In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Zusammenfassung

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Zusammenfassung

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Einleitung

Influenza - A - Virus (IAV) ist ein umhülltes Virus und gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Seine Gene codiert sind auf einem segmentierten, Negativ-sense und einzelsträngige RNA-Genom. Beim Menschen verursacht IAV Infektionen der Atemwege, die ¹ für die globale Pandemien saisonalen Epidemien und trägt das Potential auftreten. Nach Bindung an Sialinsäure-Reste auf der Zelloberfläche ² wird IAV internalisiert von Clathrin-abhängige Endozytose und Clathrin-unabhängige Wege ^3-8. Das saure Milieu (pH <5,5) in den endozytischen Vakuolen löst eine große Konformationsänderung des IAV - Spike - Glykoprotein - Hämagglutinin (HA), die in Fusion des viralen Ergebnisse und die späten endosomalen Membran ^9. Sobald die IAV Kapsid (hier auch als virale "Kern" bezeichnet) wurde von späten Endosomen (LEs) entkommen, es in das Cytosol unbeschichtet wird durch den Transport der viralen Ribonukleoproteine ​​gefolgt (vRNPs) in den Kern - die Seite of Virus - Replikation und Transkription ^13.10. Vor der Säureaktivierung von HA erfährt das Virus eine allmähliche Abnahme der pH - Wert im endozytischen System, das den Kern für seine spätere Demontage ^14-16 Primzahlen. In dieser "Priming" die M2 - Ionenkanäle in der viralen Membran Schritt vermitteln den Zustrom von Protonen und K ^+10,14,16. Die Veränderung der Ionenkonzentration in dem Virus Innenraum stört die Wechselwirkungen durch das virale Matrix - Protein aufbauen M1 und dem acht vRNP Bündel und erleichtert IAV uncoating im Zytoplasma folgende Membranfusion ^10,14-17.

Direkte und quantitative Analyse des Priming-Schritt wurde durch die Tatsache erschwert, dass Endosomen schwer experimentell zuzugreifen. Der Eingabeprozess ist außerdem stark nichtsynchron. Zusätzlich Endpunktassays, wie qRT-PCR von freigesetzten viralen RNA oder Infektiosität Messungen bieten nicht ein genaues Bild über die biochemischen Zustand des viralen capsid zu einem bestimmten Schritt des Eintrages. Während Störung von Endosomen durch siRNA oder medikamentöse Behandlung wesentlich zum Verständnis der IAV Eintrag beigetragen hat ^18-20, Feinabstimmung ist schwierig und anfällig für unspezifische Nebenwirkungen in der streng kontrollierten endosome Reifung Programm.

Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine bisher entwickelten in vitro - Protokoll auf der Verwendung von Geschwindigkeits Gradientenzentrifugation ¹⁷ basierend angepasst. Im Gegensatz zu anderen Versuchen , ^{21,22, 23,24,} die auf Kombinationen von proteolytischen Spaltung und Detergens - Behandlung meist auf Basis wurden von EM - Analyse verfolgt, ermöglicht dieser Ansatz eine leicht quantifizierbar Ergebnis. Zentrifugation durch verschiedene Gradientenschichten ermöglicht die sedimentierenden Teilchen ausgesetzt werden und reagieren mit den Bedingungen in einer kontrollierten Weise zu verändern. In dem vorgestellten Protokoll IAV abgeleitet von geklärten Allantoisflüssigkeit oder gereinigter Viruspartikel werden in einer zweischichtigen Glycerin sedimentiertGradienten in dem die untere Schicht enthält den nicht-ionischen Detergens NP-40 (Abbildung 1). Da das Virus das zweite, Waschmittel enthaltende Schicht ein, so werden die viralen Lipidhülle und Hüll-Glycoproteine ​​sanft löslich gemacht und hinter sich gelassen. Der Kern, der sich aus den acht vRNP Bündels und durch eine Matrixschicht, Sedimenten als eine stabile Struktur, in der Pelletfraktion umgeben. Virale Kernproteine, wie beispielsweise M1 und vRNP assoziiertes Nukleoprotein (NP), können in dem Pellet durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung identifiziert werden. Insbesondere Vorteil handelsüblichen Gradientengelen unter und Färbung mit dem hochempfindlichen kolloidalen Coomassie ^25, ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Erfassung von sogar kleinen Mengen der viralen Core-assoziierten Proteinen.

Dies stellt die Grundlage für die Prüfung, ob verschiedene Bedingungen wie pH-Wert, Salzkonzentration und mutmaßliche uncoating Faktoren haben Auswirkungen auf das Sedimentationsverhalten von Kernkomponenten und Kern stabil keit. Zu diesem Zweck nur die untere, waschmittelhaltigen Schicht in dem Glycerol-Gradient wird durch die Einführung des Faktors oder der Zustand von Interesse modifiziert. Die Technik ist besonders wertvoll, die Wirkung von verschiedenen pH - Werten und Salzkonzentrationen auf die Integrität des IAV Kern ¹⁶ in die Untersuchung. Zwischenschritte des IAV uncoating könnte einschließlich Dissoziation der Matrixschicht anschließend bei leicht sauren pH (<6,5) bei einem pH von 5,5 vRNP Dissoziation überwacht und unteren ^16,17 (Abbildung 1). Der letztere Schritt wurde durch die Anwesenheit von hohen K ⁺ -Konzentration in der Glycerinschicht verstärkt, einen späten endozytotischen Umgebung widerspiegelt ^16. Somit ist, wie das Virus, und der Kern durch den Gradienten sedimentiert erfahren sie einen wechselnden Milieu, das nachahmt Bedingungen in Endosomen. Das Ergebnis war eine schrittweise Demontage des viralen Kern in vitro als Ergänzung Ergebnisse abgeleitet von der Zellbiologie - Assays.

t "> Das hier dargestellte Verfahren hat sich schnell aktiviert und hoch reproduzierbare Analyse von IAV (X31 und A / WSN / 33) und IBV (B / Lee / 40) durch sauren pH - Wert ausgelöst uncoating und K ^+16,17 sowie Demontage zu erhöhen von Paramyxovirus Kerne bei alkalischen pH - Exposition ^17. Es ist denkbar, dass der Ansatz kann auch auf andere umhüllte Viren angepasst werden Einblicke in die biochemischen Eigenschaften des viralen Kapsids Struktur und Kapsid Demontage während Zelleintritt zu gewinnen.

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Protokoll

1. Herstellung von Puffer und Stammlösungen

1. Bereiten MNT - Puffer (20 mM MES, 30 mM Tris und 100 mM NaCl) durch Auflösen von 470 mg Tris - Hydrochlorid, 390 mg MES - ​​Hydrat und 580 mg NaCl in 80 ml ​​ddH ₂ O. Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4 und bringt es auf ein Endvolumen von 100 ml mit ddH ₂ O.
2. Bereiten Sie drei identische Lösungen von 500 mM MES - ​​Puffer durch Auflösen von 9,76 g MES - ​​Hydrat in 80 ml ​​dH ₂ O je. Stellen Sie die Puffer pH 5,8, 5,4 und 5,0 jeweils durch mit konzentrierter NaOH titriert. Bringen jeder Puffer auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH ₂ O.
3. Bereiten zwei identische Lösungen von 500 mM Tris - Puffer durch Lösen von 7,88 g Tris - Hydrochlorid in 80 ml ​​dH ₂ O und jeweils den pH - Wert auf 7,4 und 6,4 jeweils durch mit konzentrierter HCI titriert. Bringen Sie den Puffer zu einem Endvolumen von 100 ml mit dH ₂ O.
4. Bereiten Sie 50% Glycerin - Lösung in dH ₂ O und gut umrühren , bis die glycerol ist homogen vermischt. Filtern der Lösung durch eine Steritop Filtereinheit (0,22 um Porengrße) in eine Glasflasche.
5. Herstellung von 10% NP-40 - Lösung und 1 M NaCl in dH ₂ O.
6. Bereiten 25x konzentrierter Protease - Inhibitor durch Auflösen von zwei Tabletten in 4 ml ddH ₂ O.

2. Herstellung von Glycerol Gradients

1. Bereiten 5 ml Detergenspuffer Master Mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x konzentrierte Proteaseinhibitor) -Lösung für jeden pH Zustand Test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0). Zu diesem Zweck mischen 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml des 25x - Protease - Inhibitor Lager, und 9 ml ddH ₂ 0.
2. Für jeden pH Zustand Pipette 4,4 ml der Master-Mix in einem 50 ml konischen Röhrchen.
3. Für die pH-Werte über 5,8 addieren 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM Tris-Stammlösung in das Röhrchen. Für pH 5,8 und niedriger 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM MES-Stammlösung hinzufügen.
4. Machen 5ml Pufferlösung , enthaltend 300 mM NaCl, 2x - Protease - Inhibitor, 60 mM Tris 7,4 und ddH ₂ O auf pH Dies wird als Waschmittel freie Steuerung Gradientenpuffer dienen.
5. Falls erforderlich, Feineinstellung der pH der Lösungen auf einen pH von 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0 durch Zugabe von konzentrierter HCl oder NaOH Lösungen, respectively.
6. 5 ml 50% Glycerin-Stamm bis 5 ml der Waschmittelhaltigen und waschmittelfreie Puffergemische was zu sechs verschiedenen 25% Glycerinlösungen. Überprüfen Sie die pH-Werte von pH-Indikatorstreifen verwendet wird.
   HINWEIS: Falls der gemessene pH-Wert signifikant von dem Sollwert abweicht, sollten die jeweiligen Lösungen wieder hergestellt werden.
7. Vorbereitung 15% Glycerin - Lösung von 50% Glycerin - Vorrats Mischen mit dH ₂ O in einem 3: 7 - Verhältnis.

3. Ultrazentrifugation von IAV

1. 3 ml 15% Glycerin-Lösung in extrem klar Zentrifugenröhrchen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) durch eine 5 ml-Spritze und ein neeDLE (21 G, 9 cm lang). Nicht Tropfen an der Innenwand des Rohres lassen, da dies die Integrität des Gradienten stören. Wiederholen Sie dies für insgesamt sechs Zentrifugenröhrchen, eine für jede der fünf pH-Bedingungen zu testen, und eine für die Kontrollprobe.
2. Vorsichtig 3,4 ml 25% Glycerin-Lösung unter der Schicht 15% Glycerin durch eine 5-ml-Spritze und eine lange Nadel. Achten Sie darauf, nicht auf die beiden Schichten mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle sechs Bedingungen mit den jeweiligen pH-Wert eingestellten Glycerinlösungen zu testen.
   HINWEIS: Die Arbeit in der Klasse II Biosicherheitswerkbank für die folgenden Schritte.
3. Overlay sanft die Glycerol-Gradienten mit 30 ul geklärten Allantoisflüssigkeit enthält IAV (X31, H3N2) in 1 ml MNT-Puffer verdünnt (entspricht etwa 20-30 ug Gesamt-Virusprotein) für jeden Gradienten.
4. Gleichgewicht gegenüberliegenden Röhren und legen Sie sie in einen SW41 Ultrazentrifugation Rotor. Zentrifuge für 150 min bei 55.000 xg und 12 ° C.
5. Nach der Zentrifugation sorgfältigÜberstand verwerfen, dh sowohl Glycerol Schichten durch eine saubere Pasteur - Pipette und eine Saugvorrichtung verwendet. Das Pellet in 40 & mgr; l (1x) nicht reduzierende Puffer LDS Probe. Es ist wichtig zu pipettieren und mehrmals über das Pellet vollständig aufzulösen. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

4. SDS-PAGE von Pelletfraktionen und Coomassie-Färbung

1. Erhitzen alle Proben bei 95 ° C für 10 min. An diesem Punkt können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, bis sie durch SDS-PAGE analysiert.
2. Last 20 ul der gelösten Pellets auf einen vorgegossenen Gradienten (4-12%) Bis-Tris-Gel mini und laufen für 1 Stunde bei 200 V in 1x SDS MOPS Laufpuffer.
3. Machen Fixierungslösung mit 40% Methanol und 10% Eisessig in ddH ₂ O.
4. Inkubieren Sie das Gel in Fixierungslösung für 1 Stunde und über Nacht in einer 15 cm Zellkulturschale mit einem ausreichenden Volumen von kolloidalem Coomassie Lösung färben, während sanftSchütteln bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Schale zu vermeiden, um die Verdampfung des Färbelösung zu schließen.
5. Entfärben des Gels in ddH ₂ O. Tauschen Sie die ddH ₂ O alle 15-20 min , bis das Gel Hintergrund deutlich wird. Lagern Sie das Gel in ddH ₂ O bei 4 ° C bis zur Band Quantifizierung abgetastet wird.
6. Scannen Sie das Gel mit hoher Auflösung und verwenden im Handel erhältlich oder maßgeschneiderte Software für die Quantifizierung von Proteinbandenintensitäten. Subtrahieren des Hintergrundsignals von einem Bereich nahe den jeweiligen Bändern und normalisieren diese Werte an die detergensfreien Kontrollproben (bei pH 7,4).

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Ergebnisse

Wie bereits diskutiert, in Endosomen Grundierung erforderlich, um die IAV Kern uncoating kompetent zu machen. Protonierung des Kerns schwächt Wechselwirkung von M1 und vRNPs (zusammengesetzt aus den viralen RNA, NP und die Polymerase-Komplex PB1 / PB2 / PA). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn ankommende Virus zu einem pH-Wert von 6,5 ausgesetzt (oder niedriger) in frühen Endosomen (EBS) und wird fortgesetzt, bis die Virus-Sicherungen bei etwa pH 5,0 in LEs.

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Diskussion

Virale Capside sind metastabile makromolekularer Komplexe. Während Zusammenbau von Virionen, die Einkapselung und Kondensieren des Virusgenoms erfordert, hängt Einleitung der nächsten Runde der Infektion auf die Demontage dieser kompakten Kapsidstruktur. Viren entwickelt haben verschiedene zelluläre Mechanismen zu nutzen , um die Beschichtung-uncoating Zyklus zu steuern, einschließlich der zellulären Rezeptoren, Chaperone, proteolytischen Enzymen, physikalische bereitgestellt Kräfte , die durch Motorproteine ​?...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4 °C