Mikrofluidik-Plattform mit Multiplexed elektronische Sensoren für Raumverfolgung von Partikeln

Zusammenfassung

Wir zeigen, eine mikrofluidische Plattform mit einem Elektrodennetz integriert Oberfläche, die resistive Pulserfassungs kombiniert (RPS) mit Codemultiplex-Vielfachzugriff (CDMA), Auffinden und Ausmessen von Partikeln in mehrere mikrofluidische Kanäle zu multiplexen.

Zusammenfassung

Mikrofluidik-Verarbeitung von biologischen Proben umfasst in der Regel Differential Manipulationen von Schwebeteilchen unter verschiedenen Kraftfelder, um die Probe zu räumlich fraktionieren basierend auf einer biologischen Eigenschaft von Interesse. Für die sich ergebende räumliche Verteilung als Assay Auslesung verwendet werden, sind mikrofluidische Vorrichtungen oft mikroskopische Analyse unterzogen erfordern komplexe Instrumentierung mit höheren Kosten und reduziert Portabilität. Um diese Beschränkung zu begegnen, haben wir eine integrierte elektronische Sensortechnologie für gemultiplexte Detektion von Partikeln an unterschiedlichen Stellen auf einem mikrofluidischen Chip entwickelt. Unsere Technologie, Mikrofluidik-CODES genannt, kombiniert Resistive Pulse Sensing mit Code Division Multiple Access 2D räumliche Informationen in ein 1D elektrisches Signal zu komprimieren. In diesem Beitrag stellen wir eine praktische Demonstration der Mikrofluidik-CODES Technologie mehrere mikrofluidischen Kanälen zu erkennen und kultivierten Krebszellen Größe verteilt. Wiedurch die High-Speed-Mikroskopie validiert, kann unsere Technologie genau analysieren dichte Zellpopulationen alle elektronisch, ohne die Notwendigkeit für ein externes Gerät. Als solche können die Mikrofluidik-CODES potenziell Low-Cost-integrierten Lab-on-a-Chip-Geräte ermöglichen, die für den Point-of-Care-Tests von biologischen Proben geeignet sind.

Einleitung

Exakte Erfassung und Analyse von biologischen Partikeln wie Zellen, Bakterien oder in Flüssigkeit ist von großem Interesse ausgesetzt Viren für eine Reihe von Anwendungen , ^{1, 2, 3.} Gut aufeinander abgestimmt in Größe, bieten mikrofluidischen Vorrichtungen einzigartige Vorteile für diesen Zweck , wie beispielsweise hochempfindliche, sanfte Probenmanipulation und gut kontrollierten Mikro ^{4, 5, 6, 7.} Zusätzlich können Mikrofluidik - Vorrichtungen eine Kombination von Fluiddynamik und Kraftfelder zu verwenden , werden entworfen , um passiv eine heterogene Population von biologischen Teilchen auf der Grundlage verschiedener Eigenschaften ^{8, 9, 10, 11, 12} fraktionieren. In jenen Geräts, kann die resultierende Partikelverteilung als Auslese werden verwendet, aber räumliche Information ist in der Regel nur zugänglich durch Mikroskopie, die praktische Brauchbarkeit der mikrofluidischen Vorrichtung zu begrenzen, indem sie an ein Labor-Infrastruktur zu binden. Daher ist ein integrierter Sensor, der leicht berichten Raum-Zeit-Mapping "Teilchen können, da sie auf einer mikrofluidischen Vorrichtung manipuliert werden, kann möglicherweise ermöglichen eine kostengünstige, integrierte lab-on-a-Chip-Vorrichtungen, die besonders für die Untersuchung von Proben in mobil , mit beschränkten Ressourcen.

Dünnfilmelektroden wurden als integrierte Sensoren in mikrofluidischen Vorrichtungen für verschiedene Anwendungen ^{13, 14} verwendet. Resistive Pulse Sensing (RPS) ist besonders attraktiv für integrierte Sensor kleiner Teilchen in mikrofluidischen Kanälen , da sie eine robuste, sensitive bietet und Hochdurchsatz - Detektionsmechanismus direkt aus elektrischen Messungen ¹⁵. In RPS wird die Impedanzmodulation zwischen einem Paar von Elektroden in einem Elektrolyt eingetaucht ist, als Mittel verwendet, um ein Teilchen zu detektieren. Wenn die Teilchen durch eine Öffnung verläuft, in der Größenordnung der Partikel bemessen werden die Anzahl und die Amplitude der Transienten-Impulse in dem elektrischen Strom zu zählen und großen Partikeln verwendet, respectively. Darüber hinaus kann die Sensorgeometrie mit einem photolithographischen Auflösung ausgelegt sein resistive Pulswellenformen zu formen , um ¹⁶ - Empfindlichkeit zu ^{verbessern, 17, 18, 19} oder vertikale Position der Teilchen in mikrofluidischen Kanälen ²⁰ zu schätzen.

Wir haben vor kurzem eine skalierbare und einfache Multiplex - resistive Pulsmesstechnologie Mikrofluidik Coded Orthogonal Nachweis durch elektrische Sensing (Mikrofluidik - CODES) ²¹ bezeichnet. Mikrofluidik-CODES beruht auf einermiteinander verbundenes Netzwerk von resistiven Pulssensoren, die jeweils aus einer Anordnung von Elektroden mikromaschinell Leitung in einer einzigartigen, unterscheidbaren Weise zu modulieren, um Multiplexen zu ermöglichen. Wir haben speziell jeden Sensor zu erzeugen orthogonale elektrische Signale ähnlich den digitalen Codes , die in Codemultiplex - Vielfachzugriff ²² (CDMA) Telekommunikationsnetze entwickelt, so dass die einzelnen Widerstandspulssensorsignal eindeutig von einer einzelnen Ausgangswellenform gewonnen werden kann, auch wenn Signale von verschiedene Sensoren stören. Auf diese Weise komprimiert unsere Technologie 2D räumliche Informationen von Partikeln in einem 1D elektrisches Signal und ermöglicht die Überwachung von Partikeln an unterschiedlichen Stellen auf einem Mikrofluidik-Chip, während sowohl geräte- und System-Level-Komplexität auf ein Minimum zu halten.

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für experimentelle und theoretische Methoden erforderlich, die Mikrofluidik-CODES-Technologie, sowie repräsentativer ergibt sich aus seiner Verwendung bei der Analyse von simulierten biologischen Proben. Mit Hilfe der Ergebnisse aus einer Prototyp-Gerät mit vier Multiplex-Sensoren als Beispiel die Technik zu erklären, bieten wir Protokolle auf (1) der Mikrofabrikationsprozess mikrofluidischen Geräte mit der Mikrofluidik-CODES Technologie zu schaffen, (2) die Beschreibung des Versuchsaufbaus einschließlich der elektronische, optische und fluidische Hardware, (3) Störsignale von verschiedenen Sensoren, und (4) die Ergebnisse von Erkennung und Analyse von Krebszellen in mikrofluidischen Kanälen der Computer-Algorithmus zum Decodieren. Wir glauben, dass die detaillierte Protokoll hier beschrieben, andere Forscher unsere Technologie für ihre Forschung anwenden können.

Protokoll

1. Aufbau von Coding Elektroden

Hinweis: Abbildung 1a zeigt die 3-D Struktur der mikrostrukturierten Elektroden.

1. Entwerfen Sie einen Satz von vier 7-Bit - Gold - Codes zur Codierung der mikrofluidischen Kanälen ^23.
   1. Konstruieren Sie zwei lineare Rückkopplungs-Schieberegister (LFSR), die jeweils ein primitives Polynom darstellt.
   2. Verwenden Sie die LFSRs ein bevorzugtes Paar von 7-Bit - m -Sequenzen zu erzeugen.
   3. Zyklisch verschieben das bevorzugte Paar m -Sequenzen und fügen Sie sie in mod 2 vier verschiedene Gold - Codes zu erzeugen.
2. Gestalten Sie das Layout der Codierung Elektroden (Abbildung 1b).
   1. Platzieren Sie drei Elektrodenanschlüsse, die die positiven, negativen und Referenzelektroden an drei Ecken.
   2. Route positive und negative Elektrodenbahnen auf gegenüberliegenden Seiten jeder Mikrofluidik-Kanal.
   3. Verlängern positive und negative Elektroden in denmikrofluidische Kanäle als Elektrodenfinger, im Anschluss an die eindeutig zugeordneten Gold - Code (Abbildung 1c).
   4. Platzieren Sie die Referenzelektrode zwischen der positiven und negativen Elektrodenfinger.
   5. Platzieren positive und negative Elektrodenspuren weit von den äußersten Referenzelektrodenfinger, um eine elektrische Leitung außerhalb der kodierenden Region zu minimieren.

2. Mikrofertigung von Oberflächenelektroden

Hinweis: Figur 2b zeigt den Herstellungsprozeß des Oberflächenelektroden.

1. Reinigen einer 4-Zoll Wafer Borsilikatglas in einer Piranha-Lösung (98% Schwefelsäure: 30% Wasserstoffperoxid = 5: 1) bei 120 ° C für 20 min alle organischen Verunreinigungen zu entfernen. Dann legen Sie den Wafer auf einem 200 ° C heißen Platte für 20 min Restwasser zu entfernen.
2. Übertragen, um den Wafer zu einer Schleuder. Dispense 2 mL negativer Photoresist auf den Wafer und Spin, den Wafer mit einer Geschwindigkeit von 3000 Umdrehungen pro Minute für 40 s gleichmäßig beschichtet wird der Wafer mit einer 1,5 um Photoresist-Schicht.
3. Platzieren Sie den Wafer auf einem 150 ° C heißen Platte und backen Sie den gesponnenen Photoresist für 1 min.
4. Setzen Sie das Photoresist 365-nm - UV - Licht (225 mJ / cm ²⁾ durch eine Chrommaske einen Mask Aligner mit.
5. Platzieren Sie den Wafer auf einer 100 ° C heißen Platte und backen Sie den belichteten Photoresist für 1 min.
6. Entwickeln des Photolacks durch den Wafer in einem Photoresist-Entwickler eingetaucht (RD6) für 15 s. deionisiertes (DI) Wasser vorsichtig sprühen und den Wafer zu waschen. Trocknen durch Druck Stickstoff eingeblasen.
7. Platzieren Sie den Wafer mit gemusterten Photoresist in eine E-beam Metallverdampfer und deponieren eine 20 nm dicke Chromfilm, gefolgt von einer 80 nm dicken Goldfilm auf dem Wafer bei einem Basisdruck von 3 × 10 ^-6 Torr mit einer Abscheidungsrate von 1 Å / s.
8. Tauchen Sie die metallbeschichtete Wafer in Aceton in einem Ultraschallbad Satz bei einer Frequenz von 40 kHz bei 100% Amplitude für 30 Minuten bei Raum TemperamentAture die darunter liegende Photoresist und füllen Sie das Lift-off-Prozess zu ätzen.
9. Würfeln, den Wafer in kleinere Stücke eine herkömmliche Trennsäge verwendet wird.

3. Die Herstellung der SU-8-Form für Mikrofluidikkanälen

Hinweis: 2a zeigt das Herstellungsverfahren der Form für mikrofluidischen Kanälen.

1. Reinigen Sie und backen Sie ein 4-Zoll Siliziumwafer das gleiche Verfahren in 2.1 beschrieben ist.
2. Übertragen, um den Wafer zu einer Schleuder. Gießen Sie 4 ml Photoresist auf dem Wafer. Mantel der Wafer mit Photolack.
   1. Drehen Sie die Wafer bei 500 Umdrehungen pro Minute für 15 s.
   2. Drehen Sie die Wafer bei 1000 Umdrehungen pro Minute für 15 s.
   3. Drehen Sie die Wafer bei 3.000 Umdrehungen pro Minute für 60 s eine gleichmäßig beschichtet 15 um dicke Photolackschicht zu erhalten.
3. Legen Sie die Waferseite nach oben auf einem Reinraum wischen getränkt in Aceton und entfernen Sie das restliche Photoresist von der Rückseite und Kanten des Wafers.
4. Übertragen Sie die Wafer auf einem heißen plaß für weiche Backen. Zuerst backen den Wafer bei 65 ° C für 1 min. Dann schnell den Wafer auf eine 95 ° C heiße Platte bewegen und für 2 min backen.
5. Belichten den Photoresist mit 365-nm UV - Licht (180 mJ / cm ²⁾ durch eine Chrommaske mit einer Maskenausrichter verwendet.
6. Backen des Wafers nach der Belichtung bei 65 ° C für 1 min und dann bei 95 ° C für 2 min.
7. Tauchen Sie den Wafer in Entwickler und leicht schütteln den Behälter für 3 min. Dann spülen Sie den Wafer mit Isopropanol-Alkohol (IPA) und trocknen Sie es mit Druck Stickstoff eingeblasen. Wenn eine weiß gefärbte Rückstand auf dem Wafer erscheint, tauchen sie in den Entwickler wieder und für längere Zeit trocken und zu entwickeln.
8. Backen Sie den Wafer auf einem 200 ° C heißen Platte für 30 min es vollständig trocknen.
9. Messen der Dicke des strukturierten Photoresist einem Profilometer an verschiedenen Stellen über den Wafer unter Verwendung von Gleichförmigkeit zu gewährleisten.
10. Silanisieren der Form-Wafer durch die Technik der Dampfabscheidung verwendet wird. In 200 ul trichlorosilane in einer Petrischale und in einem Vakuumexsikkator zusammen mit der SU-8-Form-Wafer für 8 h.

4. Montage des Mikrofluidik-CODES Geräte

1. Legen Sie das 4-Zoll-Siliziumwafer mit der Form in einem 150 mm Durchmesser Petrischale, und fixieren Sie sie mit von seinen Rändern Taping.
2. Mischen Sie die Polydimethylsiloxan (PDMS) pre-Polymer und Vernetzer in einem Verhältnis von 10: 1, und gießt 50 g des Gemisches in der Petrischale. Platzieren Sie die Petrischale in einem Vakuumexsikkator entgast die Mischung 1 h und dann aushärten in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 4 h (Figur 2a).
3. Schneiden Sie die gehärtete PDMS-Schicht mit einem Skalpell und schälen die Form-Wafer mit einer Pinzette aus. Die Größe des proof-of-principle Vorrichtung beträgt ungefähr 20 mm × 7 mm. Dann Löcher stanzen mit einem Durchmesser von 1,5 mm durch die PDMS für den Einlass und Auslass des Mikrofluidkanals eine Biopsie Tanze verwendet wird.
4. Reinigen Sie die gemusterte Seite des PDMS Teil von i platzierent auf einer Reinraum Klebeband.
5. Reinigen des Glassubstrats mit Oberflächenelektroden indem sie sie mit Aceton gespült, IPA, deionisiertes Wasser und trockene Druck Stickstoff.
6. Aktivieren Sie die Oberflächen von PDMS und Glassubstrat in Sauerstoffplasma für 30 s mit der mikrobearbeiteten Seite jedes Teil in einem HF-Plasma-Generator bei 100 mW nach oben zeigt.
7. Ausrichten des PDMS mikrofluidischen Kanal mit Oberflächenelektroden auf dem Glassubstrat mit einem optischen Mikroskop und dann bringen die beiden Plasma-aktivierten Oberflächen in physischem Kontakt.
8. Backen Sie das Gerät auf einer 70 ° C heißen Platte für 5 min mit der Glasseite der heißen Platte zugewandt ist.
9. Verbinden Sie die Kontaktflächen der Elektroden mit Drähten durch Löten.

5. Herstellung der simulierten biologischen Probe

1. Kultur Die HeyA8 menschlichen Eierstockkrebszellen in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt und 1% Penicillin-Streptomycin in 5% CO ₂ -Atmosphäre bei 37 ° Cbis sie erreichen 80% Konfluenz.
2. Saugen Sie das Medium aus dem Kulturkolben mit einer Glaspipette. Abgabe- und dann absaugen 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die Zellen zu waschen.
3. Inkubiere Zellen in 2 ml 0,05% (w / v) Trypsin-Lösung für 2 min bei 37 ° C adhärente Zellen zu suspendieren. Dann fügen Sie 4 ml der Kulturmedien um das Trypsin zu neutralisieren.
4. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 100 × g für 5 min, um die Zellen in einem Reagenzglas zu pelletieren. Dann absaugen Überstand vollständig.
5. Wieder die Zellen in 1-2 ml 1x PBS durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten mechanisch dissociate Zellklumpen.
6. Zeichnen Sie eine kleine Menge an Zellsuspension in eine Pipette und zählen die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.
7. Verdünne die Zellsuspension mit PBS eine Probe mit der endgültigen Zellkonzentration von 10 ⁵ bis 10 ⁶ Zellen / ml herzustellen.

6. Ausführen des Mikrofluidik-CODES Geräte

Hinweis: FiAbbildung 3 zeigt den Versuchsaufbau.

1. Legen Sie die Mikrofluidik-CODES Gerät auf der Bühne eines optischen Mikroskops.
2. Anwenden eines 400 kHz-Sinuswelle auf die Referenzelektrode auf dem Chip, eine elektronische Funktionsgenerator verwendet wird.
3. Schließen Sie positive und negative Messelektroden an zwei unabhängige Transimpedanzverstärker von jeder Stromsignale Spannungssignale zu konvertieren.
4. Subtrahiere die positive Erfassungselektrode Spannungssignal von der negativen Erfassungselektrode Spannungssignal einen Differenzspannungsverstärker, um mit einem bipolaren Signal zu erhalten.
5. Verwenden Sie eine High-Speed-Kamera zur optischen Aufzeichnungsbetrieb der Vorrichtung zur Validierung und Charakterisierung Zwecke.
6. Treiben die Zellsuspension durch die mikrofluidische CODES Vorrichtung mit einer konstanten Strömungsrate (50-1000 & mgr; l / h) unter Verwendung einer Spritzenpumpe.
7. Messen der Impedanz-Modulationssignal einen Lock-in-Verstärker verwendet.
   1. Schließen Sie das Referenz-Wechselstromsignal an die referenz Eingang des Lock-in-Verstärker. Verbinden des Differential bipolares Signal an die Lock-in-Verstärker als Eingangssignal.
   2. Erhalten, um den RMS-Amplitude des Differenzsignals von dem Lock-in-Verstärker ausgegeben.
8. Probieren Sie den Lock-in-Verstärker-Ausgangssignal bei 1 MHz Geschwindigkeit in einen Computer durch eine Datenerfassungskarte für die weitere Analyse.

7. Sensorsignalverarbeitung

1. Übertragen aufgezeichnet elektrischen Daten in MATLAB für die Nachbearbeitung und Decodierung.
2. Filtern Sie das aufgezeichnete Signal in der digitalen Domäne ein Butterworth-Filter (MATLAB eingebaute Funktion) unter Verwendung der Hochfrequenzrauschen zu entfernen (> 2,5 kHz).
3. Generieren Sie eine Template-Code-Bibliothek von Sensorsignalen.
   1. Identifizieren Vertreter nicht überlappende Codesignale an jeden Sensor in dem Gerät entspricht, und diese Signalblöcke aus dem Datensatz als separate Wellenformvektoren zu extrahieren.
   2. Normalisieren jedes Template-Code Wellenvektorvon seiner Macht. Verwenden Sie die MATLAB integrierte Funktion (bandpower), um die Signalleistung zu messen.
   3. Verwenden Sie MATLAB-Funktion (Resampling) des Vorlagenbibliothek zu erweitern, indem digital Versionen von normalisierten Codesignale zu schaffen mit einer Dauer unterschiedlichen Variationen in der Zellströmungsgeschwindigkeit über die Elektroden aufzunehmen.
4. Identifizieren Sie die Signalblöcke, die Sensoraktivität entsprechen (Schwelle: SNR> 12 dB) in der gefilterten Wellenform. Wellenform mit SNR unter der Schwelle würde als Rauschen behandelt werden.
5. Dekodieren einzelnen Blöcke des Sensoraktivität in dem aufgezeichneten Signal durch einen iterativen Algorithmus basierend auf der sukzessiven Interferenzunterdrückung, eine Technik , die üblicherweise bei der Mehrbenutzer - CDMA - Kommunikationsnetzwerke ^{24, 25.}
   1. Berechnen Kreuzkorrelation jedes Signalblocks mit allen Vorlagen in der Bibliothek Punktprodukt mit Schiebetüren.
   2. Identifizieren Sie die Vorlage, die larg produziertest Autokorrelationsspitze der dominanten einzelnen Sensorcodesignal zu bestimmen. Notieren Sie sich die Zeit und Amplitude der Autokorrelationsspitze.
   3. Konstruieren Sie einen Schätzwert Sensor Codesignal durch den identifizierten Codevorlage auf der gemessenen Autokorrelationsspitzenamplitude anhand der Skalierung und Timing-Informationen (bestimmt in Schritt 7.5.2).
   4. Subtrahieren der geschätzten Sensorcodesignal von der Originaldaten.
   5. Iteriert den Prozess von 7.5.1, bis das Restsignal, wobei weniger als 0,5 mathematisch als Korrelationskoeffizient definiert ist kein Signal in der Schablonenbibliothek ähneln.
6. Verfeinern anfänglichen Sensorsignal Schätzungen aus Schritt 7.5 ein Optimierungsprozess.
   1. Rekonstruieren Sie das Signal, das durch Zugabe von geschätzten einzelnen Sensorsignale von jeder Iteration.
   2. Schwenken Sie die Amplitude, Dauer und Zeitpunkt der einzelnen Sensorsignale um den ursprünglichen Schätzungen die beste Lösung mit dem aufgezeichneten elektrischen Signal zu erzeugenbasierend auf der kleinsten Quadrate Näherung ^26.
7. Wandeln Amplituden der geschätzten Sensorsignale in Zellgröße durch elektrische Signale gegen optische Bilder zu kalibrieren.

Ergebnisse

Ein Mikrofluidik - CODES Gerät von vier Sensoren aus vier mikrofluidischen Kanälen verteilt ist in Abbildung 1b gezeigt. In diesem System wurde der Querschnitt jeder Mikrofluidik-Kanal an die Größe einer Zelle nahe zu sein so gestaltet, dass (1) mehrere Zellen, die nicht über den Elektroden in parallel und (2) Zellen bleiben nahe den Elektroden Erhöhung der Empfindlichkeit passieren . Jeder Sensor ist eine einzigartige 7-Bit-Digitalcode zu erzeugen. Die Vorrichtung...

Diskussion

Mehrere resistive Pulssensoren sind zuvor in Mikrofluidik - Chips ^{28, 29, 30, 31, 32} aufgenommen. In diesen Systemen wurden resistive Pulssensoren entweder nicht ^{28 gemultiplext, 29, 30, 31} oder sie benötigt einzelnen Sensoren bei ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
98% Sulfuric Acid	BDH Chemicals	BDH3074-3.8LP
30% Hydrogen Peroxide	BDH Chemicals	BDH7690-3
Trichlorosilane	Aldrich Chemistry	235725-100G
NR9-1500PY Negative Photoresist	Furuttex
Resist Developer RD6	Furuttex
Acetone	BDH Chemicals	BDH1101-4LP
SU-8 2015 Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU-8 Developer	Microchem	Y010200
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
Isopropyl Alcohol	BDH Chemicals	BDH1133-4LP
RPMI 1640	Corning Cellgro	10-040-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050
Penicillin-Streptomycin	Amresco	K952-100ML
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning Cellgro	21-040-CM
PHD 22/2000 Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-2001
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instrument
HF2TA Current Amplifier	Zurich Instrument
Eclipse Ti-U Microscope	Nikon Corporation
DS-Fi2 High-Definition Color Camera	Nikon Corporation
v7.3 High-speed Camera	Phantom
PCIe-6361 Data Acquisition Board	National Instruments	781050-01
BNC-2120 Shielded Connector Block	National Instruments	777960-01
PX-250 Plasma Treatment System	Nordson MARCH