L'immobilizzazione di Multi-biocatalizzatori in perline alginato per cofattore Rigenerazione e migliorata Riusabilità

Riepilogo

Presentato è il protocollo per biocatalizzatori cellule intere co-immobilizzazione per la rigenerazione del cofattore perfezionata riutilizzabilità, utilizzando la produzione di L-xilulosio come esempio. La rigenerazione cofattore è ottenuta accoppiando due ceppi di Escherichia coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari; il biocatalizzatore immobilizzazione whole-cell si ottiene incapsulamento delle cellule in perline alginato di calcio.

Abstract

Abbiamo recentemente sviluppato un sistema semplice, riutilizzabile ed accoppiato biocatalitico whole-cell con la capacità di rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per una migliore resa produttiva e sintesi sostenuta. Qui descritta è la procedura sperimentale per lo sviluppo di un sistema costituito da due E. ceppi coli che esprimono gli enzimi funzionalmente complementari. Insieme, questi due enzimi possono funzionare co-operativamente per mediare la rigenerazione di cofattori costosi per migliorare la resa del prodotto del bioreaction. Inoltre, è riportato il metodo di sintetizzare una forma immobilizzata del sistema biocatalitico accoppiato per incapsulamento di cellule intere in perline di alginato di calcio. Come esempio, presentiamo i migliorata biosintesi di L-xilulosio da L-arabinitol accoppiando E. coli che esprimono gli enzimi L-arabinitol deidrogenasi o NADH ossidasi. In condizioni ottimali tramite una concentrazione iniziale di 150mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, che è superiore a quelli riportati in letteratura. La forma immobilizzata dei biocatalizzatori cellule intere accoppiati dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa ottenuto nel primo ciclo dopo 7 cicli di successive riutilizzo, mentre il sistema cella libera perso quasi completamente l'attività catalitica. Pertanto, i metodi qui riportati fornisce due strategie che potrebbero favorire la produzione industriale di L-xilulosio, così come altri composti a valore aggiunto che richiedono l'uso di cofattori in generale.

Introduzione

Riduttiva biotrasformazione cellula intera utilizzando microrganismi è diventato un metodo molto diffuso per la sintesi chemo-enzimatica di vista commerciale che terapeutico biomolecole importanti ^{1 - 3.} Esso presenta diversi vantaggi rispetto all'uso di enzimi isolati, in particolare l'eliminazione dei processi di purificazione a valle costose e la dimostrazione di una maggiore durata ^{4 - 7.} Per i percorsi biocatalitici in cui sono richiesti cofattori per la formazione del prodotto, sistemi di cellule intere hanno il potenziale di fornire la rigenerazione del cofattore situ tramite l'aggiunta di poco costoso donatori di elettroni co-substrati ^5,8,9. Tuttavia, questa capacità è diminuita per le reazioni che richiedono una concentrazione stechiometrica di rare o costose co-substrati ^{10 - 13.} Insieme con scarsa riutilizzabilità di cellule intere, questo impedisce la creazione di un produ scalabile e continuoSistema ction. sono richieste modifiche strategica dei sistemi di cellule intere per queste biotrasformazioni cofattore-dipendente di superare i limiti di cui sopra. In particolare, la combinazione di biocatalizzatori cellule intere che lavorano insieme hanno dimostrato di migliorare notevolmente la produttività e la stabilità degli enzimi nutriti ^14. Questi fattori, che sono spesso critici per consentire la produzione su larga scala di prodotti commercialmente validi, possono essere ottimizzati ulteriormente da microbi biocatalitici co-immobilizzare ^15. Abbiamo recentemente sviluppato un sistema biocatalitico cellula intera semplice e riutilizzabile che consente sia la rigenerazione del cofattore e biocatalizzatore immobilizzazione per la produzione di L-xilulosio ^16. In questo studio, questo sistema è stato utilizzato come esempio per illustrare le procedure sperimentali di applicazione di queste due strategie per una migliore resa produttiva biotrasformazione e biocatalizzatore riutilizzabilità.

L-xilulosio appartiene ad una classiss di molecole biologicamente utili denominato zuccheri rare. Zuccheri rare sono monosaccaridi unici o derivati ​​di zucchero che si verificano molto raramente in natura, ma giocano un ruolo cruciale come elementi di riconoscimento di molecole bioattive ^17,18. Hanno una varietà di applicazioni che vanno da dolcificanti, alimenti funzionali a potenziali terapie ^19. L-xilulosio può essere utilizzato come potenziale inibitore di più alfa-glucosidasi, e può anche essere utilizzato come indicatore di epatite o cirrosi epatica ^17,20. Conversione Alta efficienza di xilitolo a L-xylulose nei sistemi di cellule intere stato segnalato in precedenza in Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. 701B ^23, Bacillus pallido Y25 ^24,25 ed Escherichia coli ^26. In E. coli, tuttavia, è stato raggiunto solo usando (<67 mM) basse concentrazioni di xilitolo ²⁶ a causa di potenziali effetti inibitori di una concentrazione iniziale xilitolo superiori all'100 mm su attività xilitolo-4-deidrogenasi ^21,26. L'equilibrio termodinamico tra xylulose e xilitolo ha dimostrato di favorire fortemente la formazione di xilitolo ^25,27. Inoltre, la resa xylulose è limitata dalla quantità di cofattori costosi che devono essere fornite in assenza di un sistema di rigenerazione cofattore situ. Insieme, questi fattori limitano la possibilità di scalare in sistemi sostenibili per la biosintesi L-xylulose.

Per superare queste limitazioni e migliorare la resa biotrasformazione L-xylulose, la strategia di rigenerazione del cofattore è stato impiegato dapprima attraverso la definizione di un sistema di biocatalitico cellula intera accoppiato. Specificamente, L-Arabinitol 4-deidrogenasi (EC 1.1.1.12) da Hypocrea jecorina (HjLAD), un enzima del catabolismo L-arabinosio di funghi, è stato selezionato per catalizzare la conversione di L-arabinitol in L-xilulosio ^28,29 . Come molti enzimi biosintetici, un importante limitation di HjLAD è che richiede una quantità stechiometrica del costoso nicotinamide adenina dinucleotide cofattore (NAD ^+, la forma ossidata di NADH) per eseguire questa conversione. NADH ossidasi trovato in Streptococcus pyogenes (SpNox) ha dimostrato di visualizzare l'attività di alta cofattore-rigenerazione ^30,31. Approfittando di questo attributo di SpNox, E. coli che esprimono HjLAD per la produzione di L-xilulosio stati accoppiati con E. coli che esprimono SpNox per la rigenerazione di NAD ⁺ per aumentare la produzione di L-xilulosio rappresentato dalla reazione accoppiata mostrato nella Figura 1A. In condizioni ottimali e con una concentrazione iniziale di 150 mM L-arabinitol, il massimo rendimento L-xilulosio raggiunto 96%, rendendo questo sistema molto più efficiente di quelli riportati in letteratura.

La strategia di immobilizzazione a cellule intere è stato impiegato vicino per migliorare ulteriormente la riusabilità del biocatalyt accoppiatosistema IC. Metodi comunemente usati per l'immobilizzazione a cellula intera includono adsorbimento / covalente collegamento a matrici solide, cross-linking / intrappolamento e l'incapsulamento nelle reti polimeriche ^32. Tra questi approcci, il metodo più adatto per l'immobilizzazione di cellule è incapsulamento in perle di alginato di calcio. Le loro proprietà di gelificazione mite, matrice acquosa inerte e ad alta porosità aiutare a preservare le proprietà fisiologiche e le funzionalità dei prodotti biologici incapsulati ^33. Pertanto, il sistema biocatalizzatore accoppiato contenente sia E. coli che ospitano HjLAD o SpNox è stato immobilizzato in perline di alginato di calcio per consentire a più cicli di produzione L-xilulosio (Figura 2) .Il sistema biocatalizzatore immobilizzato dimostrato una buona stabilità operativa, mantenendo il 65% della resa di conversione del primo ciclo dopo 7 cicli di successivo riutilizzo, mentre il sistema cella libera quasi completamente perso la sua attività catalitica.

Protocollo

1. Whole-cell biocatalizzatori Preparazione

NOTA: Il ricombinante E. coli che ospitano pET28a- SpNox ³¹ o pET28a- HjLAD ²⁸ sono di seguito indicati come E. coli _SpNox ed E. coli _HjLAD rispettivamente.

1. Inoculare una singola colonia di E. coli _HjLAD in 3 ml di Luria-Bertani (LB) medium supplementato con kanamicina (50 ug / ml) e incubare in un incubatore shaker O / N a 37 ^° C, 250 rpm.
2. Diluire la coltura da 1: 100 a 200 ml di fresca LB contenenti 50 ug / ml kanamicina e incubare a 37 ^° C, 250 rpm fino alla OD ₆₀₀ raggiunge ~ 0,6.
3. Indurre l'espressione della proteina HjLAD aggiungendo 0,1 mM isopropil β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) al mezzo di coltura e incubare a 16 ^° C, 180 rpm per 16 ore.
   1. In alternativa, eseguire l'induzione a 25 ^° C, 200 rpm per 6 ore se la biosintesi L-xilulosio (Fase 2 sotto) è eseguito lo stesso giorno.
4. Raccogliere il E. indotto coli _HjLAD cellule per centrifugazione a 3.200 xg per 20 min a 4 ^° C. Eliminare il surnatante e procedere al passaggio 2 per elaborare il pellet.
5. In parallelo, eseguire i passaggi 1,1-1,4 per E. coli _SpNox.

2. Biosintesi di L-xylulose accoppiando E. coli _HjLAD ed E. coli _SpNox per Cofactor Rigenerazione

1. Risospendere il pellet di cellule di E. coli _HjLAD ed E. coli _SpNox separatamente in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) ad una densità cellulare di 5,0 g di peso secco cellulare (gDCW) / L.
   Nota: Una correlazione tra gDCW e la densità ottica misurata a 600 nm (OD ₆₀₀₎ può essere stabilito per facilitare l'esperimento. La formula utilizzata inquesto protocollo è 1 gDCW / L = 0,722 * OD _600-,0965, che può variare tra i diversi spettrometri.
2. Mescolare 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli _HjLAD, 600 microlitri di 5.0 gDCW / L E. coli _SpNox, 100 ml di 20 mM NAD ^+, e 150 ml di 2 M L-arabinitol in un 14 ml di tubo a fondo rotondo e portare il volume di reazione a 2 ml con l'aggiunta di 550 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) .
   Nota: Il rapporto tra la quantità biocatalizzatori due cellula intera può essere ottimizzato per migliorare la biosintesi del prodotto. Per il sistema descritto, un rapporto di E. coli _SpNox: E. coli _HjLAD = 1: 1 è risultato essere ottimale per L-xylulose biosintesi (Figura 1B).
3. Incubare la miscela di reazione a 30 ^° C, 200 rpm per 8 ore.
4. Raccogliere il surnatante dopo centrifugazione a 4 ^° C, 3.200 xg per 10 min aND procede per quantificare la produzione di L-xylulose come descritto al punto 3 di seguito.

3. colorimetrico test per la quantificazione L-xylulose

1. Aspirare 100 pl del supernatante reazione raccolto dal punto 2.4 in una provetta da 1,5 ml.
2. Aggiungere 50 ml di 1,5% cisteina, 900 ml di acido solforico al 70%, e 50 ml di 0,1% carbazolo disciolto in etanolo e mescolare delicatamente invertendo la provetta 3 volte.
3. Incubare la miscela di reazione a 37 ^° C, 200 rpm per 20 min.
4. Misurare l'assorbanza ottica della miscela di reazione a 560 nm (A ₅₆₀₎ utilizzando uno spettrofotometro.
   1. Diluire la miscela di reazione se la lettura A ₅₆₀ è superiore a 1.

4. L'immobilizzazione di catalizzatori ricombinanti cellula intera in perline alginato di calcio

1. Sciogliere 4 g di sodio alginato in 100 ml di acqua distillata. Preparare la soluzione di alginato con l'aggiunta di sodium alginato di acqua per evitare la formazione di grumi. Scaldare la miscela, se necessario.
2. Aggiungere 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli _HjLAD e 600 ml di 5,0 gDCW / L E. coli _SpNox in 1,2 ml 4% alginato preparata nella fase 4.1 e mescolare le cellule e alginato delicatamente pipettando per evitare la formazione di bolle.
3. Aspirare la sospensione alginato / cellulare in una siringa con ago e aggiungere il composto goccia a goccia in un cloruro di calcio 0,3 M soluzione (CaCl ₂₎ in un becher da 100 ml con agitazione continua.
   Nota: Il volume di ₂ soluzione CaCl utilizzato per la formazione del branello alginato dovrebbe essere sufficiente per le goccioline alginato per essere completamente sommerse. Inoltre, la distanza tra l'ago della siringa e la superficie della soluzione di cloruro di calcio deve essere mantenuta entro un range ottimale per garantire la formazione di perline uniformemente sferiche. L'intervallo ottimale distanza può essere determinata esperimentoally e dipende dal diametro interno dell'ago. Come una stima, una distanza di ~ 15 ± 5 cm è risultata ottimale per 0,6 cm (diametro interno) della siringa.
4. Lasciare le perline nella soluzione CaCl ₂ per 2 - 3 ore a temperatura ambiente senza mescolare per permettere la formazione di reticolazione e gel perline.
5. Decantare la soluzione CaCl ₂ senza disturbare le perline versando con attenzione la soluzione CaCl ₂ in un tubo conico da 50 ml, e trasferire le restanti sfere in ₂ soluzione CaCl in un altro tubo da 50 ml.
6. Lavare le perline con 10 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) Buffer tre volte per rimuovere le cellule eccessivi CaCl ₂ e UN-incapsulato.
   NOTA: In qualsiasi fase, non centrifugare le perle come così facendo li rottura. Per separare le perline dalla soluzione, evitando la formazione di riposare indisturbati per 3-5 min. Le perle si depositano sul fondo e il tampone di lavaggio possono essere decantatoin un altro contenitore.
   1. Non gettare il tampone di lavaggio utilizzato. PISCINA La buffer utilizzato Tris-HCl lavaggio (30 ml) con la soluzione utilizzata CaCl ₂ raccolte dal punto 4.5.
7. Agglomerare le non-immobilizzato E. coli per centrifugazione della soluzione di CaCl ₂ e Tris-HCl pool raccolti dal passaggio 4,6 a 3.200 xg per 20 min. Per determinare l'efficienza di immobilizzazione, calcolare la densità delle cellule non-incapsulati pellet in gDCW / L come descritto al punto 2.1.
8. Trasferire le perline lavati dal punto 4.6 in un tubo. Seguire passaggi 2.2 - 3.4 per valutare la biosintesi L-xilulosio utilizzando tutte le perline lavati in luogo di pellet cellulari.

5. Stabilità Assay di immobilizzato biocatalizzatori per la produzione di L-xylulose

1. Raccogliere le perline dal punto 4.8 e lavare due volte con 10 ml di 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer senza centrifugazione (come descritto nel punto 4.6).
2. utilizzare tuttedelle perline lavate per eseguire la reazione come descritto ai punti 2.2 - 3.4.
3. Ripetere i punti 5.1 - 5.2 per il numero di cicli produttivi e misurare la quantità di L-xilulosio prodotta nel supernatante di reazione in ogni ciclo.

Risultati

Per attivare la rigenerazione del cofattore, sintesi L-xilulosio è stata effettuata in un sistema biocatalitico cellula intera accoppiato contenente E. coli _HjLAD ed E. cellule coli _SpNox. Dopo l'ottimizzazione dei vari parametri, la riutilizzabilità di questo sistema è stato migliorato immobilizzando in perline di alginato di calcio (Figura 2).

Discussione

I recenti progressi tecnologici hanno permesso un aumento nella commercializzazione di bioterapie ricombinanti, con un conseguente aumento graduale nel loro valore di mercato nel settore della biotecnologia. Un tale progresso è l'avvento dell'ingegneria metabolica nei microrganismi ricombinanti, che ha mostrato una grande promessa nella creazione di sistemi industriali scalabili ^38. Come con la maggior parte dei processi, il successo della commercializzazione di biomolecole ricombinanti prodotte da m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus