In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Riepilogo

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduzione

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali ^1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite ^2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti ^3-8. L'acido ambiente (pH <5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana ⁹ endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come "core" virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine ​​virali (vRNPs) nel nucleo - il sito oreplicazione del virus F e trascrizione ^10-13. Prima all'attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio ^14-16. In questo "priming" passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l'afflusso di protoni e K ^+10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell'interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine ​​della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana ^10,14-17.

Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso ^18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato.

Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull'uso di gradiente di velocità di centrifugazione ^17. A differenza di altri tentativi di ^{21,22, 23,24,} che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine ​​virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine ​​essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l'colloidale altamente sensibile Coomassie ^25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine ​​essenziali associate virali.

Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l'effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull'integrità del nucleo IAV ^16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (<6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore ^16,17 (figura 1). Quest'ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K ⁺ concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic ^16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati ​​da test di biologia cellulare.

t "> Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K ^+16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino ^17. Non si può escludere che l'approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l'immissione delle cellule.

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Protocollo

1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre

1. Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml ​​di DDH ₂ O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH ₂ O.
2. Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml ​​di dH ₂ O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH ₂ O.
3. Preparare due soluzioni identiche di 500 tampone Tris mM sciogliendo 7.88 g Tris cloridrato in 80 ml ​​dH ₂ O ciascuno e regolare il pH a rispettivamente 7,4 e 6,4,, per titolazione con HCl concentrato. Portare il buffer ad un volume finale di 100 ml con dH ₂ O.
4. Preparare la soluzione di glicerolo al 50% in DH ₂ O e mescolare bene fino a quando il GLYCErol è omogeneamente misto. Filtrare la soluzione attraverso un gruppo di filtraggio Steritop (0,22 micron dimensioni dei pori) in una bottiglia di vetro.
5. Preparare soluzione al 10% NP-40 e 1 M NaCl in DH ₂ O.
6. Preparare 25x inibitore della proteasi concentrata sciogliendo due compresse in 4 ml DDH ₂ O.

2. Preparazione di glicerolo gradienti

1. Preparare 5 ml di detersivo maestro tampone mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x concentrata inibitori della proteasi) soluzione per ogni condizione di pH a prova (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). A questo scopo, mescolare 9 ml di 1 M NaCl, 6 ml di 10% NP-40, 2,4 ml di inibitore della proteasi archivio 25x e 9 ml DDH ₂ 0.
2. Per ogni condizione di pH pipetta 4,4 ml di master mix in un tubo conico da 50 ml.
3. Per i valori di pH superiori a 5.8 aggiungere 0,6 ml del rispettivo pH aggiustato soluzione 500 mM Tris magazzino al tubo. Per pH 5,8 ed inferiore aggiungere 0,6 ml della rispettiva soluzione stock di 500 mm MES pH modificato.
4. Fare 5ml di soluzione tampone contenente 300 mM NaCl, inibitore della proteasi 2x, 60 mM Tris a pH 7,4 e DDH ₂ O. Questo servirà come il buffer di controllo del gradiente senza detersivo.
5. Se necessario, fine-regolare il pH delle soluzioni a pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 e 5.0 aggiungendo soluzioni HCI o NaOH concentrati rispettivamente.
6. Aggiungere 5 ml di stock di glicerolo 50% a 5 ml della miscela tampone detergenti contenenti e senza detergenti risultanti in sei diverse soluzioni di glicerolo 25%. Verificare i valori di pH utilizzando strisce indicatrici pH.
   NOTA: Nel caso in cui il pH misurato differisce significativamente dal valore desiderato, le rispettive soluzioni dovrebbero essere preparate di nuovo.
7. Preparare la soluzione di glicerolo al 15% mescolando 50% stock di glicerolo con dH ₂ O in un rapporto 3: 7.

3. Ultracentrifugazione di IAV

1. Aggiungere 3 ml di soluzione di glicerolo al 15% in tubi centrifugazione ultra chiare (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizzando una siringa da 5 ml e una neeDLE (21 G, 9 cm di lunghezza). Non lasciare gocce alla parete interna del tubo in quanto questo potrebbe disturbare l'integrità del gradiente. Ripetere questo per un totale di sei tubi centrifugazione, uno per ciascuna delle cinque condizioni di pH per testare e uno per il campione di controllo.
2. Posizionare con cura soluzione di glicerolo 3,4 ml di 25% sotto il livello di glicerolo 15% utilizzando una siringa da 5 ml e un lungo ago. Fare attenzione a non mescolare i due strati. Ripetere questa operazione per tutte le sei condizioni per testare con le rispettive soluzioni di glicerolo pH regolato.
   NOTA: Il lavoro in classe II biosicurezza cabinet per i seguenti passaggi.
3. sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo con 30 ml chiarito liquido allantoico contenente IAV (X31, H3N2) diluito in 1 ml MNT tampone (corrisponde a circa 20-30 mg di proteina virale totale) per ogni sfumatura.
4. Equilibrio opposte tubi e metterli in un rotore ultracentrifugazione SW41. Centrifugare per 150 min, a 55.000 xg, e 12 ° C.
5. Dopo la centrifugazione, accuratamenteRimuovere il surnatante, cioè, entrambi gli strati glicerolo utilizzando una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore. Risospendere il pellet in 40 microlitri (1x) non riducenti tampone campione LDS. E 'importante pipettare su e giù più volte per sciogliere completamente il pellet. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.

4. SDS-PAGE di pellet frazioni e Coomassie colorazione

1. Riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 10 min. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C finché non vengono analizzati mediante SDS-PAGE.
2. Carico 20 ml di pellet disciolti SU UN gradiente di pre-cast (4-12%) mini gel Bis-Tris e corrono per 1 ora a 200 V in 1x MOPS SDS tampone di corsa.
3. Fai la soluzione fissazione con il 40% di metanolo e acido acetico glaciale al 10% in DDH ₂ O.
4. Incubare il gel in soluzione di fissaggio per 1 ora e macchiare notte in un 15 centimetri piatto di coltura cellulare con un volume sufficiente di soluzione colloidale Coomassie mentre delicatamenteagitazione a temperatura ambiente.
   NOTA: È importante chiudere il piatto in modo da evitare l'evaporazione della soluzione colorante.
5. Decolorare il gel in DDH ₂ O. Sostituire il DDH ₂ O ogni 15-20 minuti fino a quando il fondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in DDH ₂ O a 4 ° C fino a quando non viene sottoposto a scansione per la banda quantificazione.
6. Eseguire la scansione del gel ad alta risoluzione e di utilizzare il software disponibile o su misura commercialmente per la quantificazione di intensità di banda proteine. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicino alle rispettive bande e normalizzare questi valori per i campioni di controllo senza detergente (a pH 7,4).

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Risultati

Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les.

Per s...

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Discussione

capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l'incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l'inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine ​​motrici o helicases nonché pH e interrutto...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4 °C