Utilisation des yeux de lapin dans des études pharmacocinétiques de intraoculaires Drugs

Résumé

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Résumé

La voie intra-oculaire d'administration du médicament permet de délivrer des concentrations élevées de médicaments thérapeutiques, tout en minimisant l'absorption systémique. Plusieurs médicaments sont administrés dans la chambre antérieure ou vitreuse, et l'injection intra-oculaire a été efficace dans le traitement de diverses maladies intraoculaires. des yeux de lapin ont été largement utilisés pour la recherche ophtalmique, lorsque l'animal est facile à manipuler et plus économique par rapport à d'autres mammifères, ainsi que la taille d'un oeil de lapin est similaire à celle d'un oeil humain. En utilisant une aiguille 30 G, les médicaments peuvent être injectés dans les espaces intracamérulaire et intravitréennes d'yeux de lapin. Les globes oculaires sont ensuite congelés jusqu'à l'analyse, et peuvent être divisés dans l'humeur aqueuse, vitreux, et de la rétine / choroïde. Les échantillons vitreux et de la rétine / choroïde peuvent être homogénéisés et solubilisés avant l'analyse. Ensuite, les dosages immunologiques peuvent être effectuées pour mesurer les concentrations de médicaments intraoculaires dans chaque compartiment. modèles pharmacocinétiques appropriés peuvent êtreutilisés pour le calcul de plusieurs paramètres, tels que la demi-vie et la concentration maximale du médicament. yeux de lapin peut être un bon modèle pour les études de pharmacocinétique des médicaments intraoculaires.

Introduction

Avant l'avènement de la délivrance de médicaments intraoculaire, la principale préoccupation de la thérapie médicale pour les maladies intraoculaires était l'efficacité avec laquelle le médicament pourrait pénétrer dans l'œil. La barrière hémato-oculaire empêche de nombreuses substances, y compris les médicaments, de diffuser dans l'œil. Par conséquent, les concentrations de médicaments qui sont au-dessus des niveaux thérapeutiques ne peuvent pas être facilement obtenus. La méthode d'administration de médicament intraoculaire, y compris intracamérulaire et intravitréennes injections, peut directement contourner la barrière hémato-oculaire ^1-3, de sorte que les concentrations thérapeutiques des médicaments peuvent être atteints dans l'oeil ^4,5.

En conséquence, l' administration de médicaments intravitréenne est devenu une méthode populaire de traitement pour plusieurs maladies intraoculaires ^5,6. Par exemple, l' injection intravitréenne est largement réalisée pour la dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique, occlusions veineuses rétiniennes, et les infections intraoculaires ^7-10. En particulier, étant donné quel'introduction de médicaments anti-VEGF, la fréquence des injections intravitréennes a remarquablement augmenté pour le traitement des maladies de la rétine. Par conséquent, il est important de comprendre la pharmacocinétique de ces médicaments intraoculaires pour évaluer l'efficacité et l'innocuité de la thérapie médicale.

Bien que l'administration intra-oculaire de médicaments est considérée comme une percée majeure dans le traitement médical pour les maladies oculaires, la surveillance de la concentration de médicament dans le globe oculaire est techniquement exigeant. Étant donné que l' oeil humain ne contiennent que de petites quantités d'humeur aqueuse (environ 200 ul) et vitreux (environ 4,5 ml, tableau 1), il est techniquement difficile d'obtenir des quantités suffisantes de fluide oculaire pour mesurer la concentration du médicament. En outre, les méthodes qui sont utilisées pour obtenir le fluide oculaire, comme taraudage vitreux ou la chambre antérieure paracentèse, peuvent endommager le tissu oculaire et entraîner des complications graves, telles que la cataracte, endophtalmie, oudécollement de la rétine ^11,12. En conséquence, les modèles animaux sont utilisés dans des études pharmacocinétiques de médicaments intraoculaires couramment utilisés ^13. Parmi ces modèles animaux, des lapins ou des singes sont les animaux les plus fréquemment utilisés.

Les lapins, qui sont de petits mammifères de l'ordre des lagomorphes dans la famille des léporidés, se retrouvent dans plusieurs parties du monde. Parce que les lapins ne sont pas agressifs, ils sont faciles à manipuler, utiliser dans une expérience, et d'observer. Réduction des coûts, disponibilité de l'animal, la taille des yeux semblables aux humains, et une grande base de données de comparaison favorable d'effectuer des études pharmacocinétiques à l'aide des yeux de lapin. Dans cet article, un protocole pour les études de pharmacocinétique des médicaments intraoculaires dans les yeux de lapin est décrit.

Protocole

Notre protocole suit les lignes directrices de l'Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) de l'hôpital Bundang Université nationale de Séoul, qui a approuvé l'ensemble des procédures animales et les méthodes de protection des animaux présentés dans ce protocole. Le IACUC est en pleine conformité avec la huitième édition du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (2011). Toutes les procédures ont été réalisées avec le respect des lignes directrices de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research chez les animaux. Les cages individuelles ont été utilisées pour le logement des lapins. La chirurgie ou de la préparation supplémentaire avant d'effectuer cette expérience (ie, stérilisation) peut ne pas être nécessaire.

1. Injection intraoculaire du médicament dans les yeux de lapin

1. Anesthésier des lapins blancs de Nouvelle-Zélande en bonne santé pesant 1,5-2 kg avec une injection intramusculaire d'un mélange de chlorhydrate de tilétamine et zolazépamchlorhydrate (15 mg / kg) et de chlorhydrate de xylazine (5 mg / kg). Vérifier l'anesthésie en surveillant le palpébrale (blink) réflexe ou l'oreille pincée.
   NOTE: Si un médicament intraoculaire se lie à des pigments oculaires, le degré de liaison peut induire une modification de la pharmacocinétique oculaire de la drogue. Par exemple, la demi-vie d'un médicament de pigment de liaison dans les humeurs vitreuses et aqueuses de lapins pigmentés peut être augmenté par rapport à celle des lapins albinos ^14. Dans ce cas, les données obtenues à partir des yeux de lapin pigmentées peuvent être plus semblables et applicable aux yeux humains que les yeux humains ont un degré de pigmentation et de lapin albinos yeux différents ne peuvent pas représenter leurs homologues humains. Ainsi, compte tenu de l'interaction médicament-pigment, l'utilisation de lapins pigmentés ou albinos doit être soigneusement examiné et les résultats doivent être interprétés avec la souche (pigmentation) de lapin. Cependant, les lapins albinos sont recommandés pour une utilisation dans les études comparant les propriétés pharmacocinétiques comme dinteraction tapis-pigment peut être un facteur de confusion dans la comparaison.
   1. Appliquer un anesthésique topique avec 1% de chlorhydrate de proparacaine gouttes ophtalmiques ophtalmique. Utilisez vétérinaire pommade (2% hydroxypropylméthylcellulose) pour prévenir la sécheresse oculaire jusqu'à la récupération de l'anesthésie.
      NOTE: Ne jamais laisser le lapin sans surveillance pendant anesthésiés.
2. Dilater la pupille avec une ou deux gouttes de chlorhydrate de phényléphrine, le tropicamide et.
3. Pour la préparation chirurgicale avant l'injection intra - oculaire, appliquer 5-10% povidone-iode à la peau périoculaire avec un coton - tige ^5. Placer une goutte de 5 à 10% povidone-iode sur la conjonctive de l'oeil.
4. Administrer les médicaments intraoculaires soit par voie intravitréenne ou intracamérulaire utilisant des techniques aseptiques ^5.
   NOTE: Le médicament absorbé dans la circulation systémique peut également pénétrer l'autre œil. Lorsqu'un médicament est administré aux deux yeux, la concentration de médicament dans un oeil peut être affectée par la drogue injectée dansl'autre œil. S'il est confirmé que l'effet de l'injection controlatérale peut être négligé comme médicament dans la circulation systémique ne peut pas pénétrer dans l'autre oeil, l'utilisation des deux yeux pour les injections intra-oculaires peut être envisagée, car il est économique et réduit au minimum le nombre d'animaux sacrifiés pour les études pharmacocinétiques. Pour l'étude pharmacocinétique sur la concentration systémique après injection intra-oculaire, l'utilisation d'un seul œil est approprié.
   1. Pour les injections intravitréennes, injecter le médicament par voie intravitréenne 1 mm en arrière du limbe chirurgical dans le quadrant supéro en utilisant une aiguille 30 G , et soit commerciales seringues de 1 ml, des seringues d'insuline ou de seringues en verre , perpendiculairement à la surface sclérale ^5.
      NOTE: Le volume de médicament utilisé pour l'injection intracamérulaire et intravitréenne varie selon les médicaments sous enquête. Pour pharmacocinétiques expériences sur les agents anti-VEGF à l'aide des yeux de lapin, des études antérieures utilisées 0,025, 0,05 (le plus courant), soit 0,1 ml de bevacizumab ou ranibizumab pour l'injection intracamérulaire ou intravitréenne. Dans nos études précédentes sur la pharmacocinétique intra - oculaire du facteur de croissance endothélial anti vasculaire, 0,05 ml de ¹⁵ bévacizumab, 0,025 ml de ranibizumab, ou 0,03 ml de VEGF Trap ¹⁶ ont été utilisés. Le plus grand volume sûr sans paracentèse est considéré comme 0,1 ml, bien qu'il y ait eu peu de preuves à l' appui ^17. Si un volume excessif est injecté par voie intravitréenne ou intracamérulaire soit, la pression intra-oculaire est fortement augmentée. En plus des dommages du nerf optique directement causé par l'augmentation de la pression intraoculaire (IIOP), à savoir glaucomateux lésions du nerf optique, dans les cas extrêmes, le IIOP conduit à perfusion oculaire avec facultés affaiblies et l'occlusion de l'artère centrale de la rétine, qui est analogue à la course dans le cerveau.
   2. Pour les injections intracamérulaire, injecter le médicament dans la chambre antérieure en insérant une aiguille 30 G à travers le limbe cornéo avec le biseau et l'avancer parallel au plan de l'iris afin de minimiser le risque de traumatisme de l'iris ou de la lentille.
      REMARQUE: Selon la formulation de médicament, les aiguilles de 30 G peut être utilisé. Les conditions nécessitant une plus grande aiguille de calibre comprennent des médicaments, des médicaments contenant des microsphères grandes protéines et des formulations à haute viscosité.
   3. Après l'injection, comprimer le site d'injection avec un coton-tige applicateur stérile pour favoriser la cicatrisation.
      REMARQUE: Normalement, 30 sec est suffisant pour la cicatrisation des plaies, quand une aiguille 30 G est utilisé pour l'injection intra-oculaire. Toutefois, si une aiguille de gros calibre est utilisé pour l'injection intra-oculaire, plus le temps serait approprié pour la plaie d'étanchéité pour minimiser la fuite de la plaie de sclérotomie. Pour vérifier les fuites sclérotomie de la plaie est important de veiller à ce que la quantité de médicament intraoculaire utilisé immédiatement après l'injection intra-oculaire est la même que la quantité injectée, surtout si une aiguille de gros calibre est utilisé.
5. Observer les lapins traités par jour pourune semaine et une fois par semaine après, pour tout signe d'inflammation sévère intraoculaire (injection conjonctivale et hypopyon) jusqu'à ce que l'euthanasie.
   NOTE: Les analgésiques après l'injection ne sont pas requis que l'injection intra-oculaire en utilisant une aiguille 30 G est une procédure peu invasive qui ne sont pas accompagnés par la douleur post-chirurgicale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie des autres animaux jusqu'à guérison complète.

Préparation 2. Sample

1. Pour énucléation, euthanasier les lapins à divers points de temps (par exemple., 1 h ou 1, 2, 5, 9, 14 ou 30 jours) après l'injection de drogues intraoculaire.
   NOTE: Ces points de temps dépendent du médicament d'intérêt et les profils pharmacocinétiques connues. Pour chaque point de temps, utiliser au moins deux globes oculaires ^13. Pour la qualité des données fiables, le temps d' échantillonnage doit être choisi avec soin, au moins quatre points de temps avec échantillonnage équilibré pendant au moins un laps de temps de deux demi-vie du médicament ¹³ . Nous croyons que 6-8 points de temps avec échantillonnage équilibré peut être approprié. Pour les petites molécules (≤1,000 Da) ^18, en particulier, plus de 1 point de temps pendant les 24 premières heures est cruciale. En conséquence, pour les macromolécules (> 1000 Da) ^18, une période d'échantillonnage tels que 1 h et 1, 2, 5, 9, 14 et 30 jours ¹⁹ peut être une bonne option. Pour les petites molécules (≤1,000 Da), 1, 2, 4 et 8 h et 1, 3 et 7 jours peut être une option ^20. En fonction du poids moléculaire, la période d'échantillonnage peut être en outre modifié.
   1. Euthanasie, administrer 10 ml de 15% par voie intraveineuse KCI rapidement après anesthésie les lapins par une injection intramusculaire d'un mélange de chlorhydrate de tilétamine, chlorhydrate de zolazépam (15 mg / kg) et du chlorhydrate de xylazine (5 mg / kg).
2. Ouvrez la fente palpébrale avec un écarteur de paupière. Faire un 360 ° incision conjonctivale 2-3 mm en arrière du limbe et de l'étendre en arrière par la dissection du conjunctiva et la capsule de Tenon de la planète.
3. Couper les muscles extraoculaires proches de leur insertion dans le monde entier. Fixer le nerf optique avec une pince courbe, puis couper le nerf entre les pinces et le monde entier. Retirez le globe oculaire lui-même, tout en laissant les tissus environnants intacts. Après l'énucléation, geler immédiatement les globes oculaires et les stocker à -80 ° C.
   NOTE: Il peut y avoir deux options pour la congélation immédiate. Si la concentration de médicament est mesurée à une phase très précoce (ie. De moins de 1 h), l' azote liquide peut être plus approprié pour assurer la congélation mieux en temps opportun du globe oculaire. Toutefois, pour les périodes ultérieures, la glace peut être utilisée pour refroidir le globe oculaire immédiatement, puis le congélateur peut être utilisé pour stocker les globes oculaires à -80 ° C.
4. Après avoir obtenu les globes oculaires de tous les points de temps, séparer les globes oculaires congelé en trois compartiments, le corps vitré, l'humeur aqueuse et la rétine / choroïde. Séparer ces compartiments avant defrosting.
   NOTE: Le point le plus important pour la séparation en trois compartiments est la rapidité de la procédure. Le globe oculaire doit être séparé très rapidement avant la décongélation et la procédure peut être effectuée sur la glace pour retarder la décongélation.
   1. Pour ouvrir le monde, faire une incision au niveau du limbe cornéen (300 ° ou plus) avec une lame de scalpel. Obtenir le compartiment congelé en face de l'iris, l'humeur aqueuse.
   2. Retirez les iris et le cristallin congelés en tirant et excoriant en utilisant une pince de tissus. Lorsque le corps vitré devient accessible, obtenir le vitré congelé en le séparant des tissus restants (rétine / choroïde / sclérotique).
   3. En utilisant une lame n ° 15 de scalpel, séparer la rétine / tissu choroïde de la sclérotique sous-jacent.
5. Pour immunoessais, décongeler les échantillons d'humeur aqueuse, et de mesurer le volume de chaque échantillon. Mesurer le poids des échantillons congelés en soustrayant le poids d'un tube vide de celui du tube contenant le til gelé échantillon.
   Remarque: En raison de la gravité spécifique des échantillons congelés est d'environ 1, le poids de chaque échantillon peut être utilisée pour calculer le volume de l'échantillon.
6. Pondérer les échantillons vitreux, dégivrer les échantillons et les solubiliser dans 1,0 ml de solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% d'albumine de sérum bovin sur un agitateur pendant une nuit à 4 ° C. Ensuite, centrifuger les échantillons à 387 xg pendant 10 min ^21.
7. Peser la rétine / choroïde échantillons congelés pour l'homogénéisation. Ajouter des protéines réactif d'extraction avec un rapport de tissu à un réactif de 1:10 (1 g de tissu / 10 ml de réactif). Homogénéiser le tissu en utilisant un microhomogenizer pré-réfrigérés. Centrifuger l'échantillon lysées pendant 10 min à 12,000-20,000 xg et transférer le surnageant dans un tube de PPE refroidi.

3. Immunoassay

REMARQUE: Plusieurs méthodes analytiques peuvent être utilisées pour la mesure de la concentration en protéines. Choisissez une méthode quantitative appropriée, delon la plage de détection. En bref, le mode de surveillance d'ions sélectionnés de HPLC peut détecter les niveaux de molécule de picogrammes, alors que LC-MS / MS peut détecter nanogramme et picogrammes niveaux de protéines pour le profilage en mode MRM / PRM, respectivement. La limite de détection du test ELISA est considéré comme au niveau du picogramme.

1. Pour les tests indirects immuno-enzymatiques (ELISA) pour mesurer les concentrations d'anti-VEGF agents, en utilisant des kits ELISA dans des plaques à 96 puits pour détecter le médicament d'intérêt et de générer une courbe d'étalonnage de concentrations connues de médicaments.
   1. On dilue le, l'humeur aqueuse du vitré, la rétine et la choroïde / échantillons avec 0,1% d'albumine sérique bovine dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) à des concentrations qui sont dans la zone linéaire, et d'utiliser ceux-ci pour le dosage.
2. Diviser les échantillons en aliquots sur la plaque à 100 pl / puits. Incuber une nuit à 4 ° C, puis laver la plaque trois fois en utilisant 200 pi de la solution de lavage de 0.05% de Tween 20 dans du PBS 1X.
   NOTE: L'anti-VEGF présente dans l'échantillon agit en tant que l'anticorps primaire pour le test ELISA; Par conséquent, l'utilisation supplémentaire d'un anticorps primaire ne soit pas nécessaire.
3. Diluer l'anticorps secondaire à 1: 20 000 dans 0,1% de BSA dans du PBS 1X, et ajouter 100 ul de la solution diluée dans chaque puits. Après incubation de la plaque avec un anticorps secondaire dilué pendant une nuit à 4 ° C, de mesurer la densité optique à 450 nm de longueur d'onde. Soustraire la moyenne zéro densité optique standard à partir de la moyenne des lectures en double pour chaque norme et de l'échantillon.
4. Créer une courbe d'étalonnage basée sur le signal lumineux par rapport à partir de solutions du médicament avec des concentrations connues en réduisant les données en utilisant un logiciel informatique capable de générer un à quatre paramètres logistique (4-PL) ajustement de courbe, tels que SoftMax Pro. Pour créer une courbe standard, l'ajustement de la courbe 4-PL peut être obtenu en cliquant sur [4 paramètres] dans [Standard Curve] - [Ajuster].
5. Calculer la concentration de médicament dans les échantillons from la courbe standard.
   REMARQUE: Les limites de détection (LOD) de médicaments anti-VEGF ont été étudiés dans notre expérience. La LOD du bevacizumab était de 0,024 à 3,125 ng / ml et celle de aflibercept était 0.039-10 ng / ml.

4. Méthodes d'analyse pharmacocinétiques

NOTE: Pour l'analyse de PK, on ​​peut utiliser soit compartimentée ou une analyse non compartimentale. Dans l'analyse compartimentée, le comportement de la disposition des molécules peut être expliquée par une équation (modèle). Ainsi, l'analyse de PK compartimentée peut prédire la concentration à tout instant t alors que le modèle non compartimenté ne peut pas visualiser ou de prédire les profils concentration-temps pour d'autres schémas posologiques. Cependant, montage de modèles compartimentés peut être un processus long et complexe. En revanche, les hypothèses sont moins restrictives dans le modèle non compartimenté. La méthode non compartimentale est simple et couramment utilisée pour calculer les paramètres pharmacocinétiques tels que demi-vie, la clairance et le volume de distribution.Nous avons choisi des modèles compartimentés pour les études pharmacocinétiques sur les agents anti-VEGF.

1. Analyser les données de concentration de médicament avec les modèles compartimentés en utilisant un logiciel de modélisation tels que les logiciels Phoenix WinNonlin.
   1. Cliquez sur [modèle PK] dans [modélisation WNL5 classique] et cartographier le temps d'observation, la dose administrée, et la concentration de médicament dans le menu [Config].
   2. Sélectionnez le modèle compartimenté (par exemple, le nombre de compartiments) dans l'onglet [de sélection du modèle], puis cliquez sur le bouton [Exécution] pour calculer les paramètres du modèle.
2. Après les analyses, sélectionnez le modèle du compartiment final qui décrit le mieux les données de concentration de médicament sur ​​la base des critères suivants: (. Par exemple, erreur standard) (1) Akaike Information Criterion, (2) la précision des estimations des paramètres, et (3) l' analyse graphique (par exemple., la bonté des parcelles d' ajustement).
3. Calculer les paramètres pharmacocinétiques d'intérêt, tels que la demi-vie (T _1/2) et l' aire sous le temps-concentraCourbe de phe (AUC), à partir des paramètres du modèle et les équations entraînées par le modèle compartimental.

Résultats

La procédure qui est utilisée pour effectuer des injections intravitréennes d'un médicament d'intérêt dans les yeux de lapin avec des techniques stériles est montré à la figure 1. Les yeux traités sont énucléés à une heure programmée et stockés à -80 ° C. Pour l'analyse, trois compartiments, l'humeur aqueuse, le corps vitré et la rétine / choroïde, sont séparés des yeux de lapin congelés, comme le montre la figure 2.

Discussion

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zoletil	Virbac Laboratories, Carros Cedex, France
Xylazine hydrochloride	Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA
Proparacaine hydrochloride (Alcaine)	Alcon laboratories, Fort Worth, TX
Phenylephrine hydrochloride and tropicamide	Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan
Recombinant Human VEGF 165	R&D systems	293-VE-050
Carbobate-Bicarbonate buffer	SIGMA	C3041-50CAP
NUNC MICROWELL 96F                                                               W/LID NUNCLON D SI	Thermo SCIENTIFIC	167008	96 well plate
Bovine Serum Albumin (BSA) 25grams(Net)	BOVOGEN	BSA025
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH7.4 (1X), 500mL	gibco	10010-023
Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-28652
Goat Anti-Human IgG Fc(HRP)	abcam	ab97225
Goat anti-Human IgG, Fab'2 Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo SCIENTIFIC	PA1-85183
CelLytic MT  Cell Lysis Reagent	SIGMA	C3228-50ML	lysis buffer
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #15
100 Scalpel Blades	nopa instruments	BLADE #10
FEATHER SURGICAL BLADE STAINLESS STEEL	FEATHER	11
1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250mL	Thermo SCIENTIFIC	34018
Stable Peroxide Substrate Buffer (10X), 100mL	Thermo SCIENTIFIC	34062
Softmax Pro	Molecular Devices	v.5.4.1	software for generating standard curve
SAAM II	Saam Institute, Seattle, WA		software for pharmacokinetic modeling
Phoenix WinNonlin	Pharsight, Cary, NC	v. 6.3	software for pharmacokinetic modeling
Avastin (bevacizumab)	Genentech