Immobilisierung von Multi-Biokatalysatoren in Alginatbeads für Kofaktorregenerierung und verbesserte Reusability

Zusammenfassung

Dargestellt ist das Protokoll für die Co-immobilisierenden Ganzzellbiokatalysatoren für Cofactorregenerierung und eine verbesserte Wiederverwertbarkeit, mit der Produktion von L-Xylulose als Beispiel. Die Cofactorregenerierung wird durch Kopplung von zwei Escherichia coli - Stämme exprimieren funktionell komplementären Enzymen erreicht; die Ganzzellbiokatalysator Immobilisierung durch Zellverkapselung in Calciumalginatperlen erreicht.

Zusammenfassung

Wir haben vor kurzem eine einfache, wiederverwendbare und gekoppelt whole-cell biokatalytischen System mit der Fähigkeit zur Cofaktor-Regenerierung und Biokatalysator Immobilisierung für eine verbesserte Produktionsausbeute und anhalt Synthese. Beschrieben hiermit ist das experimentelle Verfahren für die Entwicklung eines solchen Systems , bestehend aus zwei E. coli - Stämme , die funktionell komplementäre Enzyme exprimieren. Zusammen können diese beiden Enzyme wirken kooperativ die Regeneration von teuren Cofaktoren für die Verbesserung der Produktausbeute der Bioreaktion zu vermitteln. Darüber hinaus wird berichtet, das Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Form des gekoppelten Systems biokatalytischen durch Einkapselung von ganzen Zellen in Calciumalginat-Kügelchen synthetisiert wird. Als Beispiel stellen wir die verbesserte Biosynthese von L-Xylulose aus L-arabinitol durch E. Kupplung coli - Zellen , die die Enzyme L-Arabinit - Dehydrogenase oder NADH - Oxidase exprimiert. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreichte 96%, was in der Literatur berichtet höher als jene ist. Die immobilisierte Form der gekoppelten Ganzzellbiokatalysatoren zeigte eine gute Betriebsstabilität, 65% der im ersten Zyklus nach 7 Zyklen von aufeinanderfolgenden Wiederverwertung erhalten Ausbeute aufrechterhalten wird, während das freie Zellsystem fast vollständig die katalytische Aktivität verloren. Daher sind die hier beschriebenen Verfahren liefert zwei Strategien, die die industrielle Produktion von L-Xylulose verbessern helfen könnten, sowie andere Mehrwert-Verbindungen, die die Verwendung von Co-Faktoren in der Regel erforderlich ist.

Einleitung

^{3 -} reduktiven Ganzzell - Biotransformation unter Verwendung von Mikroorganismen hat eine weit verbreitete Methode für die chemo-enzymatischen Synthese von kommerziell und therapeutisch wichtigen Biomolekülen ¹ geworden. Es stellt mehrere Vorteile gegenüber der Verwendung von isolierten Enzymen, insbesondere die Beseitigung von kostenintensiven nachgeschaltete Reinigungsverfahren und die Demonstration einer verlängerten Lebensdauer ^{von 4 bis 7.} Für biokatalytische Wege wo Cofaktoren für die Produktbildung erforderlich sind, haben Ganzzellsysteme das Potential in situ Regeneration Kofaktor über die Zugabe von kostengünstigen elektronenabgebenden Cosubstrate ^5,8,9 bereitzustellen. Jedoch ist diese Kapazität für Reaktionen vermindert , die eine stöchiometrische Konzentration von seltenen oder teuren Co-Substrate ¹⁰ erfordern ^{- 13.} Zusammen mit einer schlechten Wiederverwertbarkeit von ganzen Zellen, erschwert dies die Einrichtung eines skalierbaren und kontinuierlichen production System. Strategische Änderungen von Ganzzellsysteme für diese cofaktorabhängig Biotransformationen sind erforderlich, um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die Kombination von Ganzzell - Biokatalysatoren gesagt, die kooperativ arbeiten , wurden ¹⁴ gezeigt , erheblich die Produktivität und Stabilität der Enzyme beherbergten verbessern. Diese Faktoren, die oft entscheidend für die Aktivierung groß angelegte Produktion von marktfähige Produkte, kann durch ¹⁵ Co-Immobilisierung von biokatalytischen Mikroben optimiert werden. Wir haben vor kurzem eine einfache und wiederverwendbar whole-cell biokatalytische System , das sowohl die Regeneration Cofaktor ermöglicht und Biokatalysator Immobilisierung für die L-Xylulose Produktion ^16. In dieser Studie wurde dieses System als Beispiel verwendet, um die experimentellen Verfahren des Anwendens dieser beiden Strategien für eine verbesserte Biotransformation Produktionsausbeute und Biokatalysator Wiederverwertbarkeit zu veranschaulichen.

L-Xylulose gehört zu einer class biologisch nützliche Moleküle seltenen Zucker genannt. Seltene Zucker sind einzigartige Monosaccharide oder Zuckerderivate , die sehr selten in der Natur vorkommen, sondern spielen eine entscheidende Rolle als Erkennungselemente in bioaktiven Molekülen ^17,18. Sie haben eine Vielzahl von Anwendungen , von Süßstoffen hin, funktionelle Lebensmittel , um potenzielle Therapeutika ^19. L-Xylulose kann als potentieller Inhibitor der mehreren α-Glucosidasen verwendet werden und auch als ein Indikator von Hepatitis oder Leberzirrhose ^17,20 verwendet werden. Hoher Wirkungsgrad Umwandlung von Xylit zu L-Xylulose in Ganzzellsystemen wurde bereits berichtet , in Pantoea ananatis ^21,22, sp Alcaligenes. 701B ^23, Bacillus pallidus Y25 ^24,25 und Escherichia coli ^26. In E. coli wurde jedoch nur unter Verwendung von niedrig (<67 mM) Konzentrationen Xylit ²⁶ aufgrund möglicher inhibitorischen Wirkungen von einem Anfangs Xylit Konzentration höher als 1 erreicht00 mM auf Xylit-4-Dehydrogenase - Aktivität ^21,26. Das thermodynamische Gleichgewicht zwischen Xylulose und Xylitol hat sich gezeigt, stark die Bildung von Xylit ^25,27 begünstigen. Zusätzlich wird Xylulose Ausbeute durch die Menge der teuren Cofaktoren beschränkt , die in der Abwesenheit eines in situ - Cofaktor - Regenerationssystem zugeführt werden müssen. Zusammen begrenzen diese Faktoren das Potenzial für in nachhaltige Systeme für die L-Xylulose Biosynthese Skalierung.

Um diese Einschränkungen zu überwinden und die L-Xylulose Biotransformation Ausbeute zu verbessern, wurde die Strategie der Cofaktorregenerierung eingesetzt zuerst durch eine gekoppelte Ganzzell biokatalytischen Systems. Genauer gesagt, L-Arabinitol-4 - Dehydrogenase (EC 1.1.1.12) aus Hypocrea jecorina (HjLAD), ein Enzym in den L-Arabinose - Abbauweg von Pilzen, wurde die Umwandlung von L-arabinitol in L-Xylulose ^28,29 katalysieren ausgewählte . Wie viele biosynthetischen Enzyme, eine große limitation von HjLAD ist , daß es eine stöchiometrische Menge des teuren Cofaktors Nicotinamidadenindinucleotid (NAD ^+, die oxidierte Form von NADH) erfordert , um diese Umwandlung durchzuführen. NADH - Oxidase in Streptococcus pyogenes (SpNox) gefunden wurde , ^30,31 hohe Cofaktor-Regeneration Aktivität gezeigt angezeigt werden soll . Unter Ausnutzung dieser Eigenschaft von SpNox, E. coli - Zellen HjLAD zur Herstellung von L-Xylulose exprimieren , wurden mit E. gekoppelt coli - Zellen SpNox für die Regeneration von NAD ⁺ Exprimieren der L-Xylulose - Produktion durch die gekoppelte Reaktion in 1A gezeigt dargestellt zu steigern. Unter optimalen Bedingungen und mit einer Anfangskonzentration von 150 mM L-Arabinit, die maximale L-Xylulose-Ausbeute erreicht 96%, so dass dieses System viel effizienter als die in der Literatur berichtet.

Die Strategie der whole-cell Immobilisierung wurde als nächstes verwendet, um die Wiederverwertbarkeit des gekoppelten biocatalyt verbessernic-System. Häufig verwendete Methoden für die Ganzzell - Immobilisierung umfassen Adsorption / kovalente feste Matrices Verknüpfung Vernetzung / Mitreißen und Verkapselung in polymere Netzwerke ^32. Unter diesen Ansätzen ist die am besten geeignete Methode zur Zellimmobilisierung Einkapselung in Calciumalginat-Kügelchen. Ihre milde Geliereigenschaften, inerte wässrigen Matrix und hoher Porosität helfen , die physiologischen Eigenschaften und Funktionalität der eingekapselten Biologicals ³³ erhalten. Daher enthält das gekoppelte Biokatalysator System sowohl E. coli - Zellen HjLAD oder SpNox beherbergen , wurde in Calciumalginat Kügelchen immobilisiert auf mehrere Zyklen von L-Xylulose Produktion (Abbildung 2) .Die immobilisiert Biokatalysator System zeigte eine gute Betriebsstabilität, die Aufrechterhaltung 65% der Umwandlungsausbeute des ersten Zyklus nach 7 Zyklen ermöglichen sukzessive Wiederverwendung, während das freie Zellsystem fast vollständig seine katalytische Aktivität verloren.

Protokoll

1. Ganzzellbiokatalysatoren Vorbereitung

HINWEIS: Das rekombinante E. coli - Zellen pET28a- SpNox ³¹ oder pET28a- HjLAD ²⁸ werden im folgenden als E. beherberge coli _SpNox und E. coli _HjLAD, respectively.

1. Impfen eine einzelne Kolonie von E. coli _HjLAD in 3 ml Luria-Bertani (LB) Medium mit Kanamycin (50 ug / ml) ergänzt und Inkubation in einem Inkubator - Schüttler O / N bei 37 ^° C, 250 Umdrehungen pro Minute.
2. Verdünne die Kultur von 1: 100 in 200 ml frischem LB , enthaltend 50 ug / ml Kanamycin und Inkubation bei 37 ^o C, 250 Upm , bis die OD ₆₀₀ erreicht ~ 0,6.
3. Induzieren HjLAD Proteinexpression durch Zugabe von 0,1 mM Isopropyl - β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu dem Kulturmedium und Inkubation bei 16 ^o C, 180 Upm für 16 Stunden.
   1. Alternativ führen Induktion bei 25 ^° C, 200 rpm für 6 Stunden, wenn die L-Xylulose-Biosynthese (Schritt 2 unten) wird am selben Tag durchgeführt.
4. Ernten Sie die induzierte E. coli _HjLAD Zellen durch Zentrifugation bei 3.200 xg für 20 min bei 4 ^° C. Überstand verwerfen und gehen Sie zu Schritt 2 das Zellpellet zu verarbeiten.
5. Parallel dazu führen die Schritte 1,1-1,4 für E. coli _SpNox.

2. Biosynthese von L-Xylulose durch Kupplung E. coli _HjLAD und E. coli _SpNox für Kofaktorregenerierung

1. Resuspendieren der Zellpellets von E. coli _HjLAD und E. coli _SpNox getrennt in 50 mM Tris-HCl - Puffer (pH 8,0) bei einer Zelldichte von 5,0 g Trockenzellgewicht (gDCW) / L.
   Hinweis: Eine Korrelation zwischen gDCW und der optischen Dichte bei 600 nm gemessen (OD ₆₀₀₎ hergestellt werden kann , das Experiment zu vereinfachen. Die Formel, inDieses Protokoll ist ein gDCW / L = 0,722 * OD _{600 bis 0,0965,} die unter verschiedenen Spektrometern variieren kann.
2. Mischen Sie 600 ul von 5,0 gDCW / L E. coli _HjLAD, 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli _SpNox, 100 & mgr; l 20 mM NAD ⁺ und 150 ul 2 M L-arabinitol in einem 14 ml Rundbodenrohr und bringen zu 2 ml des Reaktionsvolumens durch Zugabe von 550 ul 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
   Hinweis: Das Verhältnis der beiden Ganzzell Biokatalysatoren Menge kann optimiert werden, um die Biosynthese des Produktes zu verbessern. Für das beschriebene System ein Verhältnis von E. coli _SpNox: E. coli _HjLAD = 1: 1 wurde für die L-Xylulose - Biosynthese (1B) als optimal erwiesen.
3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 30 ^° C, 200 Upm für 8 h.
4. Sammeln Sie den Überstand nach der Zentrifugation bei 4ºC, 3200 xg für 10 min and fahren Sie mit der L-Xylulose Produktion zu quantifizieren, wie in Schritt 3 weiter unten beschrieben.

3. kolorimetrischen Assay für L-Xylulose Quantification

1. Aspirat 100 & mgr; l des Reaktionsüberstand von Schritt gesammelt 2,4 in ein 1,5 ml Röhrchen.
2. Je 50 ul von 1,5% Cystein, 900 & mgr; l 70% iger Schwefelsäure und 50 ul 0,1% Carbazol in Ethanol gelöst und vorsichtig mischen durch das Rohr 3 mal invertiert.
3. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ^° C, 200 Upm für 20 min.
4. Anschließend wird die optische Absorption des Reaktionsgemisches bei 560 nm (A ₅₆₀₎ unter Verwendung eines Spektrophotometers.
   1. Man verdünnt das Reaktionsgemisch , wenn die A ₅₆₀ Wert über 1 ist.

4. Immobilisierung von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren in Calciumalginatperlen

1. Man löst 4 g Natriumalginat in 100 ml destilliertem Wasser. Bereiten Sie Alginat-Lösung durch Zugabe von sOdium Alginat zu Wasser, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden. Erhitzen Sie die Mischung, wenn nötig.
2. In 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli _HjLAD und 600 & mgr; l von 5,0 gDCW / L E. coli _SpNox in 1,2 ml 4% Alginat in Schritt 4.1 und mischen Sie die Zellen und Alginat durch vorsichtiges Pipettieren vorbereitet Blasenbildung zu vermeiden.
3. Absaugen Alginat / Zellsuspension in eine Spritze mit einer Nadel und fügen die Mischung tropfenweise in eine 0,3 M Calciumchlorid (CaCl ₂₎ -Lösung in einem 100 ml Becherglas unter kontinuierlichem Rühren unter Verwendung.
   Hinweis: Das Volumen der CaCl ₂ -Lösung für Alginat Wulstbildung verwendet genug sein sollte , um die Alginat - Tröpfchen vollständig eingetaucht werden. Zusätzlich muß der Abstand zwischen der Spritzennadel und der Oberfläche der Calciumchloridlösung in einem optimalen Bereich gehalten werden Bildung sphärischen Kügelchen gleichmäßig zu gewährleisten. Der optimale Abstand Bereich kann Experiment bestimmt werdenally und hängt von dem Innendurchmesser der Nadel. Als Schätzung wurde ein Abstand von ca. 15 ± 5 cm gefunden für ein 0,6 cm (Innendurchmesser) Spritzennadel optimal.
4. Lassen Sie die Perlen in der CaCl ₂ -Lösung für 2 - 3 h bei RT ohne Rühren Vernetzung und Gelkügelchen Bildung zu ermöglichen.
5. Dekantiert die CaCl ₂ -Lösung ohne die Perlen zu stören , indem Sie vorsichtig die CaCl ₂ -Lösung in einem 50 ml konischen Röhrchen gegossen, und übertragen Sie die restlichen Perlen in CaCl ₂ Lösung in einen anderen 50 ml konischen Röhrchen.
6. Waschen der Kügelchen mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) dreimal Puffer übermßige CaCl ₂ und un-eingekapselten Zellen zu entfernen.
   HINWEIS: Zu jedem gegebenen Schritt, nicht zentrifugiert werden die Perlen nicht als so tun wird sie zerreißen. Um die Perlen aus der Lösung zu trennen, damit die Suspension ungestört stehen 3 - 5 min. Die Perlen werden am Boden absetzen und der Waschpuffer kann dekantiert werdenin einen anderen Behälter.
   1. Sie nicht die verwendete Waschpuffer verwerfen. Pool der verwendeten Tris-HCl - Waschpuffer (30 ml) mit der verwendeten CaCl ₂ - Lösung aus Schritt gesammelt 4.5.
7. Pellet die un-immobilisiert E. coli - Zellen durch Zentrifugation des gepoolten CaCl ₂ und Tris-HCl - Lösung aus Schritt 4.6 bei 3.200 × g für 20 min gesammelt. Um die Immobilisierung Effizienz bestimmen, die Berechnung der Dichte der pelle un-eingekapselten Zellen in gDCW / L, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
8. Übertragen Sie die gewaschenen Kügelchen aus Schritt 4.6 in einem Rohr. Führen Sie die Schritte 2,2-3,4 L-Xylulose Biosynthese alle der gewaschenen Kügelchen anstelle von Zellpellets zu bewerten verwenden.

5. Stabilität Assay immobilisierter Biokatalysatoren für L-Xylulose Produktion

1. Sammeln der Kügelchen aus Schritt 4.8 und wäscht zweimal mit 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Puffer ohne Zentrifugation (wie in Schritt 4.6 beschrieben).
2. Verwenden Sie alleder gewaschenen Kügelchen, die Reaktion durchzuführen, wie in den Schritten 2.2 beschrieben - 3.4.
3. Wiederholen Sie die Schritte 5,1-5,2 für die gewünschte Anzahl von Produktionszyklen und messen die Menge an L-Xylulose im Reaktionsüberstand in jedem Zyklus erzeugt.

Ergebnisse

Damit wurde Cofactorregenerierung, L-Xylulose - Synthese durchgeführt in einer gekoppelten whole-cell biokatalytische System enthält E. coli _HjLAD und E. coli _SpNox Zellen. Nach der Optimierung der verschiedenen Parameter wurde die Wiederverwendbarkeit dieses Systems verbessert , indem es in Calciumalginat - Kügelchen zu immobilisieren (Abbildung 2).

...

Diskussion

Neueste technologische Fortschritte haben einen Anstieg in der Kommerzialisierung von rekombinanten Biotherapeutika, was zu einem allmählichen Anstieg in ihrem Marktwert in der Biotechnologie-Industrie ermöglicht. Ein solcher Fortschritt ist das Aufkommen von Metabolic Engineering in rekombinanten Mikroorganismen, die ein großes Versprechen bei der Schaffung skalierbare industrielle Systeme ³⁸ gezeigt hat. Wie bei den meisten Verfahren ist die erfolgreiche Kommerzialisierung von rekombinantem Biomolekülen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus