert, dass viele Stoffe, einschließlich Drogen, aus in das Auge diffundiert. Daher Konzentrationen von Arzneimitteln, die über therapeutische Mengen sind nicht leicht erhalten werden kann. Die intraokulare Arzneimittelverabreichungsmethode, einschließlich intrakamerale und intravitrealen Injektionen, können direkt umgehen , die Blut-Augen - Schranke ^1-3, so dass therapeutische Konzentrationen von Medikamenten können im Auge ^4,5 erreicht werden.

Dementsprechend hat die intravitreale Medikamentenabgabe eine beliebte Methode der Behandlung für mehrere intraokularen Erkrankungen ^5,6 geworden. Zum Beispiel wird intravitreale Injektion weithin für altersbedingte Makula - Degeneration, diabetischer Retinopathie, Netzhautvenenverschlüsse durchgeführt und intraokulare Infektionen ^7-10. Da insbesonderedie Einführung von Anti-VEGF-Medikamente, hat die Häufigkeit der intravitrealen Injektionen bemerkenswert für die Behandlung von Netzhauterkrankungen erhöht. Daher ist es wichtig, die intraokulare Pharmakokinetik solcher Arzneimittel zu verstehen, um die Wirksamkeit und Sicherheit der medizinischen Therapie zu bewerten.

Obwohl die intraokulare Verabreichung von Arzneimitteln ein großer Durchbruch in der medizinischen Therapie für Augenerkrankungen betrachtet wird, innerhalb des Augapfels die Arzneimittelkonzentration Überwachung ist technisch anspruchsvoll. Weil das menschliche Auge nur geringe Mengen an wässrigem Humor (etwa 200 ul) und glasigen (etwa 4,5 ml, Tabelle 1) enthalten, ist es technisch schwierig, ausreichende Mengen an Augenflüssigkeit erhalten , die Arzneimittelkonzentration zu messen. Weiterhin sind Verfahren, die die Augenflüssigkeit, wie beispielsweise Glaskörper Anzapfung oder vordere Kammer Parazentese werden verwendet, um zu erhalten, kann das Augengewebe schädigen und führen zu schwerwiegenden Komplikationen wie Katarakt, Endophthalmitis, oderNetzhautablösung ^11,12. Dementsprechend sind Tiermodelle in pharmakokinetischen Studien der am häufigsten verwendeten intraokularen Drogen ¹³ verwendet. Unter diesen Tiermodellen, Kaninchen oder Affen sind die am häufigsten verwendeten Tiere.

Kaninchen, die kleine Säugetiere der Ordnung Lagomorpha in der Familie Leporidae sind, sind in verschiedenen Teilen der Welt zu finden. Weil Kaninchen nicht aggressiv sind, sind sie leicht zu handhaben, die in einem Experiment verwenden, und zu beobachten. Niedrigere Kosten, gute Verfügbarkeit des Tieres, ähnlich Augengröße für den Menschen und eine große Datenbank mit Informationen zum Vergleich für Studien pharmakokinetischen Durchführung mit Kaninchenaugen. In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die pharmakokinetischen Studien von intraokularen Medikamente in Kaninchenaugen beschrieben.

Protokoll

Unser Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) von der Seoul National University Bundang Hospital, die in diesem Protokoll präsentiert alle Tierverfahren und Tierpflege Methoden zugelassen. Die IACUC ist in voller Übereinstimmung mit der achten Ausgabe der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (2011). Alle Verfahren wurden unter Einhaltung der Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research in Tieren durchgeführt. Einzelkäfige wurden zur Unterbringung der Kaninchen verwendet. Zusätzliche Chirurgie oder der Zubereitung vor , dieses Experiment durchgeführt (dh Sterilisation) ist möglicherweise nicht erforderlich.

1. intraokulare Injektion des Arzneimittels in Kaninchenaugen

1. Anästhesieren gesunden New Zealand white rabbits 1,5-2 kg mit einer intramuskulären Injektion eines Gemisches von Tiletamin-Hydrochlorid mit einem Gewicht und ZolazepamHydrochlorid (15 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid (5 mg / kg). Stellen Sie sicher, Anästhesie durch Überwachung der Augenlid (blink) Reflex oder Ohr kneifen.
   HINWEIS: Wenn eine intraokulare Medikament Augen Pigmente bindet, kann der Grad der Bindung induzieren Modifikation des Augen Pharmakokinetik des Medikaments. Zum Beispiel ist die Halbwertszeit eines Pigmentbinde Arzneimittels in den Glaskörper und wässrige Körpersäfte von pigmentierten Kaninchen erhöht werden kann , ¹⁴ in Albino Kaninchen verglichen. In diesem Fall können die Daten aus pigmentierten Kaninchenaugen erhalten mehr ähnlich und für das menschliche Auge als das menschliche Auge einen unterschiedlichen Grad der Pigmentierung und Albino-Kaninchen Augen darstellen können nicht menschlichen Pendants. Somit arzneimittel Pigment Wechselwirkung Berücksichtigung, die Verwendung von pigmentierten oder Albinokaninchen sollte sorgfältig betrachtet, und die Ergebnisse sind zusammen mit dem Stamm (Pigmentierung) von Kaninchen interpretiert werden. Allerdings sind Albino-Kaninchen für die Verwendung in Studien zum Vergleich der pharmakokinetischen Eigenschaften wie die d empfohlenTeppich-Pigment Wechselwirkung kann ein Störfaktor im Vergleich sein.
   1. Tragen Sie eine Lokalanästhetikum mit 1% Proparacainhydrochlorid ophthalmischen Augentropfen. Verwenden Tierarzt Salbe (2% Hydroxypropylmethylcellulose) Augentrockenheit, bis aus der Narkose zu verhindern.
      HINWEIS: Niemals das Kaninchen unbeaufsichtigt lassen, während betäubt.
2. Dilate die Schüler mit einem oder zwei Tropfen Phenylephrinhydrochlorid und Tropicamid.
3. Für chirurgische Vorbereitung vor der intraokulare Injektion gelten 5-10% PVP-Jod in die periokuläre Haut mit einem Wattestäbchen ^5. Geben Sie einen Tropfen von 5-10% PVP-Jod auf die Bindehaut des Auges.
4. Verwalten Sie die intraokulare Medikamente entweder intravitreal oder intrakameral unter aseptischen Bedingungen ^5.
   HINWEIS: Die Droge in den systemischen Kreislauf absorbiert kann auch das andere Auge eindringen. Wenn ein Medikament für beide Augen verabreicht wird, kann die Arzneimittelkonzentration in einem Auge durch in injizierte Medikament betroffendas andere Auge. Wenn bestätigt wird, daß die Wirkung der kontralateralen Injektion kann als Wirkstoff in den systemischen Kreislauf nicht vernachlässigt werden kann das andere Auge eindringen, die Verwendung von beiden Augen für die intraokulare Injektionen können in Betracht gezogen werden, da es wirtschaftlich ist und minimiert die Anzahl der Tiere geopfert die pharmakokinetischen Studien. Für pharmakokinetische Studie über systemische Konzentration folgenden intraokulare Injektion, die Verwendung von nur einem Auge geeignet ist.
   1. Für intravitrealen Injektionen, injizieren das Medikament intravitreal 1 mm hinter dem chirurgischen Limbus in superotemporalen Quadranten eine 30 G - Nadel und entweder kommerziell 1 ml Spritzen, Insulinspritzen oder Glasspritzen senkrecht zur Sklerafläche ^5.
      HINWEIS: Das Volumen der Droge für intrakamerale und intravitrealen Injektion verwendet wird, variiert von den Drogen zu untersuch abhängig. Für pharmakokinetischen Versuche an anti-VEGF-Agenten Kaninchenaugen verwenden, verwendet früheren Studien 0,025, 0,05 (am häufigsten) oder 0,1 ml von Bevacizumab oder Ranibizumab für die intrakamerale oder intravitreale Injektion. In unseren früheren Untersuchungen über intraokularen Pharmakokinetik von anti-vascular endothelial growth factor, 0,05 ml Bevacizumab ^15, 0,025 ml ranibizumab oder 0,03 ml VEGF-Trap - ¹⁶ verwendet wurden. Der größte sichere Volumen ohne paracentesis wird angenommen , dass 0,1 ml zu sein, obwohl es nur wenige Hinweise, dieses ¹⁷ zu unterstützen. Wenn übermäßige Volumen injiziert wird, entweder intrakameral oder intravitreal wird intraokularen Druck stark erhöht. Neben Schädigung des Sehnervs direkt durch erhöhten Augeninnendruck (IIOP) verursacht, nämlich glaukomatösen Schädigung des Sehnervs, im Extremfall die IIOP zu einer Beeinträchtigung der Augendurchblutung führt und zentrale Retinaarterienokklusion, die zu Schlaganfall im Gehirn analog ist.
   2. Für intracameral Injektionen injiziert das Medikament in die vordere Kammer durch eine 30 G Nadel durch die korneoskleralen Limbus mit der Abschrägung nach oben Einführen und Vorschieben es parallel zur Irisebene das Risiko eines Traumas der Iris oder der Linse zu minimieren.
      HINWEIS: In Abhängigkeit von der Arzneimittelformulierung, Nadeln größer als 30 G verwendet werden kann. Die Bedingungen erfordern größere-Gauge-Nadel umfassen Arzneimittel, enthaltend Mikrokügelchen, großProteinMedikamente und eine hohe Viskosität Formulierungen.
   3. Nach der Injektion komprimieren Applikator die Injektionsstelle mit einem sterilen Baumwollspitze um die Wundheilung zu fördern.
      HINWEIS: In der Regel 30 Sekunden ist genug für die Wundheilung, wenn eine 30-G-Nadel für intraokulare Injektion verwendet wird. Wenn jedoch eine größere Gauge-Nadel für die intraokulare Injektion verwendet wird, würde längere Zeit für Wunde geeignet sein Abdichten der Leckage von der Sklerotomie Wunde zu minimieren. Zur Prüfung auf Sklerotomie Wund Leckage ist wichtig sicherzustellen, dass die Menge der intraokulare Arzneimittel verwendet unmittelbar nach der intraokulare Injektion ist die gleiche wie die injizierte Menge, besonders wenn ein größerer Gauge-Nadel verwendet wird.
5. Beachten Sie die behandelten Kaninchen täglicheine Woche und einmal pro Woche danach, auf Anzeichen von schweren intraokularen Entzündung (konjunktivale Injektion und Hypopyon) bis Euthanasie.
   HINWEIS: Analgesics nach der Injektion nicht als intraokulare Injektion benötigt eine 30 G-Nadel ist ein minimal-invasives Verfahren, das nicht von postoperativen Schmerzen begleitet wird. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von den anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.

2. Probenvorbereitung

1. Für Enukleation, euthanize die Kaninchen zu verschiedenen Zeitpunkten (z. B. 1 Stunde oder 1, 2, 5, 9, 14 oder 30 Tage) nach der intraokularen Arzneimittelinjektion.
   HINWEIS: Diese Zeitpunkte sind abhängig von der Droge von Interesse und den bekannten pharmakokinetischen Profile. Für jeden Zeitpunkt, ¹³ mindestens zwei Augäpfel verwendet werden . Für eine zuverlässige Datenqualität sollten Probenahmezeit sorgfältig ausgewählt werden, mindestens vier Zeitpunkten mit einer ausgewogenen Probenahme für mindestens eine Zeitspanne von zwei Halbwertszeit des Medikaments ¹³ . Wir glauben, dass 6-8 Zeitpunkten mit symmetrischen Abtastung geeignet sein. Für kleine Moleküle (≤1,000 Da) ^18, insbesondere mehr als 1 - mal-Punkt während der ersten 24 h ist entscheidend. Dementsprechend wird für Makromoleküle (> 1.000 Da) ^18, eine Abtastperiode wie 1 Stunde und 1, 2, 5, 9, 14, und 30 Tage ¹⁹ kann eine gute Option sein. Für kleine Moleküle (≤1,000 Da), 1, 2, 4 und 8 Stunden und 1, 3 und 7 Tagen kann eine Option ²⁰ sein. Je nach dem Molekulargewicht kann die Abtastperiode weiter modifiziert werden.
   1. Für Euthanasie, verabreichen 10 ml 15% intravenösen KCl rasch nach Kaninchen, die mit einer intramuskulären Injektion eines Gemisches von Tiletamin-Hydrochlorid, Zolazepam Hydrochlorid (15 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid (5 mg / kg) betäubt.
2. Öffnen Sie die Lidspalte mit einem Augenlid Aufroller. Machen Sie eine 360 ​​° konjunktivaler Schnitt 2-3 mm hinter dem Limbus und erweitern sie posterior durch die c Sezierenonjunctiva und Kapsel des Tenon aus der ganzen Welt.
3. Schneiden Sie die Augenmuskeln der Nähe ihrer Einführung in der ganzen Welt. Spannen Sie den Sehnerv mit einer gebogenen Pinzette und dann schneiden Sie den Nerv zwischen der Zange und der ganzen Welt. Entfernen Sie den Augapfel selbst, während das umgebende Gewebe intakt bleibt. Nach Entkernung, gefrieren sofort die Augäpfel und lagern Sie sie bei -80 ° C.
   HINWEIS: Es für den sofortigen Einfrieren zwei Möglichkeiten sein kann. Wenn die Arzneimittelkonzentration in einem sehr frühen Phase gemessen wird (dh. Weniger als 1 Stunde), kann flüssiger Stickstoff geeignetere besser rechtzeitige Gefrieren des Augapfels zu gewährleisten. Doch für die Folgeperioden kann Eis verwendet werden, sofort den Augapfel zu kühlen, und dann Tiefkühler verwendet werden, können die Augäpfel bei -80 ° C zu lagern.
4. die Augäpfel für alle Zeitpunkte, trennen die gefrorenen Augäpfel in drei Kammern, der Glaskörper, die wßrige Humor und die Netzhaut / Choroidea dies genehmigt. Trennen Sie diese Fächer vor defrosting.
   HINWEIS: Der wichtigste Punkt für die Trennung in drei Kammern ist die Geschwindigkeit des Verfahrens. Der Augapfel sollte sehr schnell getrennt werden vor dem Auftauen und das Verfahren kann auf dem Eis durchgeführt werden Auftauen zu verzögern.
   1. Um den Globus öffnen, machen einen Schnitt an der Hornhautrand (300 ° oder mehr) mit einem Skalpell. Besorgen Sie sich die Tiefkühlkammer vor der Iris, der wässrigen Humor.
   2. Entfernen Sie die gefrorenen Iris und Linse durch Ziehen und wund Gewebe einer Pinzette. Wenn der Glaskörper zugänglich wird, sollten Sie den gefrorenen glasig durch sie von den übrigen Gewebe (Retina / Choroidea / Sklera) zu trennen.
   3. Mit einem No. 15 Skalpellklinge, trennen Sie die Netzhaut / Choroidea Gewebe aus dem darunterliegenden Lederhaut.
5. Für Immunoassays, auftauen, die wässrigen Humor Proben, und das Volumen jeder Probe zu messen. Messen, das Gewicht der gefrorenen Proben, die durch das Gewicht eines leeren Röhre von dem des Röhrchen mit t Subtrahierener gefrorene Probe.
   Hinweis: Da das spezifische Gewicht der gefrorenen Proben ungefähr 1 ist, kann das Gewicht jeder Probe verwendet werden, um das Volumen der Probe zu berechnen.
6. Wiegen Sie die Glaskörperproben, abzutauen, die Proben und solubilisieren sie in 1,0 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1% Rinderserumalbumin auf einem Rotator über Nacht bei 4 ° C. Zentrifuge Dann wurden die Proben bei 387 × g für 10 min ^21.
7. Wiegen Sie die gefrorenen Retina / Choroidea Proben zur Homogenisierung. Hinzufügen Protein Extraktionsreagenz mit einem Verhältnis von Gewebe zu Reagenz 1:10 (1 g Gewebe / 10 ml des Reagenz). Homogenisieren des Gewebes ein vorgekühltes Mikrohomogenisator verwenden. Zentrifugieren Sie die lysierte Probe für 10 min bei 12,000-20,000 xg und den Überstand zu einem gekühlten EPP Rohr.

3. Immunoassay

HINWEIS: Einige analytische Methoden kann für die Messung der Proteinkonzentration verwendet werden. Wählen Sie eine angemessene quantitative Verfahren, depending auf den Erfassungsbereich. Kurz gesagt, kann die ausgewählte Ionenüberwachungsmodus von HPLC Picogramm Ebenen Moleküls detektieren, während LC-MS / MS kann jeweils mit MRM / PRM Modus zum Profilieren Nanogramm- und Picogramm Niveaus des Proteins erkennen. Die Nachweisgrenze des ELISA wird als im Pikogramm-Niveau.

1. Für den indirekten Enzym-linked immunosorbent assays (ELISAs) Konzentrationen von anti-VEGF-Mittel zu messen, verwenden ELISA-Kits in 96-Well-Platten des Arzneimittels von Interesse zu erfassen, und eine Standardkurve von bekannten Wirkstoffkonzentrationen erzeugen.
   1. Verdünne den Glaskörper, den Humor aquosus, und die Netzhaut / Choroidea Proben mit 0,1% Rinderserumalbumin in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zu Konzentrationen, die im linearen Bereich liegen, und verwenden diese, für den Assay.
2. Teilen Sie die Proben in Aliquots auf der Platte bei 100 ul / Vertiefung. über Nacht bei 4 ° C inkubieren und dann die Platte dreimal mit 200 & mgr; l der Waschlösung von 0 waschen.05% Tween20 in 1x PBS.
   HINWEIS: Die anti-VEGF in der Probe vorhanden fungiert als primärer Antikörper für ELISA; daher zusätzliche Verwendung eines primären Antikörpers ist nicht erforderlich.
3. Verdünne den sekundären Antikörper zu 1: 20000 in 0,1% BSA in 1x PBS und mit 100 & mgr; l der verdünnten-Lösung pro Well. die Platte mit einer verdünnten sekundären Antikörper über Nacht bei 4 ° C, messen die optische Dichte bei 450 nm Wellenlänge Nach Inkubation. Ziehen Sie den Mittelwert Null Standard optische Dichte aus dem Durchschnitt der doppelten Messwerte für jeden Standard und Probe.
4. Erstellen einer Standardkurve basierend auf der relativen Lichtsignal von Lösungen des Wirkstoffs mit bekannten Konzentrationen, indem die Daten Reduzieren eines Vier-Parameter-Logistik (4-PL) Kurvenanpassung, wie SoftMax Pro unter Verwendung von Computersoftware erzeugen kann. Für eine Standardkurve zu erstellen, können die 4-PL-Kurvenanpassung mit einem Klick auf [4-Parameter] erhalten werden, in [Standardkurve] - [Fit].
5. Berechnen Sie die Wirkstoffkonzentration in den Proben from die Standardkurve.
   HINWEIS: Die Nachweisgrenzen (LOD) von anti-VEGF-Medikamente wurden in unserem Experiment untersucht. Die LOD von Bevacizumab war 0,024-3,125 ng / ml und die von Aflibercept war 0,039 bis 10 ng / ml.

4. Die pharmakokinetische Analyse-Methoden

HINWEIS: Für PK-Analyse kann man entweder Kompartment oder Nicht-Kompartment-Analyse verwendet werden. In Kompartment-Analyse, Disposition Verhalten von Molekülen durch eine Gleichung (Modell) erklärt werden. Somit kann compartmental PK-Analyse, die Konzentration zu jedem Zeitpunkt t vorhersagen, während die Nicht-Kompartment-Modell kann nicht Konzentrations-Zeit-Profile für andere Dosierungsschemata zu visualisieren oder vorherzusagen. Allerdings kann von Kompartment-Modellen passend ein komplexer und langwieriger Prozess sein. Im Gegensatz dazu sind Annahmen weniger restriktiv Nicht-Kompartment-Modell. Die Nicht-Kompartment Methode ist einfach und häufig verwendet, der pharmakokinetischen Parameter wie Halbwertszeit, Clearance und Verteilungsvolumen zu berechnen.Wir entschieden uns für compartmental Modelle für pharmakokinetische Studien zu Anti-VEGF-Mittel.

1. Analysieren Sie die Arzneimittelkonzentration Daten mit den Kompartment-Modellen Modellierungssoftware wie Phoenix WinNonlin-Software.
   1. Klicken Sie auf [PK-Modell] in [WNL5 klassische Modellierung] und ordnen Sie die Beobachtungszeit, verabreichten Dosis und Wirkstoffkonzentration im Menü [Setup].
   2. Wählen Sie Kompartment - Modell (zB Anzahl der Fächer) in der [Modellauswahl] Registerkarte und klicken Sie auf die [Ausführung] -Taste Modellparameter zu berechnen.
2. Nach den Analysen, wählen Sie das Modell letzte Abteil, das die Daten am besten Arzneimittelkonzentration auf der Grundlage folgender Kriterien beschrieben: (. ZB Standardfehler) (1) Akaike Information Criterion, (2) Genauigkeit von Parameterschätzungen, und (3) grafische Analyse (z. B. Anpassungsgüte Plots).
3. Berechnen pharmakokinetischen Parameter von Interesse, wie Halbwertszeit (T _1/2) und die Fläche unter der Zeit-Konzention Kurve (AUC), aus den Modellparametern und durch das Kompartment-Modell angetrieben Gleichungen.

Ergebnisse

Das Verfahren , das verwendet wird intravitreale Injektionen eines Arzneimittels von Interesse in Kaninchenaugen mit steriler Techniken durchzuführen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die behandelten Augen zu einem geplanten Zeitpunkt enukleiert und bei -80 ° C gelagert. Für die Analyse werden drei Fächer, Kammerwasser, die Glaskörper und der Retina / Choroidea, werden aus den gefrorenen Kaninchenaugen getrennt, wie in Abbildung 2 gezeigt. Die Proben ...

Diskussion

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zoletil	Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride	Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine)	Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide	Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165	R&D systems	293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer	SIGMA	C3041-50CAP
NUNC MICROWELL 96F                                                               W/LID NUNCLON D SI	Thermo SCIENTIFIC	167008	96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25grams(Net)	BOVOGEN	BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH7.4 (1X), 500mL	gibco	10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP)	abcam	ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent	SIGMA	C3228-50ML	lysis buffer
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #15
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #10
FEATHER SURGICAL BLADE STAINLESS STEEL	FEATHER	11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250mL	Thermo SCIENTIFIC	34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10X), 100mL	Thermo SCIENTIFIC	34062
Softmax Pro	Molecular Devices	v.5.4.1	software for generating standard curve
SAAM II	Saam Institute, Seattle, WA		software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin	Pharsight, Cary, NC	v. 6.3	software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab)	Genentech