Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Riepilogo

Abbiamo dimostrato una piattaforma microfluidica con una rete elettrodo superficie integrato che combina rilevamento di impulsi resistivo (RPS) con code division multiple access (CDMA), per multiplare rilevazione e dimensionamento delle particelle a più canali microfluidici.

Abstract

l'elaborazione microfluidica di campioni biologici in genere comporta manipolazioni differenziali di particelle in sospensione sotto vari campi di forza in modo da frazionare spazialmente il campione sulla base di una proprietà biologica di interesse. Per la distribuzione spaziale risultante da utilizzare come la lettura dosaggio, dispositivi microfluidici sono spesso sottoposti ad analisi microscopica richiede strumentazione complesso con più alto costo e ridotta portabilità. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una tecnologia integrata di rilevamento elettronico per il rilevamento di particelle multiplex in diverse posizioni su un chip microfluidica. La nostra tecnologia, chiamata CODICI microfluidici, combina resistivo impulsi Sensing con Code Division Multiple Access per comprimere 2D informazioni spaziali in un segnale elettrico 1D. In questo articolo, vi presentiamo una dimostrazione pratica della tecnologia CODICI Microfluidic per rilevare e dimensioni cellule tumorali in coltura distribuito su più canali microfluidica. Comeconvalidato dal microscopia ad alta velocità, la nostra tecnologia può analizzare accuratamente popolazioni di cellule dense tutto elettronicamente senza bisogno di uno strumento esterno. Come tale, i codici microfluidici possono potenzialmente consentire dispositivi a basso costo integrati lab-on-a-chip che ben si adattano per il test point-of-care di campioni biologici.

Introduzione

La rilevazione accurata e l'analisi di particelle biologiche, come cellule, batteri o virus in sospensione nel liquido è di grande interesse per una gamma di applicazioni ^{1, 2, 3.} Ben abbinato dimensioni, dispositivi microfluidici offrono vantaggi unici per questo scopo come alta sensibilità, la manipolazione dei campioni dolce e microambiente ben controllata ^{4, 5, 6, 7.} Inoltre, dispositivi microfluidici possono essere progettati per impiegare una combinazione di fluidodinamica e campi di forza di frazionare passivamente una popolazione eterogenea di particelle biologiche basate su varie proprietà ^{8, 9, 10, 11, 12.} In quelle dispositivos, la distribuzione delle particelle risultante può essere usato come lettura, ma le informazioni spaziali è tipicamente accessibile esclusivamente tramite microscopia, limitando l'utilità pratica del dispositivo microfluidico legandola ad una infrastruttura di laboratorio. Pertanto, un sensore integrato che può facilmente segnalare mappatura spaziotemporale particelle ', come vengono manipolati in un dispositivo microfluidico, può potenzialmente consentire a basso costo, dispositivi integrati lab-on-a-chip che sono particolarmente interessanti per l'analisi di campioni in mobili , risorse limitate.

Elettrodi a film sottile sono stati utilizzati come sensori integrati in dispositivi microfluidici per varie applicazioni ^{13, 14.} Pulse resistivo Sensing (RPS) è particolarmente attraente per il rilevamento integrato di piccole particelle nei canali microfluidica in quanto offre un meccanismo di rilevamento high-throughput robusto, sensibile, e direttamente da misure elettriche ¹⁵. In RPS, la modulazione impedenza tra una coppia di elettrodi, immersi in un elettrolita, viene usato come mezzo per rilevare una particella. Quando la particella passa attraverso un'apertura, di dimensioni dell'ordine di particella, il numero e l'ampiezza degli impulsi transitori della corrente elettrica sono usati per contare e particelle di dimensioni rispettivamente. Inoltre, la geometria del sensore può essere progettato con una risoluzione fotolitografica per modellare le forme d'onda di impulsi resistivi al fine di migliorare la sensibilità ^{16, 17, 18, 19} o per stimare la posizione verticale delle particelle in canali microfluidica ^20.

Abbiamo recentemente introdotto un multiplex resistivo tecnologia di rilevamento degli impulsi semplice e scalabile, chiamato Microfluidic Coded Orthogonal rilevamento rilevando elettrico (CODICI microfluidici) ^21. CODICI microfluidica si basa su unrete interconnessa di sensori resistivi, ciascuno costituito da una matrice di elettrodi microlavorati per modulare conduzione in modo unico, distinguibile, in modo da consentire multiplexing. Abbiamo specificatamente progettato ogni sensore per produrre segnali elettrici ortogonali simili ai codici digitali utilizzati in code division multiple access ²² (CDMA) reti di telecomunicazioni, in modo che il segnale individuale cardiofrequenzimetro resistivo può essere recuperato esclusivamente da una singola forma d'onda di uscita, anche se i segnali da diversi sensori interferiscono. In questo modo, la nostra tecnologia comprime informazioni spaziali 2D di particelle in un segnale elettrico 1D, permettendo il monitoraggio di particelle in diverse posizioni su un chip microfluidico, mantenendo sia complessità dispositivo- ed a livello di sistema al minimo.

In questo articolo, vi presentiamo un protocollo dettagliato per i metodi sperimentali e computazionali necessarie per utilizzare la tecnologia CODICI Microfluidic, così come rrisultati epresentative dal suo uso in analisi di campioni biologici simulati. Utilizzando i risultati di un dispositivo prototipo con quattro sensori multiplex come un esempio per spiegare la tecnica, forniamo protocolli sulla (1) il processo di microfabbricazione per creare dispositivi microfluidici con la tecnologia Microfluidic CODICI, (2) la descrizione del setup sperimentale compresa la elettronica, ottica e fluidico hardware, (3) l'algoritmo di decodifica segnali interferenti provenienti da sensori diversi, e (4) i risultati di rilevazione e l'analisi delle cellule tumorali nei canali microfluidici. Noi crediamo che utilizzando il protocollo dettagliato qui descritto, altri ricercatori possono applicare la nostra tecnologia per le loro ricerche.

Protocollo

1. Progettazione di elettrodi Coding

Nota: La figura 1a mostra la struttura 3-D degli elettrodi micropatterned.

1. Progettare un set di quattro codici Gold 7-bit per codificare i canali microfluidica ^23.
   1. Costruire due retroazione turno registri lineari (LFSRs), ognuno dei quali rappresenta un polinomio primitivo.
   2. Utilizzare i LFSR per generare una coppia di 7-bit m -sequences preferito.
   3. Ciclicamente spostare la coppia di m -sequences preferito e aggiungerli in mod 2 per generare quattro codici d'oro distinti.
2. Progettare la disposizione degli elettrodi codifica (Figura 1b).
   1. Mettere tre terminali degli elettrodi, che rappresenta i, negativi e positivi elettrodi di riferimento a tre angoli.
   2. Percorso elettrodo positivo e negativo tracce su lati opposti di ciascun canale microfluidico.
   3. Estensione elettrodi positivi e negativi nelcanali microfluidica come dita elettrodi, che seguono il codice d'oro assegnato in modo univoco (Figura 1c).
   4. Posizionare l'elettrodo di riferimento tra le dita di elettrodi positivi e negativi.
   5. Posizionare tracce di elettrodi positivi e negativi lontano dalle più esterne dita elettrodo di riferimento al fine di minimizzare conduzione elettrica fuori della regione codificante.

2. Microfabbricazione di elettrodi di superficie

Nota: La figura 2b mostra il processo di fabbricazione di elettrodi di superficie.

1. Pulire un wafer di vetro borosilicato 4 pollici in una soluzione Piranha (acido solforico al 98%: acqua ossigenata al 30% = 5: 1) a 120 ° C per 20 minuti per rimuovere tutti i contaminanti organici. Poi posizionare il wafer su una piastra calda a 200 ° C per 20 minuti per rimuovere l'acqua residua.
2. Trasferire la cialda di un filatore. Pipettare 2 mL fotoresist negativo sul wafer e ruotare il wafer ad una velocità di 3, 000 rpm per 40 s per rivestire uniformemente il wafer con uno strato di resina fotosensibile 1,5 micron.
3. Posizionare il wafer su una piastra calda a 150 ° C e cuocere il fotoresist filato per 1 min.
4. Esporre fotoresist a 365 nm di luce UV (225 mJ / cm ²⁾ attraverso una maschera di cromo mediante un allineatore maschera.
5. Posizionare il wafer su una piastra calda a 100 ° C e cuocere il photoresist esposto per 1 min.
6. Sviluppare il photoresist immergendo il wafer in uno sviluppatore photoresist (RD6) per 15 s. Delicatamente spruzzare acqua deionizzata (DI) e lavare il wafer. Insufflando azoto compresso.
7. Posizionare il wafer con fotoresist modellato in un evaporatore metallico e-beam, e depositare un film di cromo di 20 nm di spessore, seguita da una pellicola di oro 80 nm di spessore sul wafer ad una pressione di base di 3 × 10 ^-6 Torr con con velocità di deposizione 1 a / s.
8. Immergere il wafer metallizzata in acetone in un set bagno ad ultrasuoni ad una frequenza di 40 kHz con 100% di ampiezza per 30 minuti a calma roomtura per incidere il photoresist sottostante e completare il processo di lift-off.
9. Tagliare il wafer in pezzi più piccoli utilizzando una sega a dadi convenzionale.

3. Realizzazione dello stampo SU-8 per canali microfluidica

Nota: la figura 2a mostra il processo di fabbricazione dello stampo per canali microfluidica.

1. Pulire e cuocere un wafer di silicio da 4 pollici utilizzando la stessa procedura descritta in 2.1.
2. Trasferire la cialda di un filatore. Versare 4 mL fotoresist sul wafer. Rivestire la cialda con fotosensibile.
   1. Spin wafer a 500 rpm per 15 s.
   2. Spin wafer a 1.000 rpm per 15 s.
   3. Spin wafer a 3.000 rpm per 60 s per ottenere 15 micron strato di resina fotosensibile spessore uniformemente rivestito.
3. Posizionare il wafer su una camera bianca wipe imbevuto di acetone e rimuovere il fotoresist residuo dal retro e bordi del wafer.
4. Trasferire il wafer su un pl caldomangiato per morbido cottura. In primo luogo, cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min. Quindi spostare rapidamente il wafer ad una piastra calda a 95 ° C e cuocere per 2 min.
5. Esporre fotoresist a 365 nm di luce UV (180 mJ / cm ²⁾ attraverso una maschera di cromo mediante un allineatore maschera.
6. Cuocere il wafer dopo esposizione a 65 ° C per 1 min e poi a 95 ° C per 2 min.
7. Immergere il wafer di sviluppatore e agitare leggermente il contenitore per 3 min. Poi, lavare il wafer con alcool isopropanolo (IPA) ed asciugarlo soffiando azoto compresso. Se appare un residuo di colore bianco sul wafer, immergerlo sviluppatore nuovo e sviluppare per più tempo e secco.
8. Cuocere il wafer su una piastra calda a 200 ° C per 30 minuti per asciugare completamente.
9. Misurare lo spessore del fotoresist modellata utilizzando un profilometro a diversi punti del wafer per assicurare uniformità.
10. Silanizzare wafer stampo utilizzando la tecnica di deposizione a vapore. Aggiungere 200 ml di trichlorosilane in una capsula di Petri e posto in un essiccatore a vuoto insieme con lo stampo wafer SU-8 per 8 h.

4. Montaggio del codici dei dispositivi Microfluidic

1. Posizionare il wafer di silicio da 4 pollici con lo stampo in un diametro Petri da 150 mm, e fissarlo con nastro adesivo ai suoi bordi.
2. Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero e reticolante con un rapporto di 10: 1, e versare 50 g della miscela nella capsula di Petri. Posizionare la piastra di Petri in un essiccatore a vuoto per degasare la miscela per 1 h, quindi curare in stufa a 65 ° C per almeno 4 ore (Figura 2a).
3. Tagliare lo strato PDMS curato con un bisturi e sfilarlo wafer stampo con una pinzetta. Le dimensioni del dispositivo di prova di principio è di circa 20 mm × 7 mm. Poi perforare con un diametro di 1,5 mm attraverso i PDMS per l'ingresso e l'uscita del canale microfluidico usando un perforatore biopsia.
4. Pulire il lato modellato della parte PDMS posizionando it su un nastro adesivo camere bianche.
5. Pulire il substrato di vetro con elettrodi di superficie da risciacquo con acetone, IPA, acqua deionizzata e asciugare con azoto compresso.
6. Attivare le superfici di PDMS e substrato di vetro in plasma di ossigeno per 30 s con il lato microlavorato di ciascuna parte rivolta verso l'alto in un generatore RF plasma fissato a 100 mW.
7. Allineare il canale microfluidico PDMS con elettrodi superficiali sul substrato di vetro usando un microscopio ottico e quindi sulle due superfici plasma attivato in contatto fisico.
8. Cuocere il dispositivo su una piastra calda a 70 ° C per 5 minuti, con il lato di vetro affacciata alla piastra calda.
9. Collegare le piazzole di contatto degli elettrodi con fili per saldatura.

5. Preparazione del campione simulato biologica

1. Culture gli umani cellule di cancro ovarico HeyA8 in RPMI 1640 integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina in 5% di CO ₂ nell'atmosfera a 37 ° Cfino a raggiungere 80% di confluenza.
2. Aspirare il supporto dal pallone di coltura usando una pipetta di vetro. Distribuire e quindi salina aspirare 1x tampone fosfato (PBS) per lavare le cellule.
3. Incubare le cellule in 2 ml 0,05% (w / v) soluzione di tripsina per 2 min a 37 ° C per sospendere le cellule aderenti. Quindi, aggiungere 4 ml di terreni di coltura per neutralizzare la tripsina.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 100 xg per 5 minuti per far sedimentare le cellule in una provetta. Poi, aspirare il surnatante completamente.
5. Risospendere le cellule in 1-2 ml di PBS 1x pipettando gentilmente su e giù per grumi di cellule meccanicamente dissociano.
6. Disegnare una piccola quantità di sospensione cellulare in una pipetta e contare il numero di cellule utilizzando emocitometro.
7. Diluire la sospensione cellulare con PBS per preparare un campione con concentrazione cellulare finale di 10 ⁵ -10 ⁶ cellule / ml.

6. Esecuzione del CODICI Microfluidic dispositivo

Nota: Fifigura 3 mostra il setup sperimentale.

1. Posizionare il dispositivo CODICI Microfluidic sul palcoscenico di un microscopio ottico.
2. Applicare 400 kHz onda sinusoidale all'elettrodo di riferimento sul chip mediante un generatore di funzione elettronica.
3. Collegare elettrodi di rilevamento positivi e negativi a due amplificatori trans-impedenza indipendenti per convertire segnali di corrente da ognuna per segnali di tensione.
4. Sottrarre il segnale di tensione elettrodo di rilevamento positivo dal segnale di tensione elettrodo di rilevamento negativo utilizzando un amplificatore differenziale di tensione in modo da ottenere un segnale bipolare.
5. Utilizzare una macchina fotografica ad alta velocità per un'operazione di registrazione ottica del dispositivo per scopi di convalida e caratterizzazione.
6. Guidare la sospensione cellulare attraverso il dispositivo CODICI microfluidici ad una portata costante (50-1,000 mL / h) mediante una pompa a siringa.
7. Misurare il segnale di modulazione impedenza, che utilizza un amplificatore lock-in.
   1. Collegare il segnale AC riferimento refingresso erence dell'amplificatore lock-in. Collegare il segnale differenziale bipolare all'amplificatore lock-in come segnale di ingresso.
   2. Ottenere l'ampiezza RMS del segnale differenziale dall'uscita dell'amplificatore lock-in.
8. Campionare il segnale di uscita dell'amplificatore lock-in a 1 MHz tasso in un computer attraverso una scheda di acquisizione dati per ulteriori analisi.

7. Il trattamento dei segnali dei sensori

1. Il trasferimento dei dati elettrici registrati in MATLAB per la post-elaborazione e la decodifica.
2. Filtrare il segnale registrato nel dominio digitale utilizzando un filtro Butterworth (funzione incorporata MATLAB) per rimuovere il rumore ad alta frequenza (> 2,5 kHz).
3. Genera una libreria di codice modello da segnali dei sensori.
   1. Identificare segnali rappresentativi di codice non sovrapposizione corrispondenti a ciascun sensore nel dispositivo ed estrarre questi blocchi segnale dal set di dati di forma d'onda come vettori separati.
   2. Normalizzare ogni modello di codice forma d'onda vettoredalla sua potenza. Utilizzare la MATLAB funzione built-in (bandpower) per misurare la potenza del segnale.
   3. Utilizzare la funzione MATLAB (resample) per espandere la libreria di template per la creazione digitale versioni di segnali in codice normalizzati con diverse durate per accogliere variazioni di velocità del flusso delle cellule sopra gli elettrodi.
4. Identificare i blocchi di segnali corrispondenti al sensore di attività (soglia SNR> 12 dB) nella forma d'onda filtrata. Waveform con SNR sotto della soglia sarà trattato come rumore.
5. Decodifica singoli blocchi di attività del sensore nel segnale registrato utilizzando un algoritmo iterativo basato sulla cancellazione di interferenza successiva, una tecnica comunemente impiegata in reti di comunicazione CDMA multi-utenza ^{24, 25.}
   1. Calcolare correlazione incrociata di ciascun blocco di segnale con tutti i modelli nella libreria utilizzando scorrevole prodotto scalare.
   2. Identificare il modello che produce il largest autocorrelazione di picco per determinare il segnale dominante individuale codice sonda. Registrare il tempo e l'ampiezza del picco di autocorrelazione.
   3. Costruire un segnale di codice sensore stima scalando il modello di codice identificato in base alla misura di autocorrelazione picco di ampiezza e informazioni di temporizzazione (determinata al punto 7.5.2).
   4. Sottrarre il segnale stimato codice sensore dai dati originali.
   5. Iterare il processo dalla 7.5.1, finché il segnale residuo non assomiglia ad alcun segnale nella libreria modelli, matematicamente definito come il coefficiente di correlazione essendo inferiore a 0,5.
6. Affina stime del segnale del sensore iniziali dal punto 7.5 utilizzando un processo di ottimizzazione.
   1. Ricostruire il segnale con l'aggiunta di segnali dei sensori singoli stima da ogni iterazione.
   2. Sweep l'ampiezza, durata e frequenza dei singoli segnali dei sensori intorno alle stime iniziali per produrre la migliore forma con il segnale elettrico registratosulla base di minimi quadrati approssimazione ^26.
7. Convertire ampiezze dei segnali dei sensori stimate nella dimensione delle celle calibrando segnali elettrici contro le immagini ottiche.

Risultati

Un dispositivo CODICI microfluidi costituito da quattro sensori distribuiti su quattro canali microfluidica è mostrato in Figura 1b. In questo sistema, la sezione trasversale di ciascun canale microfluidico stato progettato per essere vicino alla dimensione di una cella in modo che (1) più celle non possono passare sopra gli elettrodi in parallelo e (2) cellule rimangono vicino agli elettrodi aumentando la sensibilità . Ogni sensore è progettato per generare un codic...

Discussione

Molteplici sensori resistivi sono stati precedentemente incorporati in chip microfluidici ^{28, 29, 30, 31, 32.} In questi sistemi, sensori resistivi erano o non multiplexati ^{28, 29, 30, 31} o hanno richiesto singoli sensori necessari p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
98% Sulfuric Acid	BDH Chemicals	BDH3074-3.8LP
30% Hydrogen Peroxide	BDH Chemicals	BDH7690-3
Trichlorosilane	Aldrich Chemistry	235725-100G
NR9-1500PY Negative Photoresist	Furuttex
Resist Developer RD6	Furuttex
Acetone	BDH Chemicals	BDH1101-4LP
SU-8 2015 Negative Photoresist	Microchem	SU8-2015
SU-8 Developer	Microchem	Y010200
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
Isopropyl Alcohol	BDH Chemicals	BDH1133-4LP
RPMI 1640	Corning Cellgro	10-040-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-050
Penicillin-Streptomycin	Amresco	K952-100ML
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Corning Cellgro	21-040-CM
PHD 22/2000 Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-2001
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instrument
HF2TA Current Amplifier	Zurich Instrument
Eclipse Ti-U Microscope	Nikon Corporation
DS-Fi2 High-Definition Color Camera	Nikon Corporation
v7.3 High-speed Camera	Phantom
PCIe-6361 Data Acquisition Board	National Instruments	781050-01
BNC-2120 Shielded Connector Block	National Instruments	777960-01
PX-250 Plasma Treatment System	Nordson MARCH