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Method Article
Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.
자신의 전신 흡수를 최소화하면서 약물 투여의 안내 경로, 치료 약물의 높은 농도의 전달을 가능하게한다. 몇몇 약물은 전방 또는 유리체 내로 투여되고, 주사 안내 다양한 안구 질환의 치료에 효과적이었다. 동물이 다른 포유 동물에 비해 취급이 용이하고 경제적이기 때문에 가토 널리 안과 연구에 사용되었고, 토끼 눈의 크기는 사람의 눈의 그것과 유사하다. 30 G 바늘을 사용하여, 약물은 토끼 눈의 전방 내 강내 공간으로 주입 될 수있다. 안구는 분석까지 동결되고, 방수, 유리체, 망막 / 맥락막으로 나눌 수 있습니다. 유리체 망막 / 맥락막 샘플을 균질화하고 분석하기 전에 가용화 할 수있다. 그리고, 면역 각 구획에서 인공 약물의 농도를 측정하기 위해 수행 될 수있다. 적절한 약물 동력 학적 모델 일 수있다이러한 반감기 및 약물의 최대 농도 등 여러 가지 파라미터를 계산하는 데 사용된다. 토끼의 눈은 안구 내 약물의 약동학 적 연구를위한 좋은 모델이 될 수 있습니다.
안구 내 약물 전달의 출현 전에 안구 질환에 대한 의학적 치료의 주된 관심사는 약물이 눈에 침투 할 수있는 효율이었다. 혈액 - 눈 장벽은 눈에 확산, 마약 등 많은 물질을 방지 할 수 있습니다. 따라서, 치료 수준 위에있는 약물의 농도는 쉽게 얻을 수 없다. 약물의 치료 적 농도는 눈 4,5-에서 달성 될 수 있도록 전방 내 강내 주사를 포함하는 안구 내 약물 투여 방법은 수 직접 혈액 - 안구 장벽을 우회 1-3.
따라서, 유리체 강내 약물 전달은 여러 가지 안구 질환 5,6 치료의 인기있는 방법이되고있다. 예를 들어, 강내 주사 널리 연령 관련 황반 변성, 당뇨병 성 망막증, 망막 정맥 폐색, 및 안구 감염 7-10 행한다. 특히, 이후항 -VEGF 약물의 도입은, 강내 주사 주파수는 현저히 망막 질환의 치료에 증가했다. 따라서, 약물 치료의 효능 및 안전성을 평가하기 위해 이러한 약물의 약동학 안압을 이해하는 것이 중요하다.
약물의 안내 행정부가 안구 내 약물 농도를 모니터링 안구 질환에 대한 약물 치료에 중요한 돌파구로 간주되지만 기술적으로 요구하고있다. 인간의 눈은 방수 (약 200 μL) 및 유리질 (4.5 ㎖, 표 1)의 소량을 포함하기 때문에, 약물의 농도를 측정하는 안구 유체의 충분한 양을 획득하는 것은 기술적으로 곤란하다. 또한, 이러한 유리체 도청 또는 전방 천자로 눈 유체를 얻기 위해 사용하는 방법은, 안구 조직을 손상 및 백내장, 안내 염, 또는 심각한 합병증이 발생할 수 있습니다망막 박리 (11, 12). 따라서, 동물 모델은 일반적으로 사용되는 약물 안내 (13)의 약물 동력학 연구에 사용된다. 이러한 동물 모델 중에서, 토끼, 또는 원숭이는 가장 자주 사용되는 동물이다.
가족 토끼의 순서 토끼 목의 작은 포유류 토끼는 세계의 여러 부분에서 발견된다. 토끼 공격적인 없기 때문에, 그들은 처리 실험에서 사용하여 관찰하기 쉽다. 비용 절감, 인간 동물 유사한 아이 사이즈의 준비된 가용성 및 비교 호의 토끼 눈을 사용하여 약동학 연구를 수행하기위한 정보의 대형 데이터베이스. 본 논문에서는 토끼 눈의 안압 약의 약동학 적 연구를위한 프로토콜을 설명한다.
우리의 프로토콜은이 프로토콜에 제시된 동물 절차 및 동물 관리 방법을 모두 승인 분당 서울 대학교 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침을 따릅니다. IACUC는 실험 동물의 관리 및 사용 (2011)에 대한 안내서의 제 8 판을 완전히 준수에 있습니다. 모든 절차는 동물에서 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 정책 연구 협회의 가이드 라인을 준수하여 수행 하였다. 개별 케이지는 토끼를 주택에 사용 하였다. 추가 수술이나 준비이 실험을 수행하기 전에 (즉, 살균)이 필요하지 않을 수 있습니다.
토끼 눈에 약 1. 안구 내 주사
2. 샘플 준비
3. 면역
주 : 여러 분석 방법은 단백질 농도 측정을 위해 사용될 수있다. D, 적절한 정량적 인 방법을 선택합니다감지 범위에 epending. LC-MS / MS는 각각 MRM / PRM 모드 프로파일에 대한 단백질의 나노 그램과 피코 레벨을 검출 할 수있는 반면, 간단히, HPLC 선택된 이온 모니터링 모드는 피코 그램 분자의 수준을 검출 할 수있다. ELISA의 검출 한계는 피코 그램 수준으로 간주된다.
4. 약동학 적 분석 방법
주 : PK 분석을 위해, 하나는 구획되지 또는 구획되지 않은 분석 중 하나를 사용할 수있다. 구획되지 분석에서 분자의 배열 동작은 방정식 (모델)에 의해 설명 될 수있다. 구획되지 않은 모델을 시각화 또는 다른 투여 요법에 대한 농도 - 시간 프로파일을 예측할 수없는 반면에 따라서, 구획되지 PK 분석은 시간 t에서의 농도를 예측할 수있다. 그러나, 구획되지 모델의 피팅은 복잡하고 긴 과정이 될 수 있습니다. 대조적으로, 가정 구획되지 않은 모델에서 덜 제한적이다. 비 구획되지 방법은 간단하며 반감기가 클리어런스 및 분포 부피 등의 약물 동력학 파라미터를 계산하기 위해 일반적으로 사용된다.우리는 안티 VEGF 요원에 대한 약동학 연구에 구획되지 모델을 선택했다.
무균 기법 가토 관심 약물의 체내 주사를 실시하는 데 사용되는 방법은도 1에 도시되어있다. 처리 된 눈 예약 된 시간에 적출하고 -80 ℃에서 보관한다. 그림 2에서 입증 된 바와 같이 분석, 세 개의 구획, 수성 유머, 유리체, 망막 / 맥락막를 들어, 냉동 토끼 눈에서 분리된다. 구획의 샘플은 ELISA에 대 한 준비가되어 있습니다. 이차 항체와 함께 배양...
With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...
The authors have no conflicts of interest to disclose.
We would like to thank Ms. Ji Hyun Park and Ji Yeon Park for their technical assistance in the animal experiments. This work was supported by a grant from the Seoul National University Bundang Hospital Research Fund (grant number: Grant No. 14-2014-022) and from a grant (CCP-13-02-KIST) from the Convergence Commercialization Project of the National Research Council of Science and Technology, Seoul, Korea.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zoletil | Virbac Laboratories, Carros Cedex, France | ||
Xylazine hydrochloride | Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA | ||
Proparacaine hydrochloride (Alcaine) | Alcon laboratories, Fort Worth, TX | ||
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide | Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan | ||
Recombinant Human VEGF 165 | R&D systems | 293-VE-050 | |
Carbobate-Bicarbonate buffer | SIGMA | C3041-50CAP | |
NUNC MICROWELL 96F W/LID NUNCLON D SI | Thermo SCIENTIFIC | 167008 | 96 well plate |
Bovine Serum Albumin (BSA) 25grams(Net) | BOVOGEN | BSA025 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH7.4 (1X), 500mL | gibco | 10010-023 | |
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-28652 | |
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP) | abcam | ab97225 | |
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo SCIENTIFIC | PA1-85183 | |
CelLytic MT Cell Lysis Reagent | SIGMA | C3228-50ML | lysis buffer |
100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #15 | |
100 Scalpel Blades | nopa instruments | BLADE #10 | |
FEATHER SURGICAL BLADE STAINLESS STEEL | FEATHER | 11 | |
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250mL | Thermo SCIENTIFIC | 34018 | |
Stable Peroxide Substrate Buffer (10X), 100mL | Thermo SCIENTIFIC | 34062 | |
Softmax Pro | Molecular Devices | v.5.4.1 | software for generating standard curve |
SAAM II | Saam Institute, Seattle, WA | software for pharmacokinetic modeling | |
Phoenix WinNonlin | Pharsight, Cary, NC | v. 6.3 | software for pharmacokinetic modeling |
Avastin (bevacizumab) | Genentech |
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