안구 약의 약동학 연구에서 토끼 눈의 사용

요약

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

초록

자신의 전신 흡수를 최소화하면서 약물 투여의 안내 경로, 치료 약물의 높은 농도의 전달을 가능하게한다. 몇몇 약물은 전방 또는 유리체 내로 투여되고, 주사 안내 다양한​​ 안구 질환의 치료에 효과적이었다. 동물이 다른 포유 동물에 비해 취급이 용이하고 경제적이기 때문에 가토 널리 안과 연구에 사용되었고, 토끼 눈의 크기는 사람의 눈의 그것과 유사하다. 30 G 바늘을 사용하여, 약물은 토끼 눈의 전방 내 강내 공간으로 주입 될 수있다. 안구는 분석까지 동결되고, 방수, 유리체, 망막 / 맥락막으로 나눌 수 있습니다. 유리체 망막 / 맥락막 샘플을 균질화하고 분석하기 전에 가용화 할 수있다. 그리고, 면역 각 구획에서 인공 약물의 농도를 측정하기 위해 수행 될 수있다. 적절한 약물 동력 학적 모델 일 수있다이러한 반감기 및 약물의 최대 농도 등 여러 가지 파라미터를 계산하는 데 사용된다. 토끼의 눈은 안구 내 약물의 약동학 적 연구를위한 좋은 모델이 될 수 있습니다.

서문

안구 내 약물 전달의 출현 전에 안구 질환에 대한 의학적 치료의 주된 관심사는 약물이 눈에 침투 할 수있는 효율이었다. 혈액 - 눈 장벽은 눈에 확산, 마약 등 많은 물질을 방지 할 수 있습니다. 따라서, 치료 수준 위에있는 약물의 농도는 쉽게 얻을 수 없다. 약물의 치료 적 농도는 눈 ^4,5-에서 달성 될 수 있도록 전방 내 강내 주사를 포함하는 안구 내 약물 투여 방법은 수 직접 혈액 - 안구 ^장벽을 우회 ^1-3.

따라서, 유리체 강내 약물 전달은 여러 가지 안구 질환 ^5,6 치료의 인기있는 방법이되고있다. 예를 들어, 강내 주사 널리 연령 관련 황반 변성, 당뇨병 성 망막증, 망막 정맥 폐색, 및 안구 감염 ^7-10 행한다. 특히, 이후항 -VEGF 약물의 도입은, 강내 주사 주파수는 현저히 망막 질환의 치료에 증가했다. 따라서, 약물 치료의 효능 및 안전성을 평가하기 위해 이러한 약물의 약동학 안압을 이해하는 것이 중요하다.

약물의 안내 행정부가 안구 내 약물 농도를 모니터링 안구 질환에 대한 약물 치료에 중요한 돌파구로 간주되지만 기술적으로 요구하고있다. 인간의 눈은 방수 (약 200 μL) 및 유리질 (4.5 ㎖, 표 1)의 소량을 포함하기 때문에, 약물의 농도를 측정하는 안구 유체의 충분한 양을 획득하는 것은 기술적으로 곤란하다. 또한, 이러한 유리체 도청 또는 전방 천자로 눈 유체를 얻기 위해 사용하는 방법은, 안구 조직을 손상 및 백내장, 안내 염, 또는 심각한 합병증이 발생할 수 있습니다망막 박리 ^{(11, 12).} 따라서, 동물 모델은 일반적으로 사용되는 약물 안내 ^(13)의 약물 동력학 연구에 사용된다. 이러한 동물 모델 중에서, 토끼, 또는 원숭이는 가장 자주 사용되는 동물이다.

가족 토끼의 순서 토끼 목의 작은 포유류 토끼는 세계의 여러 부분에서 발견된다. 토끼 공격적인 없기 때문에, 그들은 처리 실험에서 사용하여 관찰하기 쉽다. 비용 절감, 인간 동물 유사한 아이 사이즈의 준비된 가용성 및 비교 호의 토끼 눈을 사용하여 약동학 연구를 수행하기위한 정보의 대형 데이터베이스. 본 논문에서는 토끼 눈의 안압 약의 약동학 적 연구를위한 프로토콜을 설명한다.

프로토콜

우리의 프로토콜은이 프로토콜에 제시된 동물 절차 및 동물 관리 방법을 모두 승인 분당 서울 대학교 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침을 따릅니다. IACUC는 실험 동물의 관리 및 사용 (2011)에 대한 안내서의 제 8 판을 완전히 준수에 있습니다. 모든 절차는 동물에서 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 정책 연구 협회의 가이드 라인을 준수하여 수행 하였다. 개별 케이지는 토끼를 주택에 사용 하였다. 추가 수술이나 준비이 실험을 수행하기 전에 (즉, 살균)이 필요하지 않을 수 있습니다.

토끼 눈에 약 1. 안구 내 주사

1. tiletamine 염산염과 zolazepam의 혼합물의 근육 내 주사로 1.5 kg 무게 건강한 뉴질랜드 흰 토끼를 마취염산염 (15 ㎎ / ㎏)와 자일 라진 하이드로 클로라이드 (/ kg 5 mg)을 얻었다. 수술법 (깜박임) 반사를 모니터링하거나 귀 핀치에 의해 마취를 확인합니다.
   참고 : 안압 약이 눈 안료에 결합하면 결합의 정도는 약물의 안구 약물 동태의 수정을 유도 할 수 있습니다. 예를 들어, 착색 된 토끼의 유리체 수성 체액에서 안료 결합 약물의 반감기를 증가 알비노 토끼 ^(14)이 비교 될 수있다. 인간의 눈은 인간의 대응을 표현하지 않을 수도 색소와 알비노 토끼 눈의 상이한 정도가이 경우, 착색 된 토끼의 눈으로부터 얻은 데이터는 인간의 눈에 더 유사하고 적용 할 수있다. 따라서, 약물 - 안료의 상호 작용을 고려하여, 착색이나 알비노 토끼의 사용은 신중하게 고려되어야하며, 그 결과는 토끼의 스트레인 (색소)와 함께 해석되어야한다. 그러나 흰둥이 토끼는 D로 약동학 적 특성을 비교 연구에 사용 권장양탄자 - 안료 상호 작용은 비교의 교란 요인이 될 수있다.
   1. 1 % proparacaine 염산염 안과 눈 방울과 국소 마취제를 적용합니다. 마취에서 회복 될 때까지 눈 건조를 방지하기 위해 수의사 연고 (2 % 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스)를 사용합니다.
      참고 : 마취 상태에서 무인 토끼를 두지 마십시오.
2. 페닐 염산염 tropicamide 한두 방울 동공 팽창.
3. 안압 주입하기 전에 수술 준비를 위해, 면봉 ^5와 눈 주위 피부에 5 ~ 10 %의 포비돈 - 요오드를 적용합니다. 눈의 결막에 5 ~ 10 %의 포비돈 - 요오드 한 방울을 놓습니다.
4. 무균 기술 ^5를 사용 중 유리체 강내 또는에 각막 안압 약을 관리 할 수 있습니다.
   참고 : 전신 순환에 흡수 된 약물은 또한 동료의 눈을 관통 할 수있다. 약물이 양쪽 눈에 투여하는 경우, 한쪽 눈의 약물 농도가 약물 주입에 의해 영향을받을 수있다다른 눈. 이 반대측 주입의 영향은 다른 눈을 관통 할 수없는 전신 순환 약물로 무시 될 수 있다고 확인 된 경우, 안구 주사 양안의 사용은 경제적으로 고려 동물의 수는 희생이 최소화 될 수있다 약동학 연구. 안내 주입 다음 전신 농도 약동학 연구를 위해, 오직 하나의 눈의 사용이 적절하다.
   1. 유리체 강내 주사의 경우, 공막면 ^(5)에 수직으로 30 G 바늘과 중 상업 1ml를 주사기, 인슐린 주사기, 또는 유리 주사기를 사용하여 유리체 강내 1mm 상이 측 사분면에서 수술 윤부 뒤에 약물을 주입.
      참고 : 전방 내 및 유리체 강내 주입에 사용되는 약물의 양이 조사에서 약물에 따라 달라집니다. 토끼 눈을 사용하여 안티 VEGF 요원에 대한 약동학 실험을 위해, 이전의 연구는 0.025, 0.05 (가장 일반적), 0.1 m를 사용전방 내 또는 유리체 강내 주입 베바 시주 맙 또는 라니 비주 맙의 리터. 항 - 혈관 내피 세포 성장 인자, 베바 시주 맙 ^(15)의 0.05 ㎖, VEGF 트랩 ¹⁶ 0.025 라니 비주 맙의 ㎖, 0.03 ml로 안내 약동학에 우리의 이전 연구에 사용 하였다. 이 ^{(17)을지지하는} 증거가되었지만 천자없이 안전하게 큰 부피를 0.1 ml의 것으로 생각된다. 과도한 양이 어느 하나에 각막 또는 유리체 강내 주입되면 안압이 크게 증가된다. IIOP는 뇌의 뇌졸중과 유사 손상된 안구 혈류 및 망막 중심 동맥 폐쇄, 리드 극단적 인 경우에 직접 안압 상승 (IIOP)에 의한 시신경 손상, 즉 녹내장 성 시신경 손상,뿐만 아니라.
   2. 전방 내 주사의 경우, 최대 경사와 공막 윤부를 통해 30 G 바늘을 삽입하고 그것을 씩 전진하여 전방에 약물을 주입홍채 렌즈 또는 외상의 위험을 최소화하기 위해 조리개 평면 rallel.
      주 : 약물 제형에 따라보다 큰 30 G 사용할 수 바늘. 큰 게이지 바늘을 필요로하는 조건은 약물 함유 미립자 큰 단백질 약물, 고점도 조성물을 포함한다.
   3. 주사 후 상처 치유를 촉진하기 위해 멸균 솜 팁 어플리케이터 주사 부위를 압축합니다.
      참고 : 일반적으로 30 초 30 G 바늘이 안구 내 주사에 사용되는 상처 치유를위한 충분하다. 큰 게이지 주사 바늘이 안구에 사용되는 경우, 더 긴 시간은 공막 상처로부터의 누설을 최소화하기 위해 밀봉 부상에 적합 할 것이다. 공막 상처 누설을 확인하기 위해서는 더 큰 게이지 바늘을 사용하는 경우 특히 안압 주사 후 즉시 사용 안내 약물의 양이 주입량과 동일 함을 보장하는 것이 중요하다.
5. 매일 처리 토끼에 대한 관찰일주, 그리고 이후 일주일에 한 번, 심한 안구 내 염증 (결막 충혈 및 전방 축 농과)의 징후가 안락사까지.
   참고 : 주사 후 진통제는 30 G 바늘은 수술 후 통증을 동반하지 않는 최소 침습 절차 이용 안내 주입이 필요하지 않습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.

2. 샘플 준비

1. 적출의 경우, 안내 약물 주입 후 다양한 시점에서 토끼 (예., 1 시간, 1, 2, 5, 9, 14 일 또는 30 일)에 안락사.
   참고 :이 시점이 관심의 약물 및 알려진 약동학 적 프로파일에 따라 달라집니다. 각각의 시간 지점에 대한 적어도 2 개의 안구 ^{(13)를 사용한다.} 신뢰성있는 데이터에 대해, 샘플링 시간은 약 ¹³ 개의 반감기의 적어도 시간 간격에서 균형 샘플링 신중 적어도 네 번 포인트를 선택해야 SUP. 우리는 균형 잡힌 샘플링 6-8 시간 포인트가 적합 할 수 있다고 생각합니다. 특히 소분자 (≤1,000 다) ^(18)의 경우, 제 24 시간 동안 1 개 이상의 시간 지점은 매우 중요하다. 따라서,에 대한 고분자 (> 1000 다) ¹⁸ 샘플링주기 등으로 1 시간 및 1, 2, 5, 9, 14, 30 일 ^(19)는 좋은 선택 일 수있다. 소분자 (≤1,000 다), 1, 2, 4, 8 시간 및 1, 3, 7 일간 하나의 옵션 ⁽²⁰⁾ 일 수있다. 분자량에 따라 샘플링주기가 더 변형 될 수있다.
   1. 안락사 빠르게 tiletamine 염산 zolazepam 염산염 (15 ㎎ / ㎏)와 자일 라진 하이드로 클로라이드 (/ kg 5 mg)의 혼합물을 근육 주사로 토끼를 마취 한 후 15 % 정맥 KCl을 10 ml의 관리.
2. 일말의 트랙터와 안 검열을 엽니 다. 윤부에 360 ° 결막 절개 2-3mm 후방을 확인하고 C를 해부하여 후방 연장onjunctiva과 세계에서 장부의 캡슐.
3. 전 세계에 자신의 삽입에 가까운 안구 근육을 잘라. 곡선 집게로 시신경을 고정하고 집게와 세계 사이의 신경을 잘라. 그대로 주변 조직을 떠나있는 동안 안구 자체를 제거합니다. 안구 적출술 후 즉시 시선을 고정하고 -80 ° C에 저장합니다.
   주 : 즉시 동결에 대한 두 가지 옵션이있을 수 있습니다. 약물 농도가 매우 초기 단계에서 측정되는 경우 (예. 1 시간 미만), 액체 질소는 안구의 더 나은 적시 동결을 보장하는 것이 더 적절할 수있다. 그러나, 후속 기간 동안 얼음 즉시 안구를 냉각하는 데 사용될 수 있으며, 그러면 냉동고는 -80 ° C에서 시선을 저장하는 데 사용될 수있다.
4. 시간의 모든 지점에 대해 시선을 얻은 후, 세 개의 구획, 유리체, 방수 내, 망막 / 맥락막에 냉동 시선을 분리한다. defros 전에 이러한 구획을 분리팅.
   주 : 세 구획으로 분리를위한 가장 중요한 포인트는 절차의 속도이다. 안구는 매우 빠르게 해동 전에 분리되어야하고, 해동 과정을 지연 얼음에 수행 될 수있다.
   1. 세계를 열려면, 메스 블레이드와 각막 윤부 (300 ℃ 이상)에서 절개를합니다. 홍채, 수성 유머 앞에 얼어 붙은 함을 얻습니다.
   2. 당기 및 조직 집게를 사용 통렬하게 비판하여 고정 조리개와 렌즈를 제거합니다. 유리체에 액세스 할 수있게되면, 남아있는 조직 (망막 / 맥락막 / 공막)에서 분리하여 냉동 유리체을 구하십시오.
   3. 호 메스 (15) 블레이드를 사용하여, 하부 공막에서 망막 / 맥락막 조직을 분리한다.
5. 면역 들어, 방수 샘플을 해동하고, 각 샘플의 체적을 측정한다. 튜브 함유 t에서의 빈 튜브의 중량을 뺀 동결 시료의 중량을 측정하여그는 샘플을 동결.
   주 : 동결 시료의 비중이 대략 1이기 때문에, 각 시료의 중량을 시료의 양을 계산하는데 사용될 수있다.
6. 상기 유리체 샘플 무게 샘플을 해동하고, 밤새 4 ℃에서 회 전자의 1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염 완충 염수 중 1.0 ㎖에 용해들을. 그런 다음, 10 분 ²¹ 387 XG에서 샘플을 원심 분리기.
7. 균질화를위한 냉동 망막 / 맥락막 샘플을 달아. 1시 10분 (조직 1g / 시약 10 ㎖)의 시약 조직의 비율로 단백질 추출 시약을 추가한다. 미리 냉각 microhomogenizer를 사용하여 조직을 균질화. 12,000-20,000 XG에서 10 분 동안 용해 샘플을 원심 분리기 및 냉장 EPP 튜브에 뜨는을 전송합니다.

3. 면역

주 : 여러 분석 방법은 단백질 농도 측정을 위해 사용될 수있다. D, 적절한 정량적 인 방법을 선택합니다감지 범위에 epending. LC-MS / MS는 각각 MRM / PRM 모드 프로파일에 대한 단백질의 나노 그램과 피코 레벨을 검출 할 수있는 반면, 간단히, HPLC 선택된 이온 모니터링 모드는 피코 그램 분자의 수준을 검출 할 수있다. ELISA의 검출 한계는 피코 그램 수준으로 간주된다.

1. 간접 효소 면역 분석법 (ELISA를)의 경우, 항 VEGF 제의 농도를 측정하기 위해 관심있는 약물을 검출하고 공지 된 약물의 농도는 표준 곡선을 생성하는 96- 웰 플레이트에서 ELISA 키트를 사용한다.
   1. 유리체의 방수 및 선형 범위 내에 농도 1X 인산 완충 식염수 (PBS) 중 0.1 % 소 혈청 알부민으로 망막 / 맥락막 샘플을 희석하고, 분석을 위해 이들을 사용한다.
2. 잘 / 100 μL에서 접시에 분취에 샘플을 나눕니다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 한 후, 플레이트를 0 세정 용액 200 μl를 사용하여 세 번 세척 하였다.1X PBS에서 05% 트윈 20.
   참고 : ELISA에 대한 일차 항체로 샘플 행위의 방지 VEGF 존재; 따라서, 차 항체의 추가 사용이 필요하지 않습니다.
3. 1X PBS에서 20,000 0.1의 %의 BSA를 잘 당 희석-용액 100 μl를 추가 : 1로 차 항체를 희석. 4 ℃에서 하룻밤 동안 희석 된 이차 항체와 함께 플레이트를 배양 한 후 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정한다. 각각의 표준 및 샘플 중복 측정 값의 평균에서 평균 제로 표준 광학 밀도를 뺍니다.
4. 이러한 프로 소프트 맥스 등의 4- 파라미터 로지스틱 (4- PL) 곡선 맞춤을 생성 할 수있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 데이터를 감소 알려진 농도의 약물 용액에서 상대적 광 신호에 기초하여 표준 곡선을 생성한다. [맞춤] - 표준 곡선을 작성하는 경우, 4 PL 곡선 맞춤은 [표준 곡선]의 [4- 파라미터] 클릭함으로써 획득 될 수있다.
5. 견본 FR의 약물 농도를 계산표준 곡선을 옴.
   주 : 항 -VEGF 약물의 검출 한계 (LOD)를 본 실험에서 연구 하였다. 베바 시주 맙의 LOD는 ml의 0.024-3.125 NG /했고 aflibercept의는 0.039-10 ng를 / ㎖이었다.

4. 약동학 적 분석 방법

주 : PK 분석을 위해, 하나는 구획되지 또는 구획되지 않은 분석 중 하나를 사용할 수있다. 구획되지 분석에서 분자의 배열 동작은 방정식 (모델)에 의해 설명 될 수있다. 구획되지 않은 모델을 시각화 또는 다른 투여 요법에 대한 농도 - 시간 프로파일을 예측할 수없는 반면에 따라서, 구획되지 PK 분석은 시간 t에서의 농도를 예측할 수있다. 그러나, 구획되지 모델의 피팅은 복잡하고 긴 과정이 될 수 있습니다. 대조적으로, 가정 구획되지 않은 모델에서 덜 제한적이다. 비 구획되지 방법은 간단하며 반감기가 클리어런스 및 분포 부피 등의 약물 동력학 파라미터를 계산하기 위해 일반적으로 사용된다.우리는 안티 VEGF 요원에 대한 약동학 연구에 구획되지 모델을 선택했다.

1. 이러한 피닉스 WinNonlin 소프트웨어로서 모델링 소프트웨어를 사용하여 구획되지 모델 약물 농도 데이터를 분석한다.
   1. [WNL5 클래식 모델]에서 [PK 모델]를 클릭하고 [설정] 메뉴에서 관측 시간, 투여 용량, 및 약물 농도를 매핑합니다.
   2. 에서 [모델 선택] 탭에서 (예를 들어, 구획 수) 구획되지 모델을 선택하고 모델 매개 변수를 계산하기 위해 [실행] 버튼을 클릭합니다.
2. (. 예를 들어, 표준 에러) (1) 아카 이케 정보 기준 (2) 파라미터 추정의 정밀도, 및 (3) 그래픽 분석 : 분석 한 결과, 가장 아래의 기준에 따라 약물 농도 데이터를 설명하는 최종 구획 모델을 선택 (예., 맞는 그래프의 선 (善)).
3. 같은 시간에 집중하고 아래의 반감기 (T _1/2) 및 지역 관심의 약물 동태 학적 파라미터를 계산구획되지 모델에 의해 구동되는 모델 파라미터 방정식으로부터 기 곡선 (AUC).

결과

무균 기법 가토 관심 약물의 체내 주사를 실시하는 데 사용되는 방법은도 1에 도시되어있다. 처리 된 눈 예약 된 시간에 적출하고 -80 ℃에서 보관한다. 그림 2에서 입증 된 바와 같이 분석, 세 개의 구획, 수성 유머, 유리체, 망막 / 맥락막를 들어, 냉동 토끼 눈에서 분리된다. 구획의 샘플은 ELISA에 대 한 준비가되어 있습니다. 이차 항체와 함께 배양...

토론

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zoletil	Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride	Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine)	Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide	Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165	R&D systems	293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer	SIGMA	C3041-50CAP
Nunc Microwell 96F w/lid Nunclon D Si	Thermo SCIENTIFIC	167008	96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25 g(Net)	BOVOGEN	BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 (1x), 500 ml	gibco	10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP)	abcam	ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent	SIGMA	C3228-50ML	lysis buffer
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #15
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #10
Feather surgical blade stainless steel	FEATHER	11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250 ml	Thermo SCIENTIFIC	34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10x), 100 ml	Thermo SCIENTIFIC	34062
Softmax Pro	Molecular Devices	v.5.4.1	software for generating standard curve
SAAM II	Saam Institute, Seattle, WA		software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin	Pharsight, Cary, NC	v. 6.3	software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab)	Genentech