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Resumo

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

Resumo

Nós desenvolvemos recentemente um sistema de célula inteira biocatalítica simples, reutilizável e acoplado com a capacidade de regeneração do cofactor e imobilização biocatalisador para melhorar o rendimento de produção e a síntese sustentada. Aqui descrita é o procedimento experimental para o desenvolvimento de um tal sistema constituído por dois E. estirpes de E. coli que expressam enzimas funcionalmente complementares. Em conjunto, estas duas enzimas podem funcionar co-operacionalmente para mediar a regeneração de cofactores caros para melhorar o rendimento do produto do bio-reacção. Além disso, o método de síntese de uma forma imobilizada do sistema biocatalítica acoplado por encapsulação de células inteiras em esferas de alginato de cálcio é relatado. Como um exemplo, apresenta-se a melhoria da biossintese da L-xilulose a partir de L-arabinitol por acoplamento E. células de E. coli que expressam as enzimas desidrogenase L-arabinitol ou NADH oxidase. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de 150mM de L-arabinitol, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, o que é mais elevado do que os relatados na literatura. A forma imobilizada dos biocatalisadores de célula inteira acoplados demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento obtido no primeiro ciclo após 7 ciclos sucessivos de re-utilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a actividade catalítica. Portanto, os métodos descritos aqui fornece duas estratégias que podem ajudar a melhorar a produção industrial da L-xilulose, bem como outros compostos de valor acrescentado que requerem o uso de co-factores em geral.

Introdução

Biotransformação de célula inteira redutora usando microorganismos tornou-se um método generalizado para a síntese quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente e terapeuticamente importantes 1 - 3. Ele apresenta várias vantagens sobre a utilização de enzimas isoladas, particularmente, a eliminação dos processos de purificação a jusante custo intensivo e a demonstração de um tempo de vida prolongado 4-7. Para vias biocatalíticas onde são necessários co-factores para a formação do produto, os sistemas de célula inteira tem o potencial para proporcionar a regeneração in situ de cofactor através da adição de baixo custo dadores de electrões co-substratos 5,8,9. No entanto, esta capacidade é diminuída para reacções que requerem uma concentração estequiométrica de co-substratos raras ou caras 10 - 13. Juntamente com a pobre reutilização de células inteiras, o que impede o estabelecimento de um produ escalável e contínuasistema cção. são necessárias modificações estratégica dos sistemas de células completas para estas biotransformações dependente do cofactor para superar as limitações acima mencionadas. Especificamente, a combinação de biocatalisadores de célula inteira que trabalham cooperativamente foram mostrados para aumentar significativamente a produtividade e a estabilidade das enzimas abrigavam 14. Estes factores, que são frequentemente críticos para permitir a produção em grande escala de produtos comercialmente viáveis, ainda pode ser optimizada por micróbios biocatalíticas co-imobilização 15. Recentemente, desenvolvemos um sistema biocatalítico de células inteiras simples e reutilizável que permite tanto a regeneração cofator e imobilização biocatalisador para a produção de L-xilulose 16. Neste estudo, este sistema foi utilizado como um exemplo para ilustrar os procedimentos experimentais de aplicar estas duas estratégias para melhorar o rendimento da produção e a capacidade de reutilização biotransformação biocatalisador.

L-xilulose pertence a uma CLAss de moléculas biologicamente úteis chamado açúcares raros. Açúcares raros são monossacarídeos originais ou derivados de açúcar que ocorrem muito raramente na natureza, mas desempenham um papel crucial como elementos de reconhecimento em moléculas bioativas 17,18. Eles têm uma variedade de aplicações que vão desde adoçantes, alimentos funcionais para agentes terapêuticos potenciais 19. L-xilulose pode ser utilizado como um inibidor potencial de várias a-glucosidases, e pode também ser usado como um indicador de hepatite ou cirrose hepática 17,20. Conversão de alta eficiência de xilitol a L-xilulose em sistemas de célula completa tem sido relatado previamente em Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 e Escherichia coli 26. Em E. coli, no entanto, só foi conseguido utilizando (<67 mM) concentrações baixas de xilitol 26, devido a possíveis efeitos inibidores de uma concentração inicial xilitol superiores a 100 mM sobre a atividade xilitol-4-desidrogenase 21,26. O equilíbrio termodinâmico entre xilulose e xilitol tem sido demonstrado que favorecem fortemente a formação de xilitol 25,27. Além disso, o rendimento de xilulose é limitada pela quantidade de cofactores caros que têm de ser fornecidos, na ausência de um sistema de co-factor de regeneração in situ. Juntos, esses fatores limitam o potencial para a expansão em sistemas sustentáveis ​​para a biossíntese de L-xilulose.

Para superar essas limitações e melhorar o rendimento biotransformação L-xilulose, a estratégia de regeneração cofator foi empregado pela primeira vez através do estabelecimento de um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado. Especificamente, L-arabinitol 4-desidrogenase (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), uma enzima na via catabólica de L-arabinose de fungos, foi selecionado para catalisar a conversão de L-arabinitol em L-xilulose 28,29 . Como muitas enzimas biossintéticas, um dos principais limitatioN de HjLAD é que ele requer uma quantidade estequiométrica do caro nicotinamida adenina dinucleótido cofactor (NAD +, a forma oxidada de NADH) para efectuar esta conversão. NADH oxidase encontrado em Streptococcus pyogenes (SpNox) foi mostrado para exibir actividade de cofactor de alta-regeneração 30,31. Aproveitando este atributo de SpNox, E. células coli que expressam HjLAD para a produção de L-xilulose foram acoplados com E. células coli que expressam SpNox para a regeneração do NAD + para aumentar a produção de L-xilulose representado pela reacção acoplado mostrado na Figura 1A. Sob condições ideais e usando uma concentração inicial de mM de L-arabinitol 150, o rendimento máximo de L-xilulose atingiu 96%, tornando este sistema muito mais eficiente do que os relatados na literatura.

A estratégia de imobilização de célula inteira foi utilizado ao lado de aumentar ainda mais a capacidade de reutilização do biocatalyt acopladosistema IC. Métodos comumente usados ​​para a imobilização de células inteiras incluem adsorção / o encadeamento covalente a matrizes sólidas, a reticulação / arrastamento e encapsulamento em redes poliméricas 32. Entre estas abordagens, o método mais adequado para a imobilização de células é encapsulamento em pérolas de alginato de cálcio. Suas propriedades de gelificação leves, matriz aquosa inerte e alta porosidade ajudar a preservar as propriedades fisiológicas e funcionalidade dos produtos biológicos encapsulados 33. Portanto, o sistema de biocatalisador acoplado contendo tanto E. células de E. coli que abrigam HjLAD ou SpNox foi imobilizado em pérolas de alginato de cálcio para permitir que vários ciclos de produção de L-xilulose (Figura 2) .O sistema de biocatalisador imobilizado demonstrou boa estabilidade operacional, mantendo 65% do rendimento de conversão do primeiro ciclo após 7 ciclos de sucessiva reutilização, enquanto que o sistema de célula livre perdeu quase completamente a sua actividade catalítica.

Protocolo

1. Whole-cell Biocatalisadores Preparação

NOTA: O E. recombinante coli que abrigam pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 são doravante referida como E. coli e E. SpNox coli HjLAD, respectivamente.

  1. Inocular uma única colônia de E. coli HjLAD em 3 ml de meio suplementado com canamicina (50 ug / ml) de Luria-Bertani (LB) e incubar num incubador agitador de O / N a 37 ° C, 250 rpm.
  2. Dilui-se a cultura de 1: 100 em 200 mL de LB fresco contendo 50 ug / ml de canamicina e incubar a 37 ° C, 250 rpm até a DO600 atingir ~ 0,6.
  3. Induzir a expressão da proteína por adição de HjLAD 0,1 mM de isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) ao meio de cultura e incuba-se a 16 ° C, 180 rpm durante 16 horas.
    1. Como alternativa, executar a indução a 25 ° C, 200 rpm durante 6 horas, se a biossíntese de L-xilulose (Passo 2 abaixo) é realizada no mesmo dia.
  4. Colher o E. induzida coli HjLAD por centrifugação a 3200 xg durante 20 minutos a 4 o C. Descartar o sobrenadante e prossiga para a Etapa 2 para processar o pellet celular.
  5. Em paralelo, executar as etapas 1,1-1,4 por E. coli SpNox.

2. Biossíntese de L-xilulose por acoplamento E. coli e E. HjLAD coli SpNox para Cofator Regeneração

  1. Ressuspender as peletes de células de E. coli e E. HjLAD coli SpNox separadamente em tampão Tris 50 mM-HCl (pH 8,0) a uma densidade celular de 5,0 g de peso celular seco (gDCW) / L.
    Nota: A correlação entre gDCW e a densidade óptica medida a 600 nm (OD 600) pode ser criada para facilitar o experimento. A fórmula utilizada noeste protocolo é uma gDCW / L = 0,722 * OD 600-,0965, que pode variar entre os diferentes espectrômetros.
  2. Misturar 600 mL de 5,0 gDCW / G E. coli HjLAD, 600 ul de 5,0 gDCW / G E. coli SpNox, 100 ul de 20 mM de NAD +, e 150 ul de 2 M de L-arabinitol em uma 14 ml de tubos de fundo redondo, e perfazer um volume de reacção de 2 ml por adição de 550 ul de Tris-HCl 50 (pH 8,0) .
    Nota: O rácio da quantidade biocatalisadores de célula inteira dois podem ser optimizadas para melhorar a biossíntese do produto. Para o sistema descrito, uma proporção de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 verificou-se ser óptima para a L-xilulose biossíntese (Figura 1B).
  3. Incubar a mistura de reacção a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h.
  4. Recolhe-se o sobrenadante após centrifugação a 4 ° C, 3,200 xg durante 10 minutos, umaND prosseguir para quantificar a produção de L-xilulose, tal como descrito no Passo 3 abaixo.

3. Ensaio colorimétrico para a quantificação de L-xilulose

  1. Aspirar 100 ul do sobrenadante de reacção recolhidas a partir do passo 2.4 para um tubo de 1,5 ml.
  2. Adicionar 50 ul de 1,5% de cisteína, 900 uL de ácido sulfúrico a 70%, e 50 ul de 0,1% de carbazole dissolvido em etanol e misturar suavemente por inversão do tubo 3 vezes.
  3. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C, 200 rpm durante 20 min.
  4. Medir a absorvância óptica da mistura de reacção a 560 nm (A 560), utilizando um espectrofotómetro.
    1. Diluir a mistura de reacção se a leitura A 560 está acima de 1.

4. A imobilização de catalisadores de células inteiras recombinantes em esferas de alginato de cálcio

  1. Dissolve-se 4 g de alginato de sódio em 100 ml de água destilada. Preparar a solução de alginato adicionando soídio alginato de água para evitar a formação de grumos. Aquece-se a mistura, se necessário.
  2. Adicionar 600 uL de 5,0 gDCW / G E. coli HjLAD e 600 ul de 5,0 gDCW / G E. coli SpNox em 1,2 ml de 4% de alginato preparada no passo 4.1 e misturar as células e alginato por pipetagem suave, para evitar a formação de bolhas.
  3. Aspirar a suspensão de alginato / célula para uma seringa utilizando uma agulha e adicionar-se a mistura gota a gota em um cloreto de cálcio 0,3 M de solução (CaCl 2) numa proveta de 100 ml com agitação contínua.
    Nota: O volume de solução de CaCl2 utilizada para a formação de drageia de alginato deve ser suficiente para que as gotículas de alginato de ser completamente submerso. Além disso, a distância entre a agulha da seringa e a superfície da solução de cloreto de cálcio tem de ser mantido dentro de uma gama óptima para assegurar a formação de grânulos uniformemente esférica. A faixa ótima distância pode ser determinada experiênciaaliado e depende do diâmetro interior da agulha. Como estimativa, uma distância de ~ 15 ± 5 cm verificou-se ser óptima para uma agulha de seringa 0,6 cm (diâmetro interno).
  4. Deixar os grânulos na solução de CaCl2 para 2-3 horas à temperatura ambiente sem agitação para permitir a formação de reticulação de gel e grânulos.
  5. Decantar a solução de CaCl 2, sem perturbar as esferas vertendo cuidadosamente a solução de CaCl2 para um tubo cónico de 50 ml, e transferir os grânulos restantes em solução de CaCl2 para outro tubo de 50 ml.
  6. Lavam-se as esferas com 10 ml de Tris-HCl 50 (pH 8,0) três vezes para remover células excessivas CaCl2 e un-encapsulada.
    NOTA: Em um determinado passo, não centrifugar as contas como isso irá romper-los. Para separar os grânulos a partir da solução, para permitir que a suspensão em repouso durante 3-5 minutos. As contas vai assentar no fundo e o tampão de lavagem pode ser decantadoem um outro recipiente.
    1. Não descarte o tampão de lavagem usado. A piscina do buffer utilizado Tris-HCl de lavagem (30 ml) com a solução usada CaCl2 recolhidos a partir do passo 4.5.
  7. Agregar as E. imobilizada-un células de E. coli por centrifugação da solução de CaCl 2 e de Tris-HCl reunidas recolhidas a partir do passo 4.6 a 3.200 xg durante 20 min. Para determinar a eficiência de imobilização, calcular a densidade das células peletizadas un-encapsulado em gDCW / L, tal como descrito na etapa 2.1.
  8. Transferir as esferas lavadas a partir do passo 4.6 em um tubo. Siga passos 2.2 - 3.4 para avaliar a biossíntese de L-xilulose usando todas as esferas lavadas em lugar de sedimentos celulares.

5. Estabilidade Ensaio de Imobilizados Biocatalisadores para a Produção L-xilulose

  1. Recolher os grânulos do passo 4.8 e lavar duas vezes com 10 ml de Tris-HCl 50 (pH 8,0) tampão sem centrifugação (conforme descrito no Passo 4.6).
  2. use todadas pérolas lavadas para realizar a reacção tal como descrito nos passos 2.2 - 3.4.
  3. Repita os passos de 5,1-5,2 para o número desejado de ciclos de produção e medir a quantidade de L-xilulose produzida no sobrenadante da reacção em cada ciclo.

Resultados

Para permitir a co-factor de regeneração, a síntese de L-xilulose foi realizada num sistema de célula inteira biocatalítica acoplado contendo E. coli e E. HjLAD coli SpNox. Após a optimização de vários parâmetros, a capacidade de reutilização do sistema foi melhorada por meio da imobilização que em pérolas de alginato de cálcio (Figura 2).

Discussão

Recentes avanços tecnológicos têm permitido um aumento na comercialização de biotherapeutics recombinantes, resultando em um aumento gradual no seu valor de mercado na indústria de biotecnologia. Um tal avanço é o advento da engenharia metabólica em microorganismos recombinantes, que tem mostrado uma grande promessa no estabelecimento de sistemas industriais escaláveis ​​38. Tal como acontece com a maioria dos processos, o sucesso na comercialização de biomoléculas recombinantes produzidas po...

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes. O documento tem como objetivo relatar metodologia detalhada para gerar um sistema biocatalítico de célula inteira acoplado imobilizada em esferas de alginato. Novidades científicas têm sido relatados em um estudo anterior 16.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa em Ciência Básica através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (NRF-2013R1A1A2012159 e NRF-2013R1A1A2007561), Universidade Konkuk, e do Departamento de Engenharia Química e MCubed programa da Universidade de Michigan.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
LB broth Sigma AldrichL3022-6X1KG
KanamycinFisherBP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-10G
Tris baseFisherBP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigma AldrichN7004-1G
L-ArabinitolSigma AldrichA3506-10G
L-CysteineSigma Aldrich168149
Sulfuric acidSigma Aldrich320501-500ML
CarbazoleSigma AldrichC5132
Ethanol FisherBP2818-4
Sodium alginateSigma AldrichW201502
Calcium chloride dihydrateSigma Aldrich223506-500G
Excella E24 shaker incubatorNew Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis SpectrophotometerAgilent Technologies
Centrifuge 5810REppendrof
BeakersFisher
SyringeFisher
NeedleFisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing BalanceOhaus

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