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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Viral-abgeleitete Peptide gekoppelt an Antikörper-Konjugate (ACs) ist ein Ansatz, der Schwung durch das Potenzial der molekularen Nutzlasten mit erhöhten Tumor Zelle Ansammlung zu liefern. Gängige Methoden zur Bewertung Peptid Konjugation, AC und Nutzlast intrazelluläre Akkumulation und Tumor gezielt nutzen, unterstützt dieses Protokoll Forscher während der wichtigen ersten Entwicklungsphasen.

Zusammenfassung

Antikörper-Konjugate (ACs) modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind eine potentiell mächtige Klasse von Tumor Zelle Zusteller für molekulare Nutzlasten verwendet in der Krebsbehandlung und Bildgebung durch erhöhten zellulären Akkumulation über aktuelle ACs. Während des frühen AC in Vitro sind Entwicklung, Fluoreszenztechniken und Radioimmunoassays ausreichend zur Bestimmung intrazelluläre Lokalisation, Anhäufung Effizienz und Ziel Zelle Spezifität. Derzeit gibt es keinen Konsens über standardisierte Verfahren zur Herstellung von Zellen für die Bewertung der AC intrazelluläre Akkumulation und Lokalisierung. Die ersten Tests der ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide ist kritisch, vor allem, wenn mehrere Kandidaten gebaut wurden. Bestimmung von intrazellulären Akkumulation durch Fluoreszenz Hintergrundsignal von ACs an der Zelloberfläche betroffen Sie sein können und erschweren Sie die Interpretation der Akkumulation. Für Radioimmunoassays in der Regel behandelte Zellen fraktioniert und die Radioaktivität in andere Zelle Fächer gemessen. Jedoch Zelle Lysis variiert von Zelle zu Zelle und oft Kern- und zytoplasmatischen Kompartimente sind nicht ausreichend isoliert. Dies kann irreführende Daten über Nutzlast Lieferung Eigenschaften führen. Die intravenöse Injektion des radioaktiven Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs im Tumor mit Mäusen gefolgt von Radionuklid Bildgebung ist eine leistungsfähige Methode für die Bestimmung der Tumoreigenschaften targeting und Nutzlast Lieferung während der in-Vivo -Phase des Entwicklung. Aber dies ist eine relativ neue Zuführung und einige Gruppen haben Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs auf diese Weise ausgewertet. Wir beschreiben die Verarbeitung der behandelten Zellen genauer bewerten Virus abgeleitet Peptid-modifizierte AC Akkumulation bei der konfokalen Mikroskopie und Radioimmunoassays Verwendung. Eine Methode zur trypsinizing Zellen, Zellenoberfläche entfernen gebunden insbesondere ACs. Wir bieten auch eine Methode zur Verbesserung der zellulären Fraktionierung. Dieses Protokoll sieht schließlich eine in-Vivo -Methode mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) für die Bewertung der ersten Tumor gezielt Eigenschaften in Tumor-tragenden Mäusen. Wir verwenden das Radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) als ein Beispiel Nutzlast in diesem Protokoll.

Einleitung

Antikörper-Konjugate (ACs) sind Biopharmazeutika, die in eine transformative Klasse von wirksamen Medikamenten zur Verbesserung der Krebs-Behandlungen sowie zur Erkennung von Tumoren fällig sind. Bestehend aus ein monoklonaler Antikörper (mAb) konjugiert, molekulare Nutzlasten wie Radioisotope, kleine Moleküle und biologische Toxine, ACs sind in der Lage, diese Nutzlasten an Krebszellen mit exquisiten Ziel Antigen Affinität und Spezifität zu liefern. Damit ACs haben das Potenzial, deutlich reduzieren unspezifische Toxizität und Nutzlast Aktivität bei der Tumor-Website zu erhöhen. Therapeutisch, wurden ACs Transport von zytotoxischen kleinen Molekülen (gemeinhin als Antikörper-Wirkstoff-Konjugate) zugelassen für die Behandlung von Patienten mit Brustkrebs und Hodgkin Lymphom, die konventionelle Behandlungen 1, gescheitert 2. ACs Transport von Radioisotopen (allgemein als Radioimmunoconjugates bezeichnet) sind darüber hinaus auch in der Entwicklung. Eine AC Transport von Radioisotopen für die Bildgebung ist zur Identifizierung von Prostatakrebs Metastasen 3zugelassen. Mit vielen mehr therapeutische ACs Zulassung 4beantragt ist Optimismus für die Zukunft des ACs zu Krebs Pflege 5hoch.

Dennoch, bei der Chemotherapeutika oder Radioisotope ACs haben Schwierigkeiten, die effektiv sammeln diese Nutzlasten in Zielzellen. Dieser Aspekt trägt wesentlich in vielen Fällen in der Unfähigkeit des ACs zu lang andauernde krankheitsfreien Überlebens oder kontrastreiche Tumor imaging- 6,7. In der Regel sobald ACs binden ihre Ziel-Antigen sind sie durch einen Prozeß bekannt als Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert. ACs sind dann in Endosomen gefangen und verschleppt, Lysosomen für Abbau und Nutzlast release 8. Die intrazelluläre Menschenhandel Prozess stellt Herausforderungen an ACs eine hohe Nutzlast Spezifität und Wirksamkeit gegen Krebszellen zu erreichen. Zum Beispiel viele Antigene wie Her2 (Ziel für therapeutische AC Trastuzumab-Emtansin) kann bis zu 85 % der gebundenen Antikörper in den ersten 30 min 9recyceln. Darüber hinaus nach Verschlechterung auftritt, können freigegebene Chemotherapeutika und Radioisotopen aktiv durch erhöhte Expression/Aktivität der Membran verbundenen Transport Proteine 10,11oder exportiert werden. Lysosomen Abbau hemmt auch die Lieferung der neuartige biologische Nutzlasten wie therapeutischer Enzyme und Oligonukleotide, die sein können deaktiviert 12,13. Im Wesentlichen ist die Krebszelle sehr effektiv bei der Aufhebung der notwendigen intrazellulären Akkumulation von Nutzlasten von ACs geliefert.

Dieses Protokoll beschreibt die Umsetzung des Konzepts der ACs-gekoppelt an Virus-abgeleitete Peptide, speziell für Endosom Verlockende Falle zu entkommen und Lokalisierung in den Zellkern. Mit solcher Raffinesse, Host Zellsysteme zu manipulieren ist es nicht verwunderlich, dass die Entwicklung des Virus abgeleitet Proteine und Peptide als potenzielle Biopharmazeutika lange tief in therapeutische Forschung 14 verwurzelt hat. Seit Millionen von Jahren haben Viren entwickelt, um eine außergewöhnliche Sammlung von Proteinen in der Lage, normale physiologische Säugerzelle Systeme nutzen, um effektiv Wirtszellen geben erwerben. Für Viren, die über Rezeptor-vermittelte Endozytose internalisiert werden, stehen sie auch vor der Herausforderung mit Flucht vor Menschenhandel zu den Lysosomen wo kann der Ansturm der eine lokalisierte Konzentration von Proteasen problematisch für das Überleben sein. Eine gut charakterisierten virale abgeleitet Peptid genutzt bei der Medikamentenabgabe zu entkommen Endosom Einklemmung ist das Humane Immundefizienz-Virus Transaktivator Transkription (Tat) Protein 15. Tat ist in der Lage, Endosom Einklemmung durch Sensierung niedrigen pH-Wert an welcher Stelle auftreten, Protein-Konformationsänderungen förderliches Tat sich einfügen und stören die Endosomal Membrane 16zu entkommen. Dies führt zu Tat-Nutzlast Konjugate Zytoplasma zugreifen. Das zweite virale Manipulation Element im Zusammenhang mit diesem Protokoll ist der Ansatz verwendet, um therapeutische Gene und Drogen zum Kern 17liefern. Viren haben entwickelt, um Host Cell Maschinen für voran durch die Kernpore Komplex (NPC) auf der Durchreise vorbei die Kernmembran erfolgreich zu manipulieren. Zelluläre Makromoleküle enthalten (oder binden an Proteine, die enthalten) nukleare Lokalisierung Signale (NLSs) notwendig für die Bindung zu nuklearen transportieren Proteine (z. B. Karyopherins α und β), die die erforderlichen Bewegungen durch den NPC zu bieten. Viren haben Proteine um NLS-Sequenzen enthalten, die ihnen die Fähigkeit, Host Zelle Transportproteine für pendelt in der Kern- 18Nutzen bieten entwickelt.

Zahlreiche ACs haben zuvor mit Tat und NLS-abgeleitete Peptide funktionalisiert und getestet für ihre Fähigkeit, Krebszellen zu sammeln und gezielt Tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabelle 1). Studien, die Bereitstellung von zytotoxischen Nutzlasten haben gezeigt, dass ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide sind zellulären Akkumulation, Zytotoxizität und Tumor töten über unveränderte ACs 22,26deutlich erhöhen. Ein gemeinsames Merkmal für diese neuartige Klasse von AC ist konstruktionsbedingt. Peptide enthalten in der Regel ein terminal Cystein bietet eine kostenlose Sulfhydryl-Gruppe. MAbs wird zuerst mit einem Noncleavable bifunktionelle Vernetzer mit N- Hydroxysuccinimide (NHS) und Maleimide Gruppen an den entgegengesetzten Enden reagiert. Die NHS-Ester reagieren mit primären Aminen auf die mAb, Amid-Bindungen zu bilden. Reagierte mAb mit frei Maleimide Gruppen wird dann mit den Sulfhydryl-Gruppen auf die Peptide bilden eine Thioester-Bindung und damit verknüpfen das Peptid und mAb reagiert. Obwohl Homobifunctional Vernetzer verwendet 28gewesen, Heterobifunctional Vernetzer werden häufiger verwendet, in den Bau des Virus abgeleitet Peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Dieses Protokoll verwendet speziell der Vernetzer Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) für seine Benutzerfreundlichkeit und da es in der zugelassenen Antikörper-Wirkstoff-Konjugat Trastuzumab-Emtansin und in vielen verwendet wird Virus-abgeleitete Peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist die primäre Methode zur Bestimmung zunächst Konjugation Effizienz und für semi-Quantifizierung der Anzahl der Peptide pro mAb. Konfokale Mikroskopie mit einer Fluoreszent-markierten Sekundärantikörper spezifisch für die mAb ist in der Regel die Methode zur Bewertung der zunächst intrazelluläre Verteilung Eigenschaften des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs. Radioisotope sind bisher, die primäre Nutzlasten von Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs geliefert. Radioisotope sind vorteilhaft, weil die Radioaktivität in den Zellen leicht durch Gamma zählen quantifiziert ist. Darüber hinaus bieten die ACs, die Maus-Modellen der menschlichen Krebserkrankungen übersetzt werden Forscher mit der Fähigkeit zur Bewertung Tumor gezielt mit molekularen Bildgebungsverfahren wie single Photonenemission Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) berechnet 23 , 32 , 33. die Konstruktion und Validierung Testmethoden, die hauptsächlich von Forschern bietet im Allgemeinen eine sehr gute Bewertung des ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide während der ersten Entwicklungsphase effektiv eingeben und liefern die Nutzlast in Zielzellen und Ziel Tumoren.

Tat - und NLS-modifizierte ACs haben beleuchtete Schlüsselbereichen Nutzlast Lieferung innerhalb Krebszellen und Tumoren weiter zu verbessern. In Bezug auf ACs NLS geändert kann die Effizienz in der intrazellulären Akkumulation bescheidene 23,31,34. Ineffiziente intrazelluläre Ansammlung verursacht durch fortgesetzte Endosomal Einklemmung. Ausrichtung in Vivo Tumor kann auch mit beiden Tat und NLS-modifizierte ACs vermindert werden. Die aktiven Sequenzen von Tat und NLS enthalten mehrere positiv geladene Rückstände. Wenn mAbs angeschlossen, kann die insgesamt kationische Ladung deutlich erhöhte 35sein. Als Folge haben der Tat - und NLS-modifizierte ACs erhöhte Aufnahme in gesundes Gewebe und schnelle Blut Abstand erhöht.

Unsere Gruppe entwickelt eine zusammengesetzte Verbindung bestehend aus Cholsäure verbunden mit NLS (ChAcNLS; ( Abbildung 1). ChAcNLS-modifizierte ACs sind in der Lage zu erhöhen intrazelluläre Akkumulation von gelieferten Radioisotopen und Tumor targeting im Vergleich zu NLS modifiziert und traditionellen ACs 33,34. Der Mechanismus hinter Cholsäure ist inspiriert von der Fähigkeit des ausgewählten nonenveloped Viren, die auf Membranfusion Cholsäure Endosom Flucht durch die Bildung von Ceramid auslösen nutzen nicht verlassen kann. Z. B. Rekruten porcinen enterischen Viren Cholsäure, die Sphingomyelinase, aktiviert die katalysiert die Hydrolyse von Sphingomyelin in Ceramid 36,37,38. Dies destabilisiert Endosomal Membrane und Virus Flucht ermöglicht. Cholsäure ist also ein anderes Virus abgeleitete Komponente, die NLS ergänzt.

Als dieses Feld bewegt sich vorwärts und zukünftige treten Weiterentwicklungen in Nutzlast Lieferung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, es ist ein guter Zeitpunkt, um visuelle Vorführungen ihrer biochemische und funktionelle Eigenschaften während der Anfangsphase der Entwicklung bieten. Hier beschreiben wir unsere Protokoll für die ursprüngliche Bewertung des Virus abgeleitet Peptid-modifizierte ACs für die effiziente und doch einfache Bestimmung der intrazellulären Akkumulation und Tumor gezielt während der frühen Phase der Entwicklung. Wir verwenden die im Handel erhältlichen mAbs 7 3 und A14 als Beispiel Modellsysteme. Verfahren 1 beschreibt die Verwendung von SDS-PAGE als eine Methode, die für "Go/No go" Entscheidungen konstruierten ACs ermöglicht. Verfahren 2 beschreibt eine Methode, mit Trypsinization für verbesserte Visualisierung von AC intrazelluläre Verteilung und Akkumulation. Verfahren 3 beschreibt ein Verfahren zur verbesserten intrazellulären Fraktionierung, nukleare Lokalisation genau zu bestimmen. In diesem Verfahren nutzen wir die Nutzlast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) weil es anfällig für zelluläre Ausfluss ist und ein Positronen-Emitter- 10 ist. So beschreibt Verfahren 4 in Vivo Tumor targeting Charakterisierung von PET imaging zu visualisieren Tumor Aufnahme relativ zum Hintergrund (d.h. Energiesubventionen gesundes Gewebe) und bestimmen, ob das Beispiel AC gezielt und effektiv kann Ziel Tumoren. Diese Methoden sind ausreichend für die Ermittler, die Entwicklung von ACs modifiziert mit Virus-abgeleitete Peptide, Kandidaten für die Weiterentwicklung zu identifizieren.

Protokoll

Die in Vivo Tierversuche beschrieben wurden nach einem genehmigten Prüfplan und nach den ethischen Richtlinien des Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke Ethikkommission für Tierversuche durchgeführt.

(1) Antikörper Peptid Konjugation

Hinweis: ChAcNLS können zu jeder kommerziellen Peptid Hersteller und Universität angeschlossenen Peptid-Synthese-Service-Plattform synthetisiert werden. Die Synthese von ChAcNLS finden Sie im Referenz- 34. Für Verfahren 1 und 2 verwenden der mAb 7 3, die spezifisch für die Leukämie-Antigen IL-3Rα 39.

  1. Bereiten Sie in einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch eine 10 mg/mL (~ 1 mg insgesamt Antikörper) Lösung von 7 3 in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7.6.
  2. Auflösen von Sulfo-SMCC in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5-10 mM. Vortexen die Lösung funktioniert gründlich am besten, um vollständige Auflösung zu erreichen.
  3. Fügen Sie in das Röhrchen mit 7 3 die gelösten Sulfo-SMCC-Lösung (in der Regel zwischen 5-20 μl je nach das molare Verhältnis von Sulfo-SMCC-zu - 7 3 gewünscht). Sulfo-SMCC-bis - 7 3 Verhältnisse von 10, 25 und 50-1-Tests empfohlen. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
  4. Reinigen Sie und konzentrieren Sie die Maleimide derivatisiert 7 3 mittels Ultrafiltration Gerät und Puffer Austausch mit PBS-Puffer, pH 7,0. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für ca. 5 min. verwerfen Durchströmung und füllen sich mit PBS, pH 7,0 und Zentrifuge wieder.
    1. Führen Sie diese 7 - 8 Mal den Puffer komplett auszutauschen. Wiederherstellen der konzentrierten 7 3 Protein indem man die Filtereinrichtung kopfüber in einen sauberen Microcentrifuge Schlauch. Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g. Wiederherstellungs-Volume sollte etwa 0,3 mL
  5. In der Röhre, mit den Maleimide aktiviert 7 3 2-fold Molaren Überschuss an ChAcNLS im Vergleich zu den Sulfo-SMCC - 7 Verhältnis: 3 verwendet, die im vorherigen Schritt hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Wenn ein 10-zu-1 Sulfo-SMCC - 7 Verhältnis: 3 verwendet wurde, dann z. B. ein 20: 1-ChAcNLS - 7 Verhältnis: 3. Gesamtvolumen sollte nicht wesentlich verändert werden.
    Hinweis: Obwohl ChAcNLS keine Niederschläge während der Konjugation Prozess verursacht, ist dies eine Möglichkeit, die mit anderen Peptiden auftreten könnten. Beobachten Sie das Rohr während der Reaktion auf Anzeichen von Niederschlägen, die am ehesten wird verursacht, wenn Peptide hydrophob sind. In diesen Fällen kann es sich lohnen das Peptid von Interesse um Konstruktionsänderungen zu erhöhten Hydrophilie Neubetrachtung.
  6. Die 7G 3-ChAcNLS mit einer Ultrafiltration Gerät auf gewünschte Konzentration und Puffer Austausch in PBS pH-Wert 7,4 (siehe Punkt 1.4) zu konzentrieren. Die Recovery-Ausbeute an Gesamt-Protein sollte ≥ 75 % des Ausgangsmaterials ab.
  7. Führen Sie die SDS-PAGE um die konstruierte 7G 3-ChAcNLS-Kandidaten mit einem 12 % Polyacrylamid-Gel (bietet ausreichende Trennung von der ChAcNLS konjugiert schwere und leichte Ketten aus nonconjugated Ketten) zu bewerten. Mix 10 μg des 7G 3-ChAcNLS in SEITENLADEN Puffer mit 2 μL β-Mercaptoethanol und laden Sie in Brunnen.
  8. Richten Sie die entsprechende Spannung (120 V für 1 h für einen 12 %-Gel) und führen Sie die Elektrophorese. Die Elektrophorese zu stoppen, wenn Coomassie Farbstoff vorne das Ende des Gels erreicht.
    Hinweis: Lassen Sie nicht das Gel weglaufen Coomassie Farbstoff vorne.
  9. Elektrophorese-Apparatur Gel entfernen und Spülen mit entfärben Lösung mit 10 % V/V Eisessig und 20 % V/V Methanol.
  10. Nehmen Sie ein Foto des Gels und mit einem Lineal und Messen der Abstand (cm) migriert für die Standards und 7 3 Konjugate. Berechnen Sie die Aufbewahrung Faktor (Rf) Wert, entspricht der Abstand geteilt durch die Gel-Länge (aus dem Protein vor Migration Coomassie geladen ist) migriert. Das Molekulargewicht (MW) im Protokoll gegen die Rf-Werte aus jedes Protein standard des Grundstückes und extrapolieren, die Größe der 7 3 konjugiert.
  11. Berechnen Sie die Anzahl der Peptide pro Antikörper durch Division der Differenz in MW 7 3 konjugiert und unveränderten 7 3 von 1768.5 g/Mol (MW ChAcNLS).
  12. Nehmen Sie digitale Bilder des Gels Coomassie gefärbt und durchführen Sie Densitometrie Analysen. An dieser Stelle kann Auswahl eines Lead-Kandidaten am AC mit der maximalen Anzahl von ChAcNLS Molekülen beruhen, die keine signifikante aggregierte Arten enthält.

(2) konfokalen Mikroskopie für intrazelluläre Akkumulation Bewertung

Hinweis: Es ist wichtig, die Zelle Selektivität der intrazellulären Akkumulation von Peptid-modifizierte mAbs vor der Entwicklung von Rezepturen mit einer Nutzlast von Interesse zu testen. Da Tat auch gezeigt hat, eine Neigung für unspezifische Zelle eindringen zu haben, lohnt es sich, erste Analyse intrazelluläre Akkumulation und Zelle Selektivität vor Unternehmen kostspielige Entwicklungsschritte mit teuren Nutzlasten. Aus diesem Grund sollten Verfahren 1 Isotype spezifische irrelevant Steuerung mAbs auch ändern. Für den Rest des Protokolls arbeiten wir mit ACs mit 10 ChAcNLS Moleküle pro Antikörper geändert. Eine schematische Darstellung, einschließlich der wichtigsten Schritte für Verfahren 2 und 3 wird in Abbildung 2beschrieben.

Achtung: Dieser Schritt des Protokolls umfasst die Bearbeitung und Manipulation von Paraformaldehyd. Befolgen Sie Anweisungen des Herstellers beim Umgang mit.

  1. TF-1a Zielzellen mit 200 nM 7G 3-ChAcNLS einschließlich geändert Kontrolle mAbs zu behandeln. Inkubieren Sie 5 x 106 Antigen-positiven Zellen mit der Konjugate für 1 h bei 37 ° c
  2. Nach 1 h überstand entfernen und waschen mit 1 mL 3 X in eiskaltem PBS. Frische Medien hinzufügen und eine weitere Stunde bei 37 ° c inkubieren
  3. Nach einer zusätzlichen Stunde überstand zu entfernen und 3 X in 1 mL eiskaltem PBS waschen. Fügen Sie 0,5 mL PBS mit 0,25 % Trypsin und Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu) bei 37 ° C für 3 bis zu 30 min.
    Hinweis: Während der erste Pilotversuche empfiehlt es nicht trypsinize Zellen, um die Unterschiede in AC intrazelluläre Akkumulation bestimmen. Dieses Protokoll fördert den Einsatz von Trypsin und wir zeigen, wie diese Bewertung der intrazellulären Akkumulation Effizienz der verschiedenen AC-Kandidaten verbessert.
    1. Testen Sie die verschiedenen Zeiten für die Inkubation indem Sie visuell auf alle Zellen, die losgelöst. Außerdem brüten Sie Zelle Aliquote mit Lebensfähigkeit Färbung Lösungen und durchführen Sie durchflusszytometrischen Analyse als zuvor beschriebenen 40.
    2. Trypsin mit 1,5 mL der Zellkultur RPMI 1640 media/10% fetalen Rinderserum zu neutralisieren. Zellen bei 500 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand zu entfernen, und 3 X in 0,5 mL eiskaltem PBS waschen.
  4. Fix-Zellen in 0,5 mL PBS mit 1 % Paraformaldehyd und 1 % Saccharose auf Eis für 30 min. Waschen Zellen 3 X 0,5 mL eiskaltem PBS und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min. Permeabilize Zellen in 0,5 mL PBS mit 0,15 % Triton x-100 für 5 min auf Eis. Zellen in eiskaltem PBS waschen und Zentrifugation zu wiederholen.
  5. Sperren von Zellen in 0,1 mL PBS mit 2 μg/mL (oder dem Hersteller empfohlenen Konzentration) von einer Anti-Murine (Isotype spezifische) Fc sekundäre polyklonalen Antikörper konjugiert, AlexaFluor 647 für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    1. Zentrifugieren Sie bei 250 X g für 5 min und waschen Zellen 3 X 0,5 mL eiskaltem PBS. Zellen in 0,5 mL PBS auszusetzen.
      PAUSE: Zellen können im Kühlschrank gelagert werden.
      Hinweis: Es ist wichtig, einen sekundären Antikörper auswählen, der erkennt die richtige Isotype MAB von Interesse. AF647 ist wegen seiner Fern-Infrarot-Emission ausgewählt, die nicht stören Propidium Jodid (PI) Färbung des Kerns.
  6. PI zu einer Konzentration von 10 μg/mL auf den Container mit Zellen hinzufügen. Als nächstes montieren Sie 1 x 10-5 -Zellen auf Glas-Objektträger mit Montage Medien und Abdeckung mit einem Glas Deckgläschen.
  7. Zellen mit einem Plan Apo 60 X Öl Immersion Ziel NA 1,42 auf eine invertierte Laserscanning confocal Mikroskop zu untersuchen. PI-Fluoreszenz mit 488 nm Argonlaser und die spektrale Scan Prisma set für 600-650 nm zu erkennen. Verwenden Sie für AF647 Fluoreszenz 633 nm-Helium-Neon-Laser und die spektrale Scan Prisma für 650-700 nm eingestellt. Sammeln Sie nacheinander Fluoreszenz Emissionen von PI und AF647.
    Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Einstellung in die Bewertung und den Vergleich der Zellen. Allerdings musst du die Einstellungen für trypsiniert Zellen im Vergleich zu nicht-trypsiniert Zellen anpassen.
  8. Verwenden Sie Mikroskop-Software, um Bilder zu erwerben. Sammeln Sie Bilder mit horizontalen optischen Schnittserien von 1.024 x 1.024 Pixel mit 2 X Line durchschnittlich in 0,5 μm regelmäßigen Abständen über die gesamte Zelle Dicke genommen. Präsentieren Sie die Bilder so gestapelte Z-Projektionen von vier aufeinander folgenden Scheiben auf die maximale Fluoreszenzintensität.
  9. Zellen mit Mikroskop-Software analysieren. Notieren Sie die zellulären Verteilungsmuster der Konjugate. Konkret zu bewerten ob intrazellulären Fluoreszenz im Zytoplasma gruppiert ist und in der Nähe der Zelle Oberfläche oder diffuse und homogen. Auch Bewertung der relativen Fluoreszenzintensität pro Zelle.

(3) radioaktiv AC Bau und zelluläre Fraktionierung für die Bewertung von 64 Cu intrazellulären Transporteffizienz

Achtung: Schritte 3 und 4 umfassen die Handhabung und Bearbeitung von Radioaktivität. Bevor Sie diese Schritte durchführen, sollte Forscher Sicherheitstraining und Protokolle, die von ihrer Heimathochschule Strahlung Sicherheitsbehörde genehmigt genehmigt haben.

Hinweis: Für Verfahren 3 und 4 verwenden wir die mAb A14, die ist spezifisch für das invasive Blase Krebs Antigen IL-5Rα41. Darüber hinaus sind alle Experimente Zeit aufgrund der kurzen Halbwertszeit von 64Cu empfindlich. Im Allgemeinen ist es am besten, nicht zu warten, vergangene Woche in-vitro- Experimente durchführen und nicht länger als 72 h für in Vivo Studien.

  1. Aussetzen Sie 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic Säure (NOTA-NHS) eine 1,7 mL-Tube in DMSO zu einer Konzentration von 10 mM.
  2. Reagieren Sie 50-fold Molaren Überschuss an NOTA-NHS mit A14 (2 mg Ausgangsmaterial) in 0,1 M Natriumbicarbonat bei pH 8.6 für 1 h bei Raumtemperatur in einem Volumen ≤ 0,5 mL (das Endvolumen NOTA-NHS sollte nicht mehr als 2 % V/V des Gesamtvolumens).
  3. Reinigen und Buffer-Tausch NOTA-A14 verwenden eine Ultrafiltration Gerät mit PBS-Puffer, pH 7.6 (siehe Punkt 1.4).
  4. Führen Sie für die spätere Befestigung des ChAcNLS die Schritte 1,2-1,6.
  5. Reagieren Sie NOTA-A14-ChAcNLS (250 μg Chargen) mit 100 Megabecquerel (MBq) von 64CuCl2 in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH-Wert 5,5 für 1 h bei 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu wird auf die TR-PET-Zyklotron um die CIMS 42produziert.
  6. 64Cu-A14-ChAcNLS in PBS pH 7.4 mit einem Ultrafiltration Gerät, um die gewünschte Konzentration zu konzentrieren (siehe Punkt 1.4).
  7. Bestimmen Sie die radiolabeling Effizienz von 64Cu-A14-ChAcNLS durch sofortige Dünnschichtchromatographie (ITLC) Chromatographie mit Streifen und 0,1 M, pH 5,5 Natriumcitrat (ITLC Laufmittel) als Lösungsmittel. ITLC Streifen 0,5 μL aliquoten von der Reaktionslösung zuweisen. Führen Sie eine Autoradiograph des Streifens und erhalten Sie ein digitales Bild zu.
    1. Durchführen Sie Densitometrie erhalten den Anteil der gebundenen und freien 64Cu. Wenn freie 64Cu-Gehalt > 5 %, zum vorherigen Schritt zurückkehren Sie und führen Sie zusätzliche Reinigung.
    2. Darüber hinaus führen Sie SDS-PAGE mit Coomassie-Färbung um Aggregationen zu bewerten. Führen Sie eine zweite SDS-PAGE gefolgt von einer Autoradiograph des Gels um festzustellen, ob es radioaktiven aggregierte Arten.
  8. Affinität, die verbindliche Qualität Kontrollpunkt: inkubieren 64Cu-A14 Konjugate bei steigenden Konzentrationen (0-100 nM) in zweifacher Ausfertigung mit 1 x 106 Zellen pro mL. Um unspezifische Bindung zu schätzen, mischen Sie doppelte Proben von 64Cu-A14-Konjugate mit Zellen in Anwesenheit von 100-fold Molaren Überschuss an unbeschrifteten A14.
    1. Waschen Sie nach 1 h Inkubation auf Eis Zellen zu und zählen Sie insgesamt gebundenen Antikörper und total unspezifisch gebundene Antikörper Proben in einem Gamma-Zähler. Anzeigen Sie spezifische Bindung (insgesamt gebundenen Antikörper - unspezifische gebunden Antikörper) gegen reaktive freie 64Cu-A14 (nM) verwendet in der Probe im Diagramm. Bestimmen Sie die Dissoziationskonstante (Kd) durch nicht-lineare Regression mit Grafik-Software.
  9. Für 64Cu zellulären Akkumulation Studien: Behandlung von Zellen mit 100 nM 64Cu-Label A14 Konjugate für 1 h, 6 h und 24 h bei 37 ° C wie oben beschrieben33. Sind zusätzliche Parameter wie die Behandlung im Beisein von unveränderten A14 zu Block IL-5Rα und bei 4 ° C, Rezeptor-vermittelte Verinnerlichung zu blockieren.
  10. Zum definierten Zeitpunkt Punkte, wie im zuvor beschriebenen Schritt 2.3 - 2.3.2, hinzufügen 0,5 mL PBS mit 0,25 % Trypsin und EDTA bei 37 ° C gefolgt von der Neutralisation und waschen.
  11. Inkubieren Sie Zellen in Plasmamembran Lyse Puffer mit 1 % NP-40, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 Puffer auf Eis für 10 min Zentrifugieren der Plasmamembran lysiert Zellen 90 X g für 5 min.
  12. Überstand und in frische Röhre. Zytoplasmatischen Bruchteil. Waschen Kerne 3 X in eiskaltem PBS und der zytoplasmatischen Bruchteil Wäschen hinzufügen.
  13. Sicherstellen Sie, dass die Ampullen mit der nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionen verschlossen sind. Dann legen Sie sie in eine Gamma-Korrektur gegen kalibriert für 64Cu um rohe zählt in MBq zu konvertieren.
  14. Entscheiden über die Qualität der Kerne Isolation durch Western-Blot Analyse für Lamin a/c, eine eingeschränkte nuklearen Protein und Rab7, ein reichlich zytoplasmatischen Proteine auf ganze Zelle lysate, nukleare und zytoplasmatischen Brüche.
    1. Behandlung 5 x 106 Zellen mit 500 μL des Radio-Immunopräzipitation Testpuffer (RIPA) und der Plasmamembran Lyse Puffer im Schritt 3,12 mit 1 %, 2 % und 4 % NP-40. Darüber hinaus behandeln Sie die isolierte Kerne in 500 μl Puffer RIPA, isolierte nuklearen Proteine zu erhalten.
    2. Überstürzen Sie sich isolierte nukleare, cytoplasmatische und ganze Zellproteinen mit 4 x das Probenvolumen von kaltem Aceton für 60 min bei-20 ° C. Bei 13.000 x g für 10 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie überstand man aufpassen, nicht das Protein Pellet zu verdrängen. Fügen Sie 100 μl PBS Proteine auflösen.
    3. Laden Sie 10 µg Protein in jede Vertiefung eine 10 % SDS-PAGE Gel. Durchführen Sie Elektrophorese, wie beschrieben in 1.7-1.9. Führen Sie Western-Blot Übertragung wie zuvor beschrieben in beyerdynamic 43.
    4. Identifizieren Sie die Leiter, die einen MW von ~ 40 kDa Marker, die am besten entsprechen. Halbieren Sie die Membran an diese Markierung. Sondieren Sie den Fleck mit der höheren MW-Proteinen mit Lamin A/C-spezifische Antikörper. Prüfen Sie die Membran mit den unteren MW-Proteinen mit der Rab 7-spezifische Antikörper. Western-Blot ist eine bekannte Technik und nicht in diesem Protokoll beschrieben.

4. PET-Bildgebung Bewertung Tumor Targeting

Hinweis: Die Techniken der Implantation von Tumorzellen bei Mäusen heterotopisch Xenotransplantate generieren sind bekannt und die meisten Labors haben eigene Protokolle für ihren Tumor-System zugeschnitten. So fällt dies nicht in das Protokoll. Xenograft-Modell wird nonobese Diabetiker/schweren kombinierten immungeschwächte (NOD/SCID) Mäuse mit IL-5Rα-positiven invasive Blase Tumoren HT-1376 und HT-B9. IL-5Rα-positiven invasive Blase Tumorzellen umfassen > 66 % der gesamten Zellen in die Xenograft. Im Gegensatz dazu waren nur ~ 11 % der HT-B9 IL-5Rα-positiven Zellen in entwickelten Xenotransplantate41ff. Somit ist dieses Modell ein hervorragendes Beispiel für die Bewertung der AC Tumor gezielt in zwei Tumoren, die absehbare Patienten Tumor Heterogenität darstellen.

  1. In Gruppen mit ≥ injizieren 4 (NOD/SCID) Mäuse, Sie 20-30 µg (6-9 MBq) von 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS und 64Cu-A14 in die Rute Vene.
  2. Am selben Tag legen Sie eine zylindrische Phantom (24,8 mL) enthält 5 MBq von 64Cu, injizierte Dosis pro Gramm Gewebe (%ID/g) der radioaktiven zählt pro Sekunde umzusetzen.
  3. Warten Sie 48 h und dann betäuben Sie Mäuse zu, indem man sie in eine Kammer der Induktion mit 1,5 L/min Sauerstoff-Flow mit 2 % Isofluran. Wenden Sie sterile ophthalmologischen Salbe auf Maus Augen an, nach Induktion und vor der Platzierung in PET-Scanner.
  4. Übertragen Sie die Maus schnell zu einem PET-Scanner Tisch in Bauchlage mit einem Prüfkopf für Isoflurane kopfüber. Position der Atmung und rektale Sonden und Überwachungsrate Temperatur und Atmung zu gewährleisten, dass die physiologische Bedingungen während des Experiments wie bisher beibehalten werden beschrieben 44.
  5. Starten Sie die PET-Datenerfassung mit einer regelmäßigen Stichproben-Modus-Einstellung und ein Energie-Fenster von 250-650 keV. In der Regel genügt ein 45-minütige statische Scan per Mausklick ausreichend koinzidente Ereignisse für Rekonstruktion und Herstellung von qualitativ hochwertigen PET-Bildern zur Verfügung zu stellen.
  6. Entfernen Sie nach dem Scan 64Cu-AC Maus vom Scanner zu und legen Sie sie zurück in den Käfig. Die Maus, um ausreichend zu erholen, vor der Rückkehr in die Tierhaltung ermöglichen.
  7. Rekonstruierten Bilder mit 20 Iterationen eines dreidimensionalen maximale Wahrscheinlichkeit Erwartung Maximization-Algorithmus zu erhalten.
  8. Durchführen Sie Region of Interest (ROI) Analyse der Tumor und visuell auswertbare Organe mit der Amid-Software.
    1. Ziehen Sie ROIs um quantitative %ID/g Daten manuell mithilfe der 3D Hilfsmittel "Freihand" Einstellung zu und abzugrenzen Sie sorgfältig, die Tumoren oder die angrenzenden Oberschenkelmuskel. Die Grafen pro Pixel im ROI werden in %ID/g aus vorherigen Schritt 4.2 konvertiert werden.
  9. Vergleichen Sie 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS Bilder für Tumor Kontrast und quantitative ROI % ID/g und Tumor-Hintergrund-Verhältnis.

Ergebnisse

Für Verfahren 1 modifiziert der Bau von 7 3 mit ChAcNLS mit Sulfo-SMCC wie ein Vernetzer sehr zuverlässig ist. In der Regel, wenn ein 12 %-Gel verladen und von SDS-PAGE analysiert, dadurch unterscheidbar schrittweise Erhöhung der MW proportional zur steigenden Sulfo-SMCC-bis - 7 3 Verhältnisse verwendet und ermöglicht für die schweren und leichten Ketten für ChAcNLS individuell beurteilt werden Konjugation (Abbildung 3). 7G 3 reagiert auf 10, 20, 25 und 50-zu-1-Sul...

Diskussion

Hauptziele der systemischen Lieferung von Anti-Krebs-Wirkstoffe sind Ansammlung am Tumor Standort und Aufnahme innerhalb von Krebszellen zu erhöhen und unerwünschte Nebenwirkungen bei gesunden Gewebe zu verringern. AC gezielte Bereitstellung von molekularen Nutzlasten für Tumorzellen ist ein sehr vielversprechender Ansatz zur Behandlung und Tumoren zu erkennen. Jedoch die mangelnde Wirksamkeit durch Endosom Einklemmung und down Stream lysosomalen Abbau bleibt eine wichtige Herausforderung. Während dieses Protokoll da...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Cancer Research Society (Kanada) und die CIMS finanziert. Die Autoren danken Dr. Samia Ait-Mohand und Jean-Francois Beaudoin um Unterstützung zu erhalten. Dr. Angel Lopez (University of South Australia) für mAb A14.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal FiltersEMD MilliporeUFC505096There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo ScientificA-212351 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antibody (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Thermo ScientificNP0007
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-25ML
TF-1a cellsATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction bufferThermo Scientific89900
AMIDE medical imaging softwareavailable at amide.sourceforge.netCompletely free download
FluoView FV1000 Confocal MicroscopeOlympus
Fluoview SoftwareOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC stripsBiodex150-771

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