3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Zusammenfassung

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

Zusammenfassung

Cartilage Engineering bleibt eine Herausforderung aufgrund der Schwierigkeiten in einer in - vitro - Funktions Implantat ähnlich dem nativen Gewebe zu schaffen. Ein Ansatz vor kurzem für die Entwicklung von autologem Ersatz erforscht beinhaltet die Differenzierung von Stammzellen in Chondrozyten. Zur Einleitung dieses Chondrogenese, einen Verdichtungsgrad der Stammzellen erforderlich ist; Somit haben wir gezeigt, die Machbarkeit der magnetisch Kondensieren Zellen sowohl innerhalb dicken Gerüste und Gerüstfrei, unter Verwendung von miniaturisierten Magnetfeldquellen als Zell Attraktoren. Dieser magnetische Ansatz wurde auch zur Führung Aggregat Fusion verwendet und gerüstfrei organisiert, dreidimensionale (3D) Gewebe mehr Millimeter groß zu bauen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer verbesserten Größe aufweist, wobei die durch magnetische angetriebene fusion gebildete Gewebe stellte eine signifikante Zunahme der Expression von Kollagen II, und ein ähnlicher Trend wurde für Aggrecan Expression beobachtet. Da die nativen Knorpel wurde Kräfte t ausgesetztHut seine 3D-Struktur, dynamische Reifung beeinflusst wurde ebenfalls durchgeführt. Ein Bioreaktor, die mechanischen Reiz liefert wurde, um die magnetisch ausgesät Gerüste über einen Zeitraum von 21 Tagen zur Kultur verwendet. Bioreactor Reifung weitgehend Chondrogenese in die cellularized Gerüste verbessert; die extrazelluläre Matrix unter diesen Bedingungen erhalten wurde, war reich an Kollagen II und Aggrecan. Diese Arbeit beschreibt das innovative Potential der magnetischen Kondensation von markierten Stammzellen und dynamischer Reifung in einem Bioreaktor für eine verbesserte chondrogene Differenzierung, beide Gerüstfrei und innerhalb Polysaccharid Gerüste.

Einleitung

Magnetische Nanopartikel ist bereits in der Klinik als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRI) verwendet wird, und die therapeutischen Anwendungen weiter wachsen. Zum Beispiel hat es vor kurzem , dass markierte Zellen in vivo unter Verwendung eines externen Magnetfeld manipuliert werden können , gezeigt worden und können an einer definierten Stelle der Implantation ^{1, 2, 3} gerichtet und / oder aufrechterhalten werden. In der regenerativen Medizin, können sie organisierte Gewebe in vitro ^4, einschließlich Gefäßgewebe ^{5, 6, 7, 8} Knochen, Knorpeln und ⁹ zu konstruieren , werden verwendet.

Gelenkknorpel wird in einer avaskuläre Umgebung eingetaucht, Reparaturen der extrazellulären Matrix-Komponenten Herstellung sehr begrenzt, wenn Schäden auftreten. Aus diesem Grund research wird zur Zeit auf dem Engineering von hyalinem Knorpelersatz konzentriert, die an der defekten Stelle implantiert werden können. Um einen autologe Ersatz einige Forschungsgruppen untersuchen die Verwendung von autologem Chondrozyten als Zellquelle ^{10, 11,} zu erzeugen , während andere die Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen (MSC) in ¹² betonen Chondrozyten zu ^{differenzieren, 13.} In früheren Studien hier rekapituliert, wählten wir MSC, als ihr Knochenmark Probenahme ist ziemlich einfach und erfordert nicht das Opfer von gesunden Chondrozyten, die ihren Phänotyp ¹⁴ verlieren riskieren.

Ein früher Schritt wesentlich für die chondrogene Differenzierung von Stammzellen Einleitung ist ihre Kondensation. Zellaggregate werden unter Verwendung entweder Zentrifugation oder Mikromassenkultur ¹⁵ allgemein gebildet; jedoch neithe diese Kondensationsverfahrenr stellen die potentiellen Zellcluster innerhalb dicken Gerüste noch das Potential zu schaffen, die Fusion von Aggregaten zu steuern. unter Verwendung von MSC magnetische Markierung und magnetische Anziehung In diesem Papier beschreiben wir einen innovativen Ansatz Stammzellen zu kondensieren. Diese Technik hat sich bewährt miteinander zu erhalten , die eine Millimeterskala knorpeligen Gewebe ⁹ gerüstfreie 3D - Konstrukte über die Fusion von Aggregaten zu bilden. Magnetische Aussaat von dicken und großen Gerüsten hat auch die Möglichkeit der Erhöhung die Größe des erzeugten Gewebes erlaubt, eine Form leichter nützlich für die Implantation der Gestaltung und das Potenzial für die klinische Anwendung bei der Knorpelreparatur zu diversifizieren. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für das magnetische Aussäen von MSC in poröse Gerüste , bestehend aus natürlichen Polysacchariden, Pullulan und Dextran, Gerüste bisher verwendeten Stammzellen beschränken ^{16, 17.} Chondrogene Differenzierung war finally durchgeführt in einem Bioreaktor kontinuierliche Nährstoff- und Gasdiffusion in die Matrixkerne der Gerüste mit einer hohen Dichte von Zellen ausgesät zu gewährleisten. Neben Nährstoffe, chondrogene Wachstumsfaktoren und Gas zu den Zellen bereitstellt, bot der Bioreaktor mechanische Stimulation. Insgesamt ist die magnetische Technologie zu beschränken Stammzellen verwendet, kombiniert mit dynamischer Reifung in einem Bioreaktor, kann deutlich chondrogene Differenzierung verbessern.

Protokoll

1. Aufbau der Magneteinrichtungen

HINWEIS: Die Vorrichtungen zur Zellbesiedelung verwendet , variieren je nach der Anwendung (Abbildung 1). Aggregat zu bilden, wird die Anzahl der Zellen auf 2,5 × 10 ⁵ / Aggregat begrenzt, so dass die magnetischen Spitzen sehr dünn sein muss (750 & mgr; m im Durchmesser). Um das 1,8 cm ^2/7 mm dickes Scaffolds Saatgut, müssen die Magnete größer (3 mm im Durchmesser) , und werden die Zellmigration durch die Poren des Gerüsts gewährleisten.

1. Aufbau einer Vorrichtung mit Mikromagnete für Aggregatbildung (1A)
   1. Make Mikrolöcher mit einem 0,8-mm-Bohrer durch Aluminiumbleche (3 cm im Durchmesser und 6 mm dick).
   2. Legen Sie eine magnetische Spitze (750 & mgr; m im Durchmesser) in jedes Loch der Platte.
   3. Diese Scheibe über einen Permanentmagnet Neodymium, die Magnetisierung bis zur Sättigung gewährleistet.
2. Aufbau einer Vorrichtung für Gerüst Aussaat ( 1B)
   1. Schneidet harten Polystyrol in 2,4 cm ² Quadrate.
   2. Einsatz 9 kleine Magnete (3 mm im Durchmesser, 6 mm lang) in einem gleichen Abstand über eine Fläche von 1,6 cm ^_2.
   3. Dieses Gerät über einen permanenten Neodym-Magneten.

2. Stem Cell Labeling

HINWEIS: Es wurden Stammzellen mit 0,1 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (2,6 ± 0,2 pg Eisen / Zelle) markierte Aggregate zu bilden, während sie mit 0,2 mM magnetischen Nanopartikeln für 30 min (5 ± 0,4 pg Eisen / Zelle) markiert wurden auf Saatgut Gerüste. Diese Nanopartikel - Konzentrationen und Inkubationszeiten wurden bereits veröffentlicht und für MSC und anderen Zellen ^{18, 19,} verwendet , und es bestimmt wurde , dass Nanopartikel beeinflusst weder die Lebensfähigkeit der Zellen noch MSC Differenzierungsfähigkeit. Die Eisenmasse von den Stammzellen eingebracht wurde mittels Single-ce gemessenll Magnetophorese ^{19, 20.}

1. Kultur von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) in komplettem mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 ° C und 5% CO ₂ , bis nahe zur Konfluenz (~ 90%).
2. Bereiten Sie die magnetische Markierungslösung durch Mischen von 0,1 oder 0,2 mM Maghemit Citrat beschichteten Eisenoxid (γFe ₂ O _3; Kern: 8 nm Durchmesser) in serumfreien 5A Medium McCoy modifizierte bei Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ohne Glutamin und enthaltend 5 mM Natriumcitrat.
3. Entsorgen des Mediums, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI - Medium ohne Glutamin und 10 ml Eisenoxid - Nanopartikel - Lösung pro 150 cm ² Kulturkolben, dem minimalen Volumen benötigt , um alle Zellen zu bedecken.
4. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und 5% CO ₂ und dann die Nanopartikel - Lösung verwerfen. Spülen für 5 Minuten mit serumfreiem RPMI-Medium ohne Glutamin nan das internalisierenoparticles noch an die Plasmamembran gebunden.
5. Verwerfen Sie den RPMI-Medium und 25 ml komplettes Medium MSCGM pro Kolben. Inkubiere über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.

3. Magnetische Zell Seeding

1. Frisch bereiten das chondrogenen Medium nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose mit L-Glutamin durch Zugabe von 50 & mgr; M L-Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 & mgr; M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin, 1% universelle Kultur Ergänzung mit Insulin, Transferrin und menschliche Selenige Säure (ITS-Premix) und 10 ng / ml transformierender Wachstumsfaktor-beta 3 (TGF-β3).
2. Lösen sie die magnetischen Zellen unter Verwendung von 8 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro 150 cm ² Kulturkolben und zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 × g für 5 min. Anzusaugen, das Medium und zähle die resuspendierten Zellen.
3. Eine Glasboden-Zellkultur-Petrischale (35 mm) auf der Oberseite der beiden Magnetvorrichtungen.
4. Um magnetically Aggregate bilden, 3 ml chondrogenen Medium zu der Petrischale hinzuzufügen und sanft das kleinste Volumen möglich ist (nicht mehr als 8 & mgr; l) , die 2,5 × 10 ⁵ Zellen pro Aggregat markierten Ablagerung (bis zu 16 Aggregaten abgelagert werden kann). Lassen Sie die Petrischale für 20-30 min ohne ihn zu bewegen, so dass es Sphäroide zu bilden, und dann das komplette Gerät, einschließlich der Petrischale mit 16 die Aggregate in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Formsteuer Aggregate nach dem gleichen Protokoll und ersetzen das gesamte Medium mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3.
   1. Um das 3D-Aggregat-Konstrukt zu erzeugen, legen zwei Aggregate in Kontakt am Tag 8-8 Dubletten zu bilden und die Fusion einzuleiten. Am Tag 11, fusionieren 2 Dubletten 4 Vierlinge zu bilden. Schließlich verschmelzen die vier Vierlinge am Tag 15 die endgültige Struktur zu erhalten.
   2. Zur gleichen Zeit bilden sich Aggregate von 2,5 x 10 ⁵ Zentrifugieren markierten Stammzellen bei 26015; g für 5 min in 15-ml-Röhrchen mit 1,5 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe und die Kontrolle, jeweils).
6. Magnetisch seed Scaffolds Platzieren jedes getrocknetes Gerüst in eine Petrischale. Verwenden Polysaccharid poröse Gerüste aus Pullulan / Dextran - ^21. Für jedes Gerüst, verdünnte 2 × 10 ⁶ markierte Stammzellen in 350 & mgr; l von chondrogenen Medium ohne TGF-β3 und sorgfältig die Zellen auf das Gerüst pipettieren.
   1. bei 37 ° C für 5 min inkubieren Vollzellpenetration innerhalb des Gerüsts zu ermöglichen, und fügen Sie dann vorsichtig 3 ml chondrogenen Medium mit oder ohne TGF-β3 (für die Probe oder Kontrolle, jeweils), um die Petrischale.
   2. Inkubiere das cellularized Gerüst an seiner Magnetvorrichtung bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 4 Tage für Zellmigration durch die Poren und das Gerüstes Confinement zu ermöglichen.
7. Zur gleichen Zeit, Samen Gerüste mit 2 x 10 ⁶ markierte Stammzellen nach dem gleichen Verfahren und Inkubieren ohne die Magneten gleichmäßig seeded Gerüste als positive Kontrollen zu erhalten.

4. Differenzierung in Chondrozyten

HINWEIS: Nach 4 Tagen Inkubation entfernen, die Magnete und weiterhin die chondrogene Reifung entweder in einer Petrischale (statische Bedingungen) oder in einem Bioreaktor (dynamische Bedingungen). Negative Kontrollproben werden in statischen Bedingungen mit chondrogenen Medium ohne TGF-β3 gereift.

1. In statischen Bedingungen halten die cellularized Gerüste oder Aggregate in der gleichen Petrischale. Ändern Sie den chondrogenen Medium zweimal pro Woche für 21 Tage.
2. In dynamischen Bedingungen, bereitet den Bioreaktor.
   1. Schneiden Silikonschlauch an der entsprechenden Länge entsprechend dem Protokoll des Herstellers.
   2. Autoklaviert alle Materialien: 500 ml Kulturkammer, Schläuche, 2-Wege-Rotatoren und Käfige.
   3. Legen Sie die Bioreaktor Teile in einen sterilen microbiologische Sicherheit Station. Schließen Sie den Schlauch an den 2-Wege-Rotatoren und in die Kulturkammer nach den Anweisungen des Herstellers.
   4. übertragen sorgfältig die cellularized Scaffolds in sterilisierte Käfigen einem sterilen Spatel verwendet wird. Platz 2 Gerüste pro Käfig. Wenn die Käfige bereit sind, legen Sie sie in die Nadeln des Deckels, damit sie nicht während der weiteren Drehung bewegt. Füllen der Kulturkammer mit chondrogenem Medium und schließen, wobei der Deckel die Käfige enthalten.
3. Schalten Sie die peristaltische Pumpe den Schlauch mit chondrogenem Medium zu füllen und Luftblasen zu beseitigen.
4. Und sichern die gefüllte Kammer in den Motor des Bioreaktors und schalten auf dem Computer, der die Drehungen steuert sowohl des Armes und der Kammer.
5. Anwenden einer Rotationsgeschwindigkeit von 5 Umdrehungen pro Minute (rpm), die beide auf dem Arm und der Kammer. Stellen Sie die peristaltische Pumpe bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute für die kontinuierliche Zuführung der cellularized Gerüste.

5. RNA-Extraktion und Genexpressionsanalyse

HINWEIS: Vor der RNA-Extraktion, verdaut die Gerüste mit einer enzymatischen Lösung.

1. Herstellung von 1 ml Enzymlösung durch Zugabe von 100 & mgr; l von Pullulanase (40 U / ml) und 50 ul Dextranase (60 mg / ml) zu 850 ml serumfreiem DMEM Medium.
2. Spülen Sie die Gerüste zweimal mit serumfreiem DMEM-Medium, entsorgen Sie das Medium, und fügen Sie 800 ul der Enzymlösung pro Gerüst. Inkubieren für 15-30 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
3. Wenn das Gerüst vollständig gelöst ist, werden die Lösung um die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 300 × g für 10 min enthält, sorgfältig das Medium absaugen, spült zweimal mit steriler 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Zentrifuge bei 300 × g für 10 min und erneut suspendieren die Zellen in der RNA-Isolierungslösung.
4. Um die RNA aus den Aggregaten zu extrahieren, legen Sie die Sphäroiden in der RNA-Isolationslösung undvollständig zerquetscht sie mit einem Homogenisator RNA-Extraktion vor der Durchführung.
5. Isolieren Sie die RNA ein Kit zur Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers.
6. Synthetisieren komplementärer DNA von 400 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 250 ng-Zufallsprimer, 1 & mgr; l dNTP-Mix (jeweils 10 mM) und 40 U / ml RNase-Inhibitor; Das Endvolumen der Reaktion beträgt 20 & mgr; L. Am Ende der Reaktion, fügen 80 ul destilliertes Wasser, um ein Endvolumen von 100 & mgr; l zu erhalten.
7. Für eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mit einem PCR-Gemisch ein fluoreszierendes Reagens enthält, um die relative Expression der Gene von Interesse, wie Aggrecan (AGC) und Kollagen II (Col II) quantitativ zu bestimmen, das mit 10 × verdünnt cDNA. Normalisieren des Niveaus der Genexpression mit dem Referenz-Genen ribosomale Protein, Groß, P0 (RPLP0). Führen Sie die Berechnungen mit der 2 ^{- ΔΔCT} FormelGegebenen ΔΔCT = ACT von differenzierten Zustand - bedeuten ACT der Kontrollbedingung, und jeder ACT stellt die CT des Gens von Interesse - die CT des Referenzgens (RPLP0).
8. Bestimmen, statistische Messungen als Mittelwert, die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) ±. Führen Sie die Analyse mit n ≥ 2 unabhängigen Experimenten. Verwenden Sie T-Test die statistischen Unterschiede zwischen zentrifugierten Pellets und magnetischen Fusionen (* p <0,05) zu analysieren. Bestimmen Sie die Bedeutung mit Kruskal-Wallis-Test (one-way ANOVA nichtparametrischer) statistisch signifikante Unterschiede zwischen differenzierten Gerüsten und mit dem Steuer Gerüst (* p <0,05) zu analysieren.

6. Die histologische Analyse

1. Spülen Sie die cellularized Gerüste oder Aggregate mit sterilem 1 × PBS, fixieren sie in 10% Formalin-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur und spült mit 1 × PBS.
2. Entfernen Sie die PBS, bettet die Proben in optimaler cutting Temperatur Verbindung (OCT), und sie in einem Bad Isopentan in flüssigen Stickstoff getaucht einzufrieren. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostat-8 & mgr; m Kryoschnitte für die Aggregate oder 12 & mgr; m für die cellularized Gerüste zu erhalten.
3. Verfärbung die Kryoschnitte mit 0,5% Toluidinblau-Lösung für 2 min, Spülen in Leitungswasser, Entwässern mit 100% Ethanol, Toluol klären, und montieren die Objektträger mit einem Befestigungsmittel für die Lichtmikroskopie.

Ergebnisse

Erstens können Aggregate gebildet werden , einzeln Mikromagnete unter Verwendung von 2,5 x 10 ⁵ markierten Stammzellen (2A) abzuscheiden. Diese einzelnen Aggregate (~ 0,8 mm groß), kann dann in größeren Strukturen durch sequenzielle, magnetisch induzierte Fusion fusioniert werden. Zum Beispiel am Tag 8 der chondrogenen Reifung wurden Aggregate in Kontakt paarweise angeordnet Dubletts zu bilden; Vierlinge wurden am Tag versammelt 11 von 2 Dubletten vermisch...

Diskussion

Erstens, weil die hier vorgestellten Techniken auf der Internalisierung von magnetischen Nanopartikeln beruhen, ein wichtiges Thema ist das Ergebnis der Nanopartikel, wenn sie innerhalb der Zellen zu lokalisieren. Es ist wahr , dass Eisen - Nanopartikeln potenzielle Toxizität oder beeinträchtigter Differenzierung Kapazität auslösen können je nach ihrer Größe, Beschichtungs- und Belichtungszeit ^{19, 22.} Jedoch haben mehrere Studien keinen Einfluss auf die Z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'