JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Resumen

Conjugados de anticuerpos (ACs) modificados con péptidos derivados de virus son una clase potencialmente poderosa de tumor de la célula entrega agentes de cargas moleculares utilizadas en el tratamiento del cáncer y la proyección de imagen debido a la creciente acumulación celular sobre ACs actual. Durante el temprano AC en vitro desarrollo, técnicas de fluorescencia y radioinmunoanálisis son suficientes para determinar la localización intracelular, la acumulación eficiencia y especificidad de la célula blanco. En la actualidad, no existe consenso en los métodos estandarizados para la preparación de las células para evaluar la localización y acumulación intracelular de AC. Las pruebas iniciales de ACs modificado con péptidos derivados de virus es fundamental sobre todo si se han construido varios candidatos. Determinar la acumulación intracelular de fluorescencia puede ser afectado por la señal de fondo de ACs en la superficie celular y complicar la interpretación de la acumulación. Para radioinmunoanálisis, células tratadas normalmente se fracciona y midió la radiactividad en compartimentos celulares diferentes. Sin embargo, lisis celular varían de célula a célula y compartimientos a menudo citoplasmáticos y nucleares no están adecuadamente aislados. Esto puede producir la engañosos datos sobre propiedades de entrega de carga. La inyección intravenosa de radiactivos ACs de péptido modificado derivado de virus en ratones seguidos por gammagrafía del cojinete del tumor es un método eficaz para determinar propiedades de tumor targeting y carga entrega en la fase de en vivo de desarrollo. Sin embargo, esto es un avance relativamente reciente y pocos grupos han evaluado derivados de virus ACs péptido modificado de esta manera. Describimos el tratamiento de células tratadas para evaluar con mayor precisión derivados de virus modificado de péptido AC la acumulación cuando se utiliza el radioinmunoanálisis y microscopía confocal. Específicamente, un método para quitar la superficie de la célula de las células trypsinizing bound ACs. También proporcionamos un método para mejorar el fraccionamiento celular. Por último, este protocolo proporciona un método en vivo utilizando tomografía por emisión de positrones (PET) para evaluar el tumor inicial dirigida a propiedades en ratones con tumores. Utilizamos el radioisótopo 64Cu (t1/2 = 12,7 h) como una carga de ejemplo en este protocolo.

Introducción

Conjugados de anticuerpos (ACs) son productos biofarmacéuticos que están madurando en una clase transformadora de medicamentos eficaces para mejorar los tratamientos contra el cáncer y para detectar tumores. Compuesta por un anticuerpo monoclonal (mAb) conjugado con la moleculares cargas tales como radioisótopos, moléculas pequeñas y las toxinas biológicas, ACs son capaces de entregar las cargas útiles a las células cancerosas con destino exquisito antígeno afinidad y especificidad. Así, ACs tienen el potencial para reducir toxicidad inespecífica considerablemente y aumentar la actividad de carga en el sitio del tumor. Terapéutico, ACs transporte citotóxicas moléculas pequeñas (comúnmente contempladas como fármacos de anticuerpos conjugados) han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama y linfoma de Hodgkin, que han fracasado los tratamientos convencionales 1, 2. Además, radioisótopos transporte ACs (comúnmente contempladas como radioimmunoconjugates) también están en desarrollo. CA transporte de radioisótopos para la proyección de imagen está aprobado para la identificación de metástasis de cáncer de próstata 3. Con muchos ACs más terapéutico presentado para aprobación 4, el optimismo es alto para el futuro de ACs para mejorar la atención de cáncer 5.

Sin embargo, cuando ofrecer quimioterapia o radioisótopos, ACs tener dificultad con eficacia acumulando estas cargas dentro de las células diana. Este aspecto contribuye significativamente en muchos casos la imposibilidad de ACs para proporcionar larga duración de supervivencia libre de enfermedad o tumor de alto contraste proyección de imagen de 6,7. En general, una vez que ACs se unen su antígeno blanco se internalizan a través de un proceso conocido como endocitosis mediada por receptor. Los ACs son atrapados dentro de endosomas y trata a los lisosomas para su degradación y liberación de carga 8. El proceso de tráfico intracelular plantea desafíos para el ACs lograr una carga alta especificidad y eficacia contra las células cancerosas de destino. Por ejemplo, muchos antígenos como Her2 (target para terapéutica AC Trastuzumab-emtansine) puede reciclar hasta un 85% de los anticuerpos encuadernados en los primeros 30 min 9. Además, una vez que se produce degradación, quimioterápicos liberado y radioisótopos pueden ser activamente exportados por aumento de la expresión o actividad de transporte de membrana asociada proteínas 10,11. Degradación del lisosoma también impide la entrega de novela cargas biológicas tales como enzimas terapéuticas y oligonucleótidos que pueden ser desactivado de 12,13. En esencia, la célula cancerosa es altamente efectiva en abrogar la necesaria acumulación intracelular de cargas por ACs.

Este protocolo describe cómo implementar el concepto de ACs-unida a péptidos derivados de virus, especialmente para escapar captura endosome y localizar al núcleo celular. Con tal sofisticación para manipular sistemas host de la célula, no es sorprendente que el desarrollo de péptidos y proteínas derivadas del virus como potenciales biofármacos durante mucho tiempo ha sido arraigado en investigación terapéutica 14. Durante millones de años los virus han evolucionado para adquirir una colección excepcional de proteínas capaces de explotar los sistemas fisiológico normal de la célula mamífera para entrar eficazmente en las células del huésped. Para virus que son internalizados por endocitosis mediada por receptor, son también desafiaron con escape trata al lisosoma donde el embate de una concentración localizada de proteasas puede ser problemático para la supervivencia. Un bien caracterizado péptido viral derivados utilizado en la entrega de la droga para escapar captura endosome es el virus de inmunodeficiencia humana transactivator de transcripción (Tat) proteína 15. TAT es capaz de escapar captura endosome detectando en qué punto cambios conformacionales de la proteína ocurren Tat propicio para insertarse en y alterar la membrana endosomal del 16de pH bajo. Esto resulta en conjugados de Tat-carga útil acceder al citoplasma. El segundo elemento de manipulación viral relacionada con este protocolo es el enfoque utilizado para entregar genes terapéuticos y medicamentos para la de núcleo 17. Virus han evolucionado para manipular con éxito maquinaria de la célula huésped para progresar más allá de la membrana nuclear pasando a través del poro nuclear complejo (NPC). Macromoléculas celulares contienen (o se unen a proteínas que contienen) transportan de señales de localización nuclear (NLSs) necesarias para atar a nuclear proteínas (e.g. carioferinas α y β), que proporcionan los movimientos requeridos a través de la APN. Virus han desarrollado proteínas para contener secuencias NLS que les proporcionen la capacidad para utilizar proteínas de transporte de la célula anfitrión para realizar la transición en el núcleo 18.

Numerosos ACs previamente han sido funcionalizados con péptidos derivados de Tat y NLS y probados por su capacidad para acumular dentro de las células cancerosas y para apuntar tumores 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabla 1). Entrega de cargas citotóxicos los estudios han demostrado que ACs modificado con péptidos derivados de virus son capaces de aumentar significativamente la acumulación celular, citotoxicidad y tumor matando sobre si ACs 22,26. Una característica común de esta nueva clase de AC es su construcción. Por lo general, péptidos contienen una cisteína terminal proporciona un grupo sulfhidrilo libre. MAbs se reaccionó primero con un crosslinker bifuncional de noncleavable que contiene N- hydroxysuccinimide (NHS) y grupos de maleimida en extremos opuestos. Los ésteres de NHS reaccionan con aminas primarias en el mAb para formar enlaces amida. El mAb reaccionado con los grupos de maleimida gratis es entonces reaccionado con los grupos sulfhidrilo de los péptidos para formar un thioester enlace y así une el péptido y el mAb. Aunque homobifunctional reticulados han utilizado 28, heterobifunctional crosslinker son más comúnmente utilizados en la construcción de 22,23,de péptido derivado de virus-ACs26, 31,32. Este protocolo utiliza específicamente el crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por su facilidad de uso y porque se utiliza en el conjugado de anticuerpo-medicamento aprobado Trastuzumab-emtansine y en muchos 22, 8,23,26,de péptido derivado de virus-ACs de31,32. Electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) es el método principal para determinar inicialmente la eficiencia verbal y para la cuantificación del número de péptidos por mAb. La microscopia confocal utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia específico para el mAb suele ser el método para evaluar inicialmente la propiedades de la distribución intracelular de ACs de péptido modificado derivado de virus. Hasta el momento, radioisótopos son las cargas primarias por virus derivados péptidos modificados ACs. Radioisótopos son ventajosas porque la radioactividad en las células se cuantifica fácilmente contando gamma. Además, ACs que se traducen en modelos de ratón de los cánceres humanos proporcionan los investigadores con la capacidad de evaluar tumor targeting mediante modalidades de proyección de imagen moleculares, tales como emisión de fotón único tomografía computada y tomografía por emisión de positrones (PET) 23 , 32 , 33. en general, la construcción y validación de métodos utilizados principalmente por los investigadores de pruebas proporcionan una muy buena evaluación de ACs modificado con péptidos derivados de virus durante la fase de desarrollo inicial con eficacia y entregar los capacidad de carga interior de las células diana y atacan tumores.

TAT y NLS-modificado ACs tienen iluminadas áreas clave para mejorar aún más la entrega de la carga útil dentro de las células cancerosas y tumores. Con respecto a ACs NLS-modificado, la eficiencia en la acumulación intracelular puede ser modesta 23,31,34. Ineficaz acumulación intracelular es causada por compresión continuada endosomal. En vivo tumor targeting puede también disminuir con tanto Tat y NLS-modificado ACs. Las secuencias activas de Tat y NLS contienen varios residuos cargados positivas. Cuando sujeta a mAbs, la carga total catiónica puede ser significativamente mayor de 35. Como consecuencia, el Tat y NLS-modificado ACs han aumentado absorción en tejidos sanos y aumenta la separación rápida de la sangre.

Nuestro grupo desarrolló un compuesto compuesto compuesto de ácido cólico relacionado con NLS (ChAcNLS; Figura 1). Modificado de ChAcNLS ACs son capaces de aumentar la acumulación intracelular de radioisótopos entregados y mejorar tumor targeting en comparación con el tradicional y modificado de NLS ACs 33,34. El mecanismo detrás de ácido cólico se inspira en la capacidad de seleccionarlos nonenveloped virus que no puede confiar en la fusión de la membrana a utilizar ácido cólico para activar endosome escape a través de la formación de ceramida. Por ejemplo, virus entérico porcino reclutas de ácido cólico que activa la esfingomielinasa, que cataliza la hidrólisis de esfingomielina a ceramida 36,37,38. Esto desestabiliza la membrana endosomal y permite el escape del virus. Así, el ácido cólico es otro componente derivado de virus que complementa NLS.

Como este campo se mueve hacia adelante y el futuro los avances se producen en la entrega de la carga de ACs con péptidos derivados de virus, es un momento oportuno para ofrecer las manifestaciones visuales de sus características bioquímicas y funcionales durante el desarrollo inicial. Aquí, describimos nuestro protocolo para la evaluación inicial de los derivados del virus modificado de péptido ACs para la determinación simple pero eficaz de acumulación intracelular y tumor orientación durante el desarrollo temprano de la etapa. Usamos los mAbs comercialmente disponibles 7 3 y A14 como sistemas modelo de ejemplo. Procedimiento 1 describe el uso de SDS-PAGE como un método que permite las decisiones ' go/no go' de ACs construido. Procedimiento 2 describe un método mediante tripsinización permitiendo mejor visualización de la acumulación y la distribución intracelular de AC. Procedimiento 3 describe un método para mejorar fraccionamiento intracelular determinar con precisión la localización nuclear. En este procedimiento utilizamos la carga 64Cu (t1/2 = 12,7 h) ya que es vulnerable a la emanación celular y es un emisor de positrones 10. Así, 4 procedimiento describe en vivo tumor a caracterización por animal doméstico proyección de imagen para visualizar la captación del tumor en relación con el fondo (es decir, tejidos sanos no objetivo) y determinar si el ejemplo AC puede específicamente y con eficacia atacan tumores. Estos métodos son suficientes para los investigadores desarrollar ACs modificado con péptidos derivados de virus para identificar a candidatos para más adelanto.

Protocolo

Los en vivo animal experimentos descritos se realizaron según un protocolo aprobado y bajo las normas éticas del Comité de ética de la Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke en experimentos animales.

1. anticuerpo péptido verbal

Nota: ChAcNLS puede sintetizarse en cualquier fabricante comercial péptido o plataforma de servicio de síntesis de péptido Universidad-afiliado. La síntesis de ChAcNLS puede encontrarse en la referencia 34. Para los procedimientos 1 y 2 usar el mAb 3 7, que es específico para el antígeno de la leucemia IL-3Rα 39.

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, preparar un 10 mg/mL solución (anticuerpo total de ~ 1 mg) de 3 de 7 en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,6.
  2. Disolver el sulfo-SMCC en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 5-10 mM. Vortex la solución completamente funciona mejor con el fin de lograr la disolución completa.
  3. Agregar al tubo que contiene 3 7 la solución disuelta de sulfo-SMCC (normalmente entre 5-20 μL dependiendo de la relación molar de sulfo-SMCC-a - 7 3 deseado). Se recomienda la prueba sulfo-SMCC-a - 7 3 ratios de 10, 25 y 50 a 1. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Purificar y concentrar la maleimida derivatizada 7 3 utilizando un cambio de tampón y dispositivo de ultrafiltración en PBS, pH 7.0. Centrifugue a 8.000 g x aproximadamente 5 min descartar flujo a través y se llenan de PBS, pH 7.0 y centrifugar nuevamente.
    1. Realizar este 7 - 8 veces para intercambiar completamente el búfer. Recuperar el concentrado 3 7 proteína colocando hacia abajo el dispositivo de filtro en un tubo de microcentrífuga limpio. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g. volumen de recuperación debe ser aproximadamente de 0,3 mL
  5. En el tubo que contiene los 3 7 activado maleimida, añadir 2 veces exceso molar de ChAcNLS en relación con la proporción de sulfo-SMCC-a - 7 3 utilizada en el paso anterior e incubar durante una noche a 4 ° C. Por ejemplo, si se utilizó una proporción de sulfo-SMCC-a - 7 3 10 a 1, entonces utilice una proporción de 20 a 1 ChAcNLS-a - 7 3. Volumen total no debe ser cambiado significativamente.
    Nota: Aunque ChAcNLS no provoca precipitación durante el proceso verbal se trata de una posibilidad que podría ocurrir con otros péptidos. Observar el tubo durante la reacción para las muestras de precipitación, que es probablemente causada por péptidos son hidrofóbicos. En estos casos puede ser vale la pena revisar el péptido de interés para diseñar cambios para proporcionar mayor hidrofilia.
  6. Concentran el 7G 3-ChAcNLS utilizando un dispositivo de ultrafiltración deseado intercambio concentración y buffer pH 7.4 (ver paso 1.4) de PBS. El rendimiento de recuperación de la proteína total debe ser ≥ 75% de material original de partida.
  7. Realizar SDS-PAGE para evaluar a los candidatos de ChAcNLS 3 G 7 construido usando un gel de poliacrilamida al 12% (proporciona suficiente separación de la ChAcNLS conjugada pesado y cadenas de las cadenas más ligeras). Mix 10 μg de 7G 3-ChAcNLS de carga de las páginas de búfer que contiene 2 μL de β-mercaptoetanol y carga en bien.
  8. Establecer la adecuada tensión (120 V durante 1 hora para un gel de 12%) y correr la electroforesis. Detener la electroforesis cuando el frente del tinte Coomassie alcanza la parte inferior del gel.
    Nota: No deje que el frente del tinte Coomassie escurr el gel.
  9. Retirar el gel del aparato de electroforesis y enjuague con extracción de solución que contiene 10% v/v de ácido acético glacial y 20% metanol v/v.
  10. Tomar una fotografía del gel y con una regla y medir la distancia (cm) emigraron para los estándares y 7 3 conjugados. Calcular el valor del factor (Rf) de retención, que es la distancia migraron dividida por la longitud del gel (de donde la proteína se carga en el frente de migración de Coomassie). Parcela el peso molecular (MW) en el registro contra los valores de Rf de cada proteína estándar y extrapolar el tamaño de los 3 7 conjugados.
  11. Calcular el número de péptidos por anticuerpo dividiendo la diferencia de MW entre 7 3 conjuga y sin modificar 3 7 por 1768.5 g/mol (MW de ChAcNLS).
  12. Tomar imágenes digitales del gel teñido de Coomassie y realizar análisis de densitometría. En este punto, selección de un candidato del plomo puede basarse en la CA con el número máximo de moléculas de ChAcNLS que no contiene especies agregadas significativas.

2. confocal microscopio para la evaluación de la acumulación intracelular

Nota: Es importante comprobar la selectividad de la célula de la acumulación intracelular de los mAbs péptido modificado antes de desarrollar formulaciones con una carga útil de interés. Porque Tat también ha demostrado tener una propensión para la penetración del celular no específico, vale la pena el primer análisis intracelular célula y acumulación selectividad antes de pasos de desarrollo costoso de empresa con cargas costosas. Por esta razón, procedimiento 1 también deben modificar isotipo control irrelevante específico mAbs. Para el resto del protocolo vamos a trabajar con ACs modificado con 10 moléculas de ChAcNLS por anticuerpos. Un esquema incluyendo pasos clave para procedimientos de 2 y 3 se describe en la figura 2.

Atención: Este paso del protocolo implica el manejo y manipulación del paraformaldehido. Siga las instrucciones del fabricante cuando maneje.

  1. Tratamiento de las células de la blanco TF-1a con 200 nM de 7G 3-ChAcNLS incluyendo modificado control mAbs. Incubar 5 x 106 células de antígeno-positivas con los conjugados por 1 h a 37 ° C.
  2. Después de 1 h, eliminar el sobrenadante y lavar con 1 mL x 3 en PBS helado. Añadir medio fresco e incube durante una hora adicional a 37 ° C.
  3. Después de la hora adicional, eliminar el sobrenadante y lavar x 3 en 1 mL PBS helado. Añadir 0.5 mL de PBS con un 0.25% tripsina y etilendiaminotetracético ácido (EDTA) a 37 ° C por arriba de 3 a 30 min.
    Nota: Durante pruebas piloto inicial se recomienda no trypsinize las células con el fin de determinar las diferencias en la acumulación intracelular de AC. Este protocolo promueve el uso de la tripsina y demostramos cómo esto mejora la evaluación de la eficacia de la acumulación intracelular de diferentes candidatos de AC.
    1. Prueba los diferentes tiempos de incubación comprobando visualmente todas las células están separadas. Además, incubar alícuotas de células con soluciones de tinción de viabilidad y realizar el análisis cytometric del flujo como se describió anteriormente 40.
    2. Neutralizar la tripsina con 1,5 mL del cultivo celular RPMI 1640 media/10% suero bovino fetal. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y lavar 3 x 0,5 mL PBS helado.
  4. Fijar las células en 0.5 mL de PBS conteniendo paraformaldehído al 1% y 1% de sacarosa en el hielo para el lavado de 30 minutos células 3 x en 0.5 mL de PBS helado y centrifugar a 250 x g por 5 min Permeabilize las células en 0.5 mL de PBS con un 0.15% Tritón X-100 durante 5 minutos en hielo. Lavar las células en PBS helado y repetir la centrifugación.
  5. Suspender las células en PBS 0, 1 mL que contiene 2 μg/mL (o el fabricante recomendada concentración) de un anti-murino (isotipo específica) Fc secundaria anticuerpo policlonal conjugado con 647 AlexaFluor por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    1. Centrifugue a 250 x g por 5 minutos y lavar las células 3 x en 0.5 mL de PBS helado. Suspender las células en 0.5 mL de PBS.
      PAUSA: Las células pueden almacenarse en el refrigerador.
      Nota: Es esencial para seleccionar un anticuerpo secundario que reconoce el isotipo correcta del mAb de interés. AF647 se selecciona debido a su emisión de infrarrojo lejano, que no interfiere con la propidio yoduro (PI) tinción del núcleo.
  6. Añadir PI a una concentración de 10 μg/mL en el contenedor con las células. Montar 1 x 105 células en portaobjetos usando medios de montaje y la tapa con un cubreobjetos de vidrio.
  7. Examinar las células con un objetivo Plan Apo 60 X de inmersión aceite NA 1.42 en un láser invertido microscopio confocal de barrido. Detectar fluorescencia de PI usando el láser de argón 488 nm y el prisma de análisis espectral de 600-650 nm. Para AF647 fluorescencia utiliza los 633 nm láser de helio-neon y el prisma de análisis espectral de 650-700 nm. Recoger las emisiones de fluorescencia de PI y AF647 secuencialmente.
    Nota: Utilice la misma configuración a lo largo de la evaluación y comparación de las células. Sin embargo, deberás ajustar la configuración para las células tripsinizaron comparadas a las células no tripsinizaron.
  8. Usar software de microscopio para adquirir imágenes. Recoger imágenes usando serie horizontales secciones ópticas de 1.024 x 1.024 pixeles con 2 X línea promedio tomadas a intervalos 0,5 μm a través del espesor de toda la célula. Presente las imágenes apiladas como z-proyecciones de cuatro cortes consecutivos en la intensidad de fluorescencia máxima.
  9. Analizar las células con el software del microscopio. Grabar el patrón de distribución celular de los conjugados. Específicamente, evaluar si la fluorescencia intracelular en el citoplasma se agrupa y cerca de la célula superficial o difusa y homogénea. También evaluar la intensidad de fluorescencia relativa por la célula.

3. radiactiva CA construcción y fraccionamiento celular para la evaluación de la eficiencia de transporte intracelular Cu 64

PRECAUCIÓN: Los procedimientos 3 y 4 implican el manejo y manipulación de la radiactividad. Antes de realizar estos pasos, los investigadores deben han aprobado formación de seguridad y protocolos de actuación aprobados de autoridad de seguridad de radiación de su institución de origen.

Nota: Para los procedimientos 3 y 4 se utiliza el mAb A14, que es específico para el antígeno de cáncer de vejiga invasivo IL-5Rα41. Además, todos los experimentos son sensibles debido a la corta vida media de 64Cu. En general, es mejor no esperar 1 semana para realizar experimentos en vitro y no más de 72 h para los estudios en vivo .

  1. En un tubo de 1,7 mL suspender el ácido 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (NOTA-NHS) de DMSO a una concentración de 10 mM.
  2. Reaccionar 50-fold exceso molar de NOTA-NHS con A14 (2 mg a partir de material) de bicarbonato de sodio de 0.1 M a pH 8.6 por 1 h a temperatura ambiente en un volumen ≤ 0,5 mL (volumen final de la NOTA-NHS no debe exceder 2% v/v del volumen total).
  3. Purificar y amortiguador-cambio NOTA-A14 utilizando un dispositivo de ultrafiltración en PBS, pH 7,6 (ver paso 1.4).
  4. Para la fijación posterior de ChAcNLS, siga los pasos 1.2-1.6.
  5. Reaccionan NOTA-A14-ChAcNLS (lotes de 250 μg) con 100 megabecquerel (MBq) de 64CuCl2 en bicarbonato de sodio de 0.1 M, pH 5,5 por 1 h a 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu es producido en el ciclotrón de TR-PET en el CIMS 42.
  6. Concentran 64Cu-A14-ChAcNLS pH PBS 7.4 usando un dispositivo de ultrafiltración para la concentración deseada (vea el paso 1.4).
  7. Determinar la eficiencia radiolabeling de 64Cu-A14-ChAcNLS por cromatografía en capa fina instantánea (objetivo) mediante cromatografía y 0.1 M, citrato de sodio pH 5.5 (objetivo eluyente) como solvente. Aplicar alícuota 0,5 de μL de la solución de reacción a la franja de objetivo. Realizar un autoradiograph de la tira y obtener una imagen digital.
    1. Realizar densitometría ósea para obtener la proporción del límite y libre 64Cu. Si libre 64contenido Cu > 5%, volver al paso anterior y realizar la purificación adicional.
    2. Además, realizar SDS-PAGE con Coomassie tinción para evaluar las adiciones. Realizar un segundo de SDS-PAGE que seguido de un autoradiograph del gel para determinar si existen especies totales radiomarcadas.
  8. Afinidad de Unión punto de control de calidad: incubar 64Cu-A14 conjugados en concentraciones crecientes (0-100 nM) por duplicado con las células de blanco de 1 x 106 / mL. Para estimar el atascamiento no específico, mezclar muestras duplicadas de 64Cu-A14 conjugados con las células en presencia de 100-fold exceso molar de A14 sin etiquetar.
    1. Después de 1 h de incubación en hielo, lavar las células y contar muestras de anticuerpo unido total y total no específico anticuerpo unido en un contador gamma. Gráfica unión específica (anticuerpo unido total - no específica límite anticuerpo) contra reactivo libre 64Cu-A14 (nM) utilizado en el ensayo. Determinar la constante de disociación (Kd) por regresión no lineal utilizando el software de gráfica.
  9. Estudios de acumulación celular Cu 64: tratar las células con 100 nM de 64A14 Cu-labeled conjugados para 1 h, 6 h, y 24 h a 37 ° C como se ha descrito33. Incluir parámetros adicionales tales como el tratamiento en presencia de A14 sin modificar para bloquear IL-5Rα los sitios y a 4 ° C para bloquear la internalización mediada por receptor.
  10. En el momento definido puntos, como anteriormente se describe en paso 2.3 - 2.3.2, Añadir 0,5 mL de tripsina de 0,25% que contiene PBS y EDTA a 37 ° C seguido de neutralización y lavado.
  11. Incubar las células en tampón de lisis de membrana plasmática que contiene 1% NP-40, 10 mM de Tris de pH 7.5, NaCl 10 mM, 3 mM MgCl2 buffer en hielo durante 10 minutos centrifugar las células lisis de membrana plasmática 90 x g durante 5 minutos.
  12. Eliminar el sobrenadante y colocar en tubo fresco. Esto representa la fracción citoplasmática. Lavar los núcleos 3 x en PBS helada y agregar los lavados a la fracción citoplasmática.
  13. Asegúrese de que se sellan los frascos que contienen las fracciones citoplasmáticas y nucleares. Luego colóquelos en una gamma contador calibrada para 64Cu para convertir cuentas crudas de MBq.
  14. Determinar la calidad del aislamiento de los núcleos mediante la realización de análisis de Western blot para Lamin A/C, una proteína nuclear restringida y Rab7, una proteína citoplasmática abundante en toda célula fracciones lisados, nucleares y citoplásmicas.
    1. Tratar 5 x 106 células con 500 μL de tampón de ensayo (RIPA) radio inmunoprecipitación y el buffer de lisis de membrana plasmática en paso 3,12 que contiene 1%, 2% y 4% NP-40. Además, tratar los núcleos aislados en 500 μL de tampón RIPA para obtener aisladas proteínas nucleares.
    2. Precipitar las proteínas aisladas células nucleares, citoplasmáticos y todo utilizando 4 x el volumen de muestra de acetona fría durante 60 min a-20 ° C. Centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos y decantar el sobrenadante teniendo cuidado de no desalojar el precipitado de proteína. Añada 100 μL de PBS para disolver las proteínas.
    3. Carga de 10 μg de proteína en cada pozo del gel de SDS-PAGE 10%. Realizar la electroforesis como se describe en 1.7-1.9. Realizar a transferencia de Western Blot como previamente se describió en refeference 43.
    4. Identificar la escala de marcadores que mejor corresponden a un MW de 40 kDa. Corta la membrana a la mitad en este marcador. Probe el blot que contiene las proteínas mayor de MW con anticuerpos específicos Lamin A/C. Sondeo la membrana con las proteínas MW inferiores con los anticuerpos específicos de la 7 de Rab. Western blot es una técnica bien conocida y no descrito en el presente Protocolo.

4. animal doméstico proyección de imagen de evaluación del Tumor Targeting

Nota: Las técnicas de implantación de células tumorales en ratones para generar heterotopic xenoinjertos son bien conocidas y mayoría de los laboratorios tiene protocolos internos a medida para su sistema de tumor. Por lo tanto, esto no está cubierto en el protocolo. El modelo de xenoinjerto será nonobese diabético grave combinada (NOD/SCID) ratones inmunodeficientes con tumores de vejiga invasivo IL-5Rα-positive 1376 HT y HT-B9. Las células del tumor de vejiga invasivo IL-5Rα-positivos constituyen > 66% de células totales en los xenoinjertos. En cambio, sólo ~ 11% de las células IL-5Rα-positive HT-B9 figuran en xenoinjertos desarrollados41. Así este modelo es un excelente ejemplo para evaluar la AC tumor targeting en dos tumores que representan la heterogeneidad tumoral paciente previsible.

  1. En grupos que contienen ≥ 4 ratones (NOD/SCID), inyecte 20-30 μg (6-9 MBq) de 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS y 64Cu-A14 en la vena de la cola.
  2. El mismo día Coloque un fantasma cilíndrico (24,8 mL) que contiene 5 MBq de 64Cu para convertir las cuentas radiactivas por segundo en dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g).
  3. Espere 48 h y luego anestesiar ratones colocándolos en una cámara de inducción con 1.5 L/min de flujo de oxígeno con 2% de isoflurano. Aplique ungüento oftálmico estéril a los ojos del ratón después de la inducción y antes de la colocación en el tomógrafo PET.
  4. Transfiera rápidamente el ratón a una mesa del tomógrafo PET en la cabeza posición propensa con un cono de nariz para isoflurano. Posición de la respiración y las sondas rectales y monitor temperatura y respiración la tasa para asegurar que se mantengan las condiciones fisiológicas durante el experimento anteriormente describen 44.
  5. Iniciar la adquisición de datos de la PET utilizando una configuración de modo de muestreo regular y una ventana de energía de 250-650 keV. Por lo general, una exploración estática de 45 minutos por ratón es suficiente para proporcionar suficientes eventos coincidentes para la reconstrucción y producción de imágenes PET de alta calidad.
  6. Después de la exploración de 64Cu-CA, quite el ratón desde el escáner y colocar en la jaula. Permiten el ratón para recuperar lo suficiente antes de volver al centro de animales.
  7. Obtener imágenes reconstruidas usando 20 iteraciones de un algoritmo de máxima verosimilitud expectativa maximización tridimensional.
  8. Realizar la región de análisis de interés (ROI) del tumor y órganos visualmente evaluables mediante el software de amida.
    1. ROIs para obtener datos cuantitativos %ID/g manualmente utilizando el ajuste de la herramienta Freehand 3D de dibujar y delinear cuidadosamente los tumores o el músculo del muslo adyacente. Las cuentas por pixel en la ROI se convertirán en %ID/g del paso anterior 4.2.
  9. Comparar 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS imágenes para contraste del tumor y cuantitativo ROI % ID/g y ratios de tumor a fondo.

Resultados

Para el procedimiento 1, la construcción de 7 3 modificado con ChAcNLS uso de sulfo-SMCC como un crosslinker es muy confiable. Por lo general, cuando se cargan en un gel de 12% y analizadas por SDS-PAGE, esto se traduce en aumentos progresivo distinguibles en MW proporcional al aumento de ratios de sulfo-SMCC-a - 7 3 usa y permite para que las cadenas pesadas y ligeras para evaluarse individualmente para ChAcNLS verbal (figura 3). 7G 3 reaccionaron en 10, 20, 25-y ratios...

Discusión

Objetivos principales de la entrega sistémica de agentes contra el cáncer son aumentar la acumulación en el sitio del tumor y la absorción dentro de las células cancerosas y reducir los efectos secundarios no deseados en los tejidos sanos. Entrega de AC dirigido de cargas moleculares a las células tumorales es un enfoque muy prometedor para tratar y detectar tumores. Sin embargo, la falta de eficacia causada por atrapamiento del endosome y por degradación lisosomal de corriente sigue siendo un reto importante. Si ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la sociedad de investigación del cáncer (Canadá) y el CIMS. Los autores agradecen ayuda Dr. Samia Ait-Mohand y Jean-Francois Beaudoin. Dr. Ángel López (Universidad del sur de Australia) para mAb A14.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal FiltersEMD MilliporeUFC505096There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo ScientificA-212351 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antibody (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Thermo ScientificNP0007
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-25ML
TF-1a cellsATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction bufferThermo Scientific89900
AMIDE medical imaging softwareavailable at amide.sourceforge.netCompletely free download
FluoView FV1000 Confocal MicroscopeOlympus
Fluoview SoftwareOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC stripsBiodex150-771

Referencias

  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen, ., H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4 (2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195 (2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761 (2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier an mero 133p ptidos virales derivados conjugados de anticuerposSDS PAGEmicroscopia Confocalfraccionamiento celularcobre 64animal dom stico proyecci n de imagen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados