3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Resumo

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

Resumo

Engenharia cartilagem permanece um desafio devido às dificuldades de criação de um implante funcional in vitro semelhante ao tecido nativo. Uma abordagem recentemente explorada para o desenvolvimento de substitutos autólogos envolve a diferenciação de células estaminais em condrócitos. Para iniciar este condrogénese, um grau de compactação das células estaminais é necessário; Assim, foi demonstrada a viabilidade de células magneticamente de condensação, tanto dentro de andaimes espessas e livres de andaime, utilizando as fontes de campo magnico em miniatura como atractores de células. Esta abordagem também magnética foi usada para guiar fusão agregado e para construir livre de andaime, organizada, tridimensional (3D) tecidos vários milímetros de tamanho. Além de ter um tamanho aumentado, o tecido formado pela fusão magnética-driven apresentou um aumento significativo na expressão de colagénio II, e observou-se uma tendência similar para a express de agrecano. Como a cartilagem nativa foi submetido a forças tchapéu influenciado sua estrutura 3D, a maturação dinâmica também foi realizada. Um bio-reactor que fornece estímulos mecânicos foi utilizado para a cultura dos andaimes magneticamente semeadas ao longo de um período de 21 dias. Biorreactor maturação largamente melhorada condrogénese nos andaimes celularizados; a matriz extracelular obtida sob estas condições era rico em colagénio II e agrecan. Este trabalho descreve o potencial inovador de condensação magnética de células estaminais marcados e maturação dinâmico num biorreactor para uma melhor diferenciação condrogénica, ambas isentas de andaime e dentro de suportes de polissacáridos.

Introdução

nanopartículas magnéticas já são utilizados na clínica como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI), e suas aplicações terapêuticas continuar expandindo. Por exemplo, recentemente, tem sido mostrado que as células marcadas podem ser manipuladas in vivo, utilizando um campo magnético externo e podem ser dirigidas e / ou mantido a um sítio definido de implante ^{1, 2, 3.} Na medicina regenerativa, eles podem ser utilizados para manipular tecidos organizados in vitro ^4, incluindo tecido vascular ^{5, 6, 7, 8,} osso, cartilagem e ^9.

A cartilagem articular é imersa num ambiente avascular, fazer reparações dos componentes da matriz extracelular muito limitada quando ocorrerem danos. Por esta razão, research está atualmente focada na engenharia de substituições de cartilagem hialina que podem ser implantados no local do defeito. A fim de produzir um substituto autólogo, alguns grupos de pesquisa estão explorando o uso de condrócitos autólogos como fonte de células ^{10, 11,} enquanto outros enfatizam a capacidade das células-tronco mesenquimais (MSC) para se diferenciar em condrócitos ^{12, 13.} Em estudos anteriores retomados aqui, foram selecionados MSC, como sua amostragem de medula óssea é bastante simples e não requer o sacrifício de condrócitos saudáveis, que correm o risco de perder o seu fenótipo ^14.

Um passo inicial essencial para iniciar a diferenciao condrogica de células estaminais é a sua condensação. Agregados celulares são normalmente formados usando centrifugação ou cultura de micromassa ^15; no entanto, estes métodos de condensação neither apresentam o potencial de criar agrupamentos de células dentro de andaimes espessas nem o potencial para controlar a fusão de agregados. Neste artigo, descrevemos uma abordagem inovadora para condensar as células-tronco usando rotulagem magnético MSC e atração magnética. Esta técnica tem sido provada para formar construções de 3D livre de andaime através da fusão de agregados um com o outro para se obter um tecido cartilaginoso-escala milimétrica ^9. semeadura magnético de andaimes de espessura e grandes também permitiu a possibilidade de aumentar o tamanho da engenharia de tecidos, desenhando uma forma mais facilmente útil para a implantação, e diversificar o potencial para aplicações clínicas de reparação da cartilagem. Aqui, nós detalhe do protocolo para a semeadura magnético de MSC em matrizes porosas compostas de polissacáridos naturais, pululano e dextrano, andaimes anteriormente utilizado para confinar células estaminais ^{16, 17.} diferenciao condrogica foi finally realizada num biorreactor para garantir contínua de nutrientes e de difusão de gás para o núcleo da matriz dos andaimes semeados com uma alta densidade de células. Além de fornecer nutrientes, factores de crescimento condrogénicas, e gás às células, o biorreactor oferecido estimulação mecânica. Em geral, a tecnologia magnético utilizado para confinar células estaminais, combinada com a maturação dinâmico num biorreactor, podem melhorar acentuadamente a diferenciação condrogénica.

Protocolo

1. Construção dos dispositivos magnéticos

NOTA: Os dispositivos usados para a sementeira de células variam dependendo da aplicação (Figura 1). Para formar agregados, o número de células é limitado a 2,5 x 10 ⁵ / agregado, de modo que as pontas magnéticos devem ser muito fina (750 um de diâmetro). Para semear as andaimes 1,8 centímetros ^2/7 mm de espessura, os ímans devem ser maiores (3 mm de diâmetro) e vai garantir a migração de células através dos poros do andaime.

1. Construção de um dispositivo com micro-imans para a formao de agregados (Figura 1A)
   1. Fazer micro-furos com uma broca de 0,8 mm através de placas de alumínio (3 cm de diâmetro e 6 mm de espessura).
   2. Inserir uma ponta magnética (750 um de diâmetro) em cada orifício da placa.
   3. Coloque este disco durante um ímã de neodímio permanente, o que garante a magnetização de saturação.
2. Construção de um dispositivo para a semeadura andaime ( Figura 1B)
   1. Cortar poliestireno disco em 2,4 cm ² quadrados.
   2. Inserir pequenos ímans 9 (3 mm de diâmetro, 6 mm long) a uma distância igual ao longo de uma área de superfície de 1,6 ^_cm2.
   3. Coloque este dispositivo sobre um ímã de neodímio permanente.

2. Stem Rotulagem celular

NOTA: As células estaminais foram marcadas com 0,1 mM de nanopartículas magnéticas durante 30 min (de ferro 2,6 ± 0,2 pg / célula) para formar agregados, enquanto que foram marcadas com 0,2 mM nanopartículas magnéticas durante 30 min (5 ± 0,4 pg de ferro / célula) para semear andaimes. Estas concentrações de nanopartículas e tempos de incubação foram usadas anteriormente e publicado por MSC e outras células ^{18, 19,} e determinou-se que as nanopartículas impactado nem a viabilidade celular, nem capacidade de diferenciação MSC. A massa de ferro incorporado pelas células estaminais foi medida através de um único cell magnetoforese ^{19, 20.}

1. Culturas de células humanas estaminais mesenquimais (MSC) em meio de crescimento de células estaminais mesenquimais completo (MSCGM) a 37 ° C e 5% de CO ₂ até próximo da confluência (~ 90%).
2. Preparar a solução de marcação magnética, misturando mM maghemite óxido de ferro revestido de citrato de 0,1 ou 0,2 (γFe ₂ O _3; núcleo: 8 nm de diâmetro) em meio 5A de McCoy isento de soro modificado no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sem glutamina e contendo cinco citrato de sódio mM.
3. Descartar o meio, lavar as células com meio RPMI isento de soro, sem glutamina, e adicionar 10 ml de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm ^2, o volume mínimo necessário para cobrir todas as células.
4. Incubar durante 30 min a 37 ° C e _CO2 a 5% e, em seguida, descartar a solução de nanopartículas. Lavar durante 5 minutos com meio RPMI isento de soro, sem glutamina para internalizar o nanoparticles ainda ligada à membrana plasmática.
5. Descartar o meio RPMI e adicionar 25 mL de meio completo MSCGM por frasco. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO _2.

3. semeadura de células Magnetic

1. Recentemente preparar a forma condrogénica através de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) alto teor de glucose com L-glutamina por adição de 50 uM de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1? M de dexametasona, piruvato de sódio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, 1% de cultura universal suplemento contendo insulina, transferrina humana e ácido selenoso (ITS-Pré-mistura), e 10 ng / mL de factor de crescimento transformante-beta 3 (TGF-β3).
2. Separe as células magnéticas utilizando 8 mL de 0,05% de tripsina-EDTA por frasco de cultura de 150 cm ² e centrifuga-se as células dissociadas a 260 × g durante 5 min. Aspirar o meio e contar as células ressuspensas.
3. Coloque uma cultura de células com fundo de vidro de Petri (35 mm) na parte superior de ambos os dispositivos magnéticos.
4. para magnetically formar agregados, adicionar 3 ml de meio de condrogénica para a placa de Petri e suavemente depositar o menor volume possível (não mais do que 8 mL) contendo 2,5 x 10 ⁵ culas marcadas por agregado (até 16 agregados pode ser depositado). Deixar a placa de Petri durante 20-30 minutos sem movê-lo, permitindo-lhe formar esferóides, e, em seguida, colocar o dispositivo completo, incluindo a placa de Petri contendo os 16 agregados, na incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.
5. agregados de controlo de forma a seguir o mesmo protocolo e substituir o meio completo com meio condrogénica sem TGF-β3.
   1. Para gerar a construção de agregado 3D, colocar em contacto os agregados 2 no dia 8 de modo a formar 8 dupletos e iniciar a fusão. No dia 11, mesclar 2 dobletes para formar 4 quadrigêmeos. Finalmente, fundir as 4 quádruplos no dia 15 para se obter a estrutura final.
   2. Ao mesmo tempo, formar agregados por centrifugação de 2,5 x 10 ⁵ marcado com células estaminais a 26015; g durante 5 min em 15 ml de tubos com 1,5 mL de meio de condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra e de controlo, respectivamente).
6. Para magneticamente andaimes de sementes, colocar cada andaime seco em uma placa de Petri. Use de polissacáridos matrizes porosas feitas de pululano / dextrano ^21. Para cada andaime, dilui-se 2 x 10 ⁶ culas estaminais marcadas em 350 uL de meio de condrogénica sem TGF-β3 e cuidadosamente pipetar as células sobre o andaime.
   1. Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir a penetração de células total dentro do andaime e, em seguida, cuidadosamente adicionar 3 mL de meio condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra ou de controlo, respectivamente) para a placa de Petri.
   2. Incubar o andaime celularizado no seu dispositivo magnético a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 4 dias para permitir a migração de células através dos poros de andaime e confinamento.
7. Ao mesmo tempo, semear andaimes com 2 x 10 ⁶ células estaminais marcados seguindo o mesmo método e incubar sem o íman para obter andaimes semeados uniformemente como controlos positivos.

4. Diferenciação em condrócitos

NOTA: Após 4 dias de incubação, remove os ímans e continuar a maturação condrogénica, quer numa placa de Petri (condições estáticas) ou num biorreactor (condições dinâmicas). amostras de controlo negativo são envelhecidos em condições estáticas com meio condrogénica sem TGF-β3.

1. Em condições estáticas, manter os andaimes celularizados ou agregados na mesma placa de Petri. Mudar o meio condrogênica duas vezes por semana durante 21 dias.
2. Em condições dinâmicas, preparar o biorreator.
   1. Cortar tubagem de silicone com o comprimento adequado de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Autoclave todos os materiais: da câmara de 500 mL de cultura, de tubos, de rotadores de 2 vias, e gaiolas.
   3. Colocar as peças de biorreactor em um MicroBio estérilestação de segurança lógica. Ligar a tubagem para as duas vias rotadores e para a câmara de cultura de acordo com as instruções do fabricante.
   4. transferir cuidadosamente os andaimes celularizados em gaiolas esterilizados utilizando uma espátula esterilizada. Coloque 2 andaimes por gaiola. Quando as gaiolas estão prontos, inseri-los nas agulhas da tampa para mantê-los de se mover durante a rotação adicional. Encher a câmara de cultura com meio condrogénica e fechá-lo com a tampa contendo as gaiolas.
3. Ligar a bomba peristáltica para encher o tubo com o meio condrogénica e para eliminar as bolhas de ar.
4. Coloque e prenda a câmara cheia no motor do biorreator e ligar o computador, que controla as rotações tanto do braço e da câmara.
5. Aplicar uma velocidade de rotação de 5 rotações por minuto (rpm) em ambos o braço e a câmara. Ajustar a bomba peristáltica a um caudal de 10 rpm para uma alimentação contínua dos andaimes celularizados.

5. Extração de RNA e Análise de Expressão Gênica

NOTA: Antes da extracção de RNA, digerir os andaimes com uma solução enzimática.

1. Prepare 1 ml de solução enzimática pela adição de 100 uL de pululanase (40 U / mL) e 50 uL de dextranase (60 mg / mL) a 850 mL de meio DMEM isento de soro.
2. Lavar os andaimes duas vezes com meio DMEM isento de soro, descartar o meio e adicionar 800 uL da solução enzimática por andaime. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C sob agitação suave.
3. Quando o andaime esteja completamente dissolvido, transferir a solução contendo as células para um tubo de 1,5 mL, centrifugar a 300 x g durante 10 min, aspirar cuidadosamente o meio, lavar duas vezes com estéril 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, e re-suspender as células na solução de isolamento de ARN.
4. Para extrair o ARN a partir de agregados, colocar os esferóides na solução de isolamento de ARN ecompletamente esmagar-los utilizando um homogeneizador antes de realizar a extraco de ARN.
5. Isola-se o ARN utilizando um kit de extracção de ARN total de acordo com as instruções do fabricante.
6. Sintetizar ADN complementar a partir de 400 ng de ARN total utilizando a transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 250 ng de iniciadores aleatórios, 1 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), e 40 U / ml de RNase inibidor; o volume final da reacção é de 20 pL. No final da reacção, adicionar 80 mL de água destilada para obter um volume final de 100 uL.
7. Para quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizar uma mistura de PCR contendo um reagente fluorescente para quantificar a expressão relativa de genes de interesse, tais como agrecano (AGC) e colagénio II (Col II), com 10 × de cDNA diluído. Normalizar os níveis de expressão do gene com a proteína ribossómica do gene de referência, Grande, P0 (RPLP0). Executar os cálculos com o 2 ^- fórmula ^ΔΔCT, Onde ΔΔCT =? Ct de condição diferenciada - significa? Ct de condição de controlo, e cada um de? Ct representa a CT do gene de interesse - a CT do gene de referência (RPLP0).
8. Determinar medidas estatísticas como os valores médios ± o erro padrão da média (SEM). Realizar a análise com n ≥ 2 experimentos independentes. Utilização do teste t de Student para analisar as diferenças estatísticas entre os peletes centrifugadas e fuss magnéticos (* p <0,05). Determinar o significado com um teste de Kruskal-Wallis (ANOVA de uma via não paramétrico) para analisar as diferenças estatísticas entre os suportes diferenciados e com o andaime de controlo (* p <0,05).

6. Análise histológica

1. Lavar os andaimes celularizados ou agregados com estéril 1 x PBS, corrigi-los em solução de formalina a 10% durante 1 h à temperatura ambiente, e lavar com 1 x PBS.
2. Remover o PBS, incorporar as amostras em cuttin óptimag composto de temperatura (OCT), e congelá-los num banho de isopentano imerso em azoto líquido. Armazenar a amostra a -20 ° C. Corte as amostras com um criostato para obter criocortes 8-M para os agregados ou de 12 mm para os andaimes celularizados.
3. Manchar os criocortes com solução de azul de toluidina a 0,5% durante 2 minutos, enxaguar com água da torneira, desidratar com 100% de etanol, clarificar usando tolueno, e montar as lâminas com um meio de montagem para a microscopia de luz.

Resultados

Em primeiro lugar, os agregados podem ser formados individualmente usando micro-imans através do depósito de 2,5 x 10 ⁵ culas estaminais marcados (Figura 2A). Estes agregados individuais (~ 0,8 mm de tamanho) pode, então, ser fundidos em estruturas maiores, graças à fusão sequencial, induzida magneticamente. Por exemplo, no dia oito de maturação condrogénica, os agregados foram colocados em contacto aos pares para formar dupletos; quádruplos foram mo...

Discussão

Primeiro, porque as técnicas aqui apresentadas dependem da internalização de nanopartículas magnéticas, uma questão importante é o resultado das nanopartículas, uma vez que localizar dentro das células. É verdade que as nanopartículas de ferro pode provocar potencial toxicidade ou a capacidade de diferenciação prejudicada dependendo do seu tamanho, de revestimento, e tempo de exposição ^{de 19, 22.} No entanto, vários estudos têm demonstrado nenhum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'