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Resumo

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Resumo

Anticorpo-conjugados (ACs) modificados com peptídeos derivados de vírus são uma classe potencialmente poderosa de agentes de entrega de célula de tumor para cargas moleculares, usado no tratamento do câncer e da imagem latente devido ao maior acúmulo celular sobre ACs atual. Durante o início AC em vitro desenvolvimento, técnicas de fluorescência e radioimunoanálises são suficientes para determinar a localização intracelular, eficiência de acumulação e especificidade de célula de destino. Atualmente, não há nenhum consenso sobre métodos padronizados para preparar células para avaliar a localização e o acúmulo intracelular de AC. Os testes iniciais de ACs modificado com peptídeos derivados de vírus é crítico, especialmente se vários candidatos foram construídos. Determinar o acúmulo intracelular por fluorescência pode ser afetada pelo sinal de fundo do ACs na superfície da célula e complicar a interpretação de acumulação. Para radioimunoanálises, células normalmente tratadas são fraccionadas e medido a radioatividade em compartimentos celulares diferentes. No entanto, lysis da pilha variam de célula para célula e muitas vezes nucleares e citoplasmáticos compartimentos não são adequadamente isolados. Isso pode produzir dados enganosos em Propriedades de entrega da carga. A injeção intravenosa de radiolabeled do vírus-derivado do peptide-modificado ACs no tumor ratos seguidos por imagens de radionuclídeos do rolamento é um poderoso método para a determinação de propriedades de entrega de direcionamento e carga de tumor na fase na vivo de desenvolvimento. No entanto, este é um avanço relativamente recente e alguns grupos avaliaram ACs de peptídeo-modificado vírus-derivado dessa maneira. Descrevemos o processamento das células tratadas com mais precisão, avaliar acúmulo de AC de peptídeo-modificado vírus-derivado quando usando radioimunoanálises e microscopia confocal. Especificamente, um método para células trypsinizing remover a superfície da célula vinculada ACs. Nós também fornecemos um método para melhorar o fracionamento celular. Por último, este protocolo fornece um método no vivo usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) para avaliar o tumor inicial direcionamento Propriedades em camundongos tumor-rolamento. Nós usamos o radioisótopo 64Cu (t1/2 = 12,7 h) como uma carga de exemplo neste protocolo.

Introdução

O-anticorpo cojugado (ACs) é produtos biofarmacêuticos que estão amadurecendo em uma classe de transformação de medicamentos eficazes para melhorar os tratamentos contra o cancro e para a detecção de tumores. Composto por um anticorpo monoclonal (mAb) conjugado com cargas moleculares como radioisótopos, pequenas moléculas e toxinas biológicas, ACs é capaz de entregar estas cargas para as células cancerosas com afinidade de antígeno alvo requintado e especificidade. Assim, ACs têm o potencial para reduzir a toxicidade inespecífica significativamente e aumentar a atividade de carga no local do tumor. Terapeuticamente, ACs transportar moléculas pequenas citotóxicas (comumente referidas como droga-anticorpo cojugado) foram aprovados para o tratamento de pacientes com câncer de mama e linfoma de Hodgkin que falharam os tratamentos convencionais 1, 2. Além disso, radioisótopos de transporte ACs (comumente referidos como radioimmunoconjugates) também estão em desenvolvimento. Uma AC transportando um radioisótopo para a imagem latente é aprovada para a identificação de metástase de câncer de próstata 3. Com muitos ACs mais terapêutico apresentado para aprovação 4, otimismo é alto para o futuro da ACs para melhorar os cuidados de câncer 5.

No entanto, quando entregando chemotherapeutics ou radioisótopos, ACs têm dificuldade em efetivamente acumulando estas cargas no interior das células alvo. Este aspecto contribui significativamente em muitos casos, na incapacidade de ACs para proporcionar a sobrevivência livre de doença de longa duração ou tumor de alto contraste de imagem 6,7. Em geral, uma vez que o ACs vincular seu antígeno alvo eles são internalizados através de um processo conhecido como endocitose mediada por receptores. O ACs são então aprisionado dentro endossomos e traficadas para lisossomos para degradação e carga versão 8. O processo de tráfico intracelular coloca desafios ACs alcançar uma carga alta especificidade e eficácia contra as células cancerosas do alvo. Por exemplo, muitos antígenos como Her2 (alvo terapêutico para AC Trastuzumab-emtansine) pode reciclar até 85% dos anticorpos ligados na primeira 30 min 9. Além disso, uma vez que a degradação ocorre, chemotherapeutics lançado e radioisótopos podem ser ativamente exportados pela expressão aumentada e/ou atividade de transporte de membrana associada a proteínas 10,11. Degradação do lisossoma impede também a entrega de cargas biológicas novela tais como enzimas terapêuticas e os oligonucleotides que podem ser desativado 12,13. Em essência, a célula cancerosa é altamente eficaz em que revoga o necessário acúmulo intracelular de cargas entregado pelo ACs.

Este protocolo descreve como implementar o conceito de ACs-acoplado a peptídeos derivados de vírus, especificamente para escapar de uma armadilha do endossomo e localizando para o núcleo da célula. Com tal sofisticação para manipular sistemas de células do hospedeiro, não é surpreendente que o desenvolvimento de vírus-derivado de proteínas e peptídeos como biopharmaceuticals potencial há muito tempo tem sido entranhado em investigação terapêutica 14. Há milhões de anos vírus evoluíram para adquirir uma excepcional colecção de proteínas capazes de explorar sistemas de células de mamíferos fisiológica normal a fim de efetivamente inserir células hospedeiras. Para vírus que são internalizados através de endocitose mediada por receptores, eles também são desafiados com escapando tráfico para o lisossomo, onde o ataque de uma concentração localizada de proteases pode ser problemático para a sobrevivência. Um peptídeo derivado viral bem caracterizado utilizado na entrega da droga para escapar de uma armadilha do endossomo é a vírus da imunodeficiência humana liberada de transcrição (Tat) proteína 15. Tat é capaz de escapar de uma armadilha do endossomo por sensoriamento baixo-pH, no ponto em que mudanças conformacionais da proteína ocorrerem habilitação Tat para inserir-se em e romper a membrana de CDDP 16. Isso resulta em conjugados de Tat-carga capazes de acessar o citoplasma. O segundo elemento de manipulação viral relacionado ao presente protocolo é a abordagem usada para entregar o núcleo 17genes terapêuticos e drogas. Vírus evoluíram para manipular com êxito a maquinaria de célula hospedeiro para progredir além da membrana nuclear, passando através do poro nuclear complexo (NPC). Macromoléculas celulares contêm (ou ligar-se a proteínas que contêm) um sinal de localização nuclear (NLSs) necessário para a vinculação a nuclear transporte de proteínas (por exemplo, carioferinas α e β), que fornecem os movimentos necessários através do NPC. Vírus desenvolveram-se as proteínas para conter sequências de NLS que proporcionam-lhes a capacidade de utilizar proteínas de transporte celular anfitrião para o vaivém do núcleo de 18.

Inúmeras ACs anteriormente foram acrescida com Tat e NLS derivada de peptídeos e testado pela sua capacidade de se acumular no interior das células de câncer e para o direcionamento de tumores 19,20,21,22 ,23,24,25,26,,27,28,29,30 (tabela 1). Estudos entregando cargas citotóxicas têm demonstrado que a ACs modificado com peptídeos derivados de vírus são capazes de aumentar significativamente o acúmulo celular, citotoxidade e tumor matando por não modificado ACs 22,26. Uma característica comum para essa nova classe de AC é sua construção. Normalmente, peptídeos contêm uma cisteína terminal fornecendo um grupo sulfidrila livre. Celia é primeiro reagiu com um crosslinker bifuncional noncleavable contendo N- Hidroxisuccinimida (NHS) e grupos de maleimide em lados opostos. Os ésteres de NHS reagem com aminas primárias sobre o mAb para formar ligações Amida. O mAb reagiram com grupos maleimide livre é então reagiu com os grupos sulfidrila nos peptídeos para formar uma ligação Tioéster e, portanto, vinculando o peptídeo e mAb. Apesar de homobifunctional crosslinkers foram utilizados 28, heterobifunctional reticulador são mais comumente usados na construção de vírus-derivado do peptide-ACs 22,23,26, 31,32. Este protocolo usa especificamente a sulfosuccinimidyl reticulador 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por sua facilidade de uso e porque ele é usado no conjugado anticorpo-droga aprovada Trastuzumab-emtansine e, em muitos vírus-derivado do peptide-ACs 8,22,23,26,31,32. Eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) é o principal método para inicialmente determinar a eficiência de conjugação e semi quantificando o número de peptídeos por mAb. Microscopia confocal usando um fluorescente etiquetado anticorpo secundário específico para o mAb é normalmente o método de avaliação inicialmente Propriedades de distribuição intracelular do vírus derivado do peptide-modificado ACs. Até então, radioisótopos são as cargas primárias entregadas pelo vírus-derivado do peptide-modificado ACs. Radioisótopos são vantajosos porque radioatividade nas células é facilmente quantificada pela contagem de gama. Além disso, a ACs que são convertidos em modelos do rato de cânceres humanos fornecem pesquisadores com a capacidade de avaliar o tumor como alvo usando as modalidades de imagem moleculares, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada e tomografia por emissão de pósitrons (PET) 23 , 32 , 33. em geral, a construção e validação de teste métodos utilizados principalmente por pesquisadores fornecem uma avaliação muito boa de ACs modificado com peptídeos derivados de vírus durante a fase inicial de desenvolvimento para efetivamente entrar e entregar o carga no interior das células alvo e para tumores de alvo.

TAT e NLS-modificado ACs tem iluminadas áreas-chave para melhorar ainda mais a entrega da carga no interior das células de câncer e de tumores. No que diz respeito a ACs NLS-modificado, a eficiência no acúmulo intracelular pode ser modesto 23,31,34. Acúmulo intracelular ineficiente é causado por uma armadilha CDDP continuado. Na vivo o tumor como alvo pode também ser diminuída com ambos Tat e NLS-modificado ACs. As sequências de ativas de Tat e NIS contêm vários resíduos carregados positivos. Quando anexado a Celia, a carga total catiônica pode ser significativamente aumentada 35. Como consequência, o Tat - e NLS-modificado ACs têm aumentado a captação em tecidos saudáveis e aumentou a liberação rápida de sangue.

Nosso grupo desenvolveu um composto composto consistindo de ácido cólico, ligado à NLS (ChAcNLS; A Figura 1). ACs ChAcNLS modificados são capazes de aumentar o acúmulo intracelular de radioisótopos entregues e melhorar o tumor como alvo em relação ao tradicional e modificado NLS ACs 33,34. O mecanismo por trás de ácido cólico é inspirado pela capacidade de selecionados vírus nonenveloped que não podemos confiar na fusão da membrana para utilizar ácido cólico para acionar o endossomo fuga através da formação de ceramida. Por exemplo, vírus entéricos porcinos recrutas ácido cólico que ativa o sphingomyelinase, que catalisa a hidrólise de esfingomielina em ceramida 36,37,38. Isto desestabiliza CDDP membrana e permite a fuga de vírus. Assim, o ácido cólico é outro componente derivado de vírus que complementa o NLS.

Como este campo se move para a frente e futuros avanços ocorrem em entrega de carga pelo ACs modificado com peptídeos derivados de vírus, é um momento oportuno para fornecer demonstrações visuais de suas caraterísticas bioquímicas e funcionais durante o desenvolvimento inicial. Aqui, descrevemos nosso protocolo para a avaliação inicial do vírus derivado do peptide-modificado ACs para a determinação de simples mas eficiente de acumulação intracelular e tumor direcionamento durante o desenvolvimento de fase precoce. Nós usamos o mAbs comercialmente disponível 7 3 e A14 como sistemas modelo de exemplo. Procedimento 1 descreve o uso de SDS-PAGE como um método que permite decisões 'ir ou não ir' para ACs construído. Procedimento 2 descreve um método usando tripsinização permitindo a melhor visualização da distribuição intracelular de AC e acumulação. Procedimento 3 descreve um método para fracionamento intracelular melhorado determinar com precisão a localização nuclear. Neste procedimento utilizamos a carga 64Cu (t1/2 = 12,7 h) porque é vulnerável ao efluxo celular e é um pósitron emissor 10. Assim, o procedimento 4 descreve na vivo tumor definião caracterização PET imagem para visualizar a captação do tumor em relação ao plano de fundo (ou seja, tecidos saudáveis nontarget) e determinar se o exemplo AC pode especificamente e efetivamente tumores do alvo. Estes métodos são suficientes para investigadores desenvolvendo ACs modificado com peptídeos derivados de vírus para identificar candidatos para mais avanço.

Protocolo

Na vivo animais descritos foram realizados experimentos de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Comitê de ética Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke para experimentos de Animal.

1. anticorpo do Peptide conjugação

Nota: ChAcNLS pode ser sintetizado em qualquer fabricante comercial do peptide ou plataforma de serviços de síntese de universidade-affiliated do peptide. A síntese de ChAcNLS pode ser encontrada na referência 34. Para os procedimentos 1 e 2 usar o mAb 7 3, que é específico para o antígeno de leucemia IL-3Rα 39.

  1. Em um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL, prepare um 10 mg/mL solução (anticorpo total de ~ 1 mg) de 3 de 7 em solução salina tamponada fosfato (PBS), pH 7,6.
  2. Dissolva sulfo-SMCC em dimetilsulfóxido (DMSO) na concentração de 5-10 mM. Utilização do Vortex a solução completamente funciona melhor para alcançar a completa dissolução.
  3. Adicione ao tubo contendo 7 3 a solução dissolvida sulfo-SMCC (normalmente entre 5-20 μL dependendo a razão molar de sulfo-SMCC-para - 7 3 desejada). Rácios de sulfo-SMCC-para - 7 3 de 10, 25 e 50 para 1 de teste é recomendado. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Purificar e concentrar-se o maleimide-derivatizado 7 3 por meio de uma troca de buffer e o dispositivo de ultrafiltração em PBS, pH 7.0. Centrifugar a 8.000 x g, durante aproximadamente 5 min. Discard fluxo através de e preenchimento com PBS, pH 7.0 e centrifugar novamente.
    1. Realizar isso de 7 - 8 vezes para trocar completamente o buffer. Proteína de recuperar o concentrado 3 7 colocando o dispositivo de filtragem de cabeça para baixo em um tubo limpo microcentrifuga. Centrífuga por 2 min em 1.000 x g. volume de recuperação deve ser aproximadamente 0,3 mL
  5. No tubo contendo o maleimide ativado 7 3, adicionar 2 vezes excesso molar de ChAcNLS em relação a proporção de sulfo-SMCC-para - 7 3 usado na etapa anterior e incubar durante a noite a 4 ° C. Por exemplo, se utilizou-se uma relação de sulfo-SMCC-para - 7 3 10 a 1, em seguida, use uma proporção de ChAcNLS-a - 7 3 20-para-1. Volume total não deve ser alterado significativamente.
    Nota: Apesar de não causar precipitação durante o processo de conjugação ChAcNLS esta é uma possibilidade que pode ocorrer com outros peptídeos. Observe o tubo durante a reação para sinais de precipitação, que provavelmente é causada quando peptídeos são hidrofóbicos. Nestes casos pode ser vale a pena revisitar o peptídeo de interesse a fim de projetar alterações para fornecer maior Hidrofilia.
  6. Concentre-se a 7G 3-ChAcNLS usando um dispositivo de ultrafiltração para troca de buffer e concentração desejada em pH PBS 7.4 (consulte a etapa 1.4). O rendimento da recuperação da proteína total deve ser ≥ 75% da matéria-prima original.
  7. Execute SDS-PAGE para avaliar os candidatos de 3-ChAcNLS 7G construído usando um gel de poliacrilamida 12% (fornece suficiente separação do ChAcNLS conjugados pesado e correntes de nonconjugated correntes de luz). Mix 10 μg de 7G 3-ChAcNLS no carregamento da página buffer contendo 2 μL β-Mercaptoetanol e carregar no poço.
  8. Definir a tensão apropriada (120 V por 1h para um 12% gel) e executar a eletroforese. Pare a electroforese quando a frente de corante Coomassie atinge a parte inferior do gel.
    Nota: Não deixe a frente de corante Coomassie expulse o gel.
  9. Retire o gel do aparelho de eletroforese e enxágue com solução contendo 10% v/v de metanol de ácido acético glacial e 20% v/v de descoloração.
  10. Tirar uma foto do gel e com uma régua e medir a distância (cm) migrou para os padrões e 7 3 conjugados. Calcular o valor de fator (Rf) de retenção, que é a distância migrou dividido pelo gel de comprimento (a partir de onde a proteína é carregada para a frente de migração de Coomassie). Plotar o peso molecular (MW) no log contra os valores de Rf de cada proteína padrão e extrapolar o tamanho de 3 a 7 conjuga.
  11. Calcule o número de peptídeos por anticorpo dividindo a diferença entre 7 3 MW conjugates e não modificados 7 3 por 1768.5 g/mol (MW de ChAcNLS).
  12. Levar imagens digitais do gel manchado de Coomassie e realizar a análise de densitometria. Neste ponto, seleção de um candidato de chumbo pode basear o AC com o número máximo de moléculas de ChAcNLS que não contém importantes espécies agregadas.

2. confocal microscopia para avaliação de acúmulo intracelular

Nota: É importante testar a seletividade de célula de acúmulo intracelular dos mAbs peptídeo-modificado antes do desenvolvimento de formulações com uma carga de interesse. Porque Tat também foi mostrado para ter uma propensão para a penetração celular inespecífica, vale a primeira analisando intracelular acumulação e célula seletividade antes de etapas de desenvolvimento caro empresa com cargas de caras. Por esta razão, procedimento 1 também deve modificar isotipo controle específico irrelevante mAbs. Para o resto do protocolo trabalharemos com ACs modificado com 10 moléculas de ChAcNLS por anticorpos. Um esquema incluindo etapas-chave para os procedimentos 2 e 3 é descrito na Figura 2.

Atenção: Esta etapa do protocolo envolve a manipulação e a manipulação de paraformaldeído. Por favor, siga as instruções do fabricante ao manusear.

  1. Trate as células alvo TF-1a com 200 nM de 7G 3-ChAcNLS incluindo modificado controle mAbs. Incubar a 5 x 106 células antígeno-positivo com os conjugados para 1 h a 37 ° C.
  2. Depois de 1 h, remover o sobrenadante e lavar com 1ml 3x em PBS gelado. Adicionar mídia fresca e incubar durante uma hora adicional a 37 ° C.
  3. Depois de uma hora adicional, remover o sobrenadante e lavar 3x em 1 mL PBS gelado. Adicione 0,5 mL de PBS contendo 0,25% ácido tripsina e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 37 ° C por até 3 a 30 min.
    Nota: Durante o piloto inicial de teste é recomendável para não trypsinize as células a fim de determinar as diferenças de acúmulo intracelular de AC. Este protocolo promove o uso de tripsina e demonstramos como isso melhora a avaliação da eficiência de acúmulo intracelular de diferentes candidatos de AC.
    1. Teste os diferentes tempos para incubação verificando visualmente todas as células a serem soltos. Além disso, incube alíquotas de célula com viabilidade coloração soluções e realizar a análise de fluxo cytometric como descrito anteriormente, 40.
    2. Neutralize a tripsina com 1,5 mL de cultura de células RPMI 1640 media/10% soro bovino fetal. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min, retire o sobrenadante e lavar 3x em 0,5 mL PBS gelado.
  4. Células de reparo em 0,5 mL de PBS contendo paraformaldeído 1% e 1% de sacarose no gelo por 30 min. lavagem células 3 x em 0,5 mL de PBS gelado e centrifugar 250 x g por 5 min. Permeabilize células em 0,5 mL de PBS contendo 0,15% Triton X-100 por 5 min no gelo. Lavam-se células em PBS gelado e repetir a centrifugação.
  5. Suspender as células em 0,1 mL de PBS contendo 2 μg/mL (ou o fabricante recomendadas a concentração) de um antimurino (isotipo específico) Fc polyclonal do anticorpo secundário conjugado com AlexaFluor 647 por 1h à temperatura ambiente no escuro.
    1. Centrifugar a 250 x g, durante 5 min e lavagem de células 3 x em 0,5 mL de PBS gelado. Suspenda as células em 0,5 mL de PBS.
      PAUSA: As células podem ser armazenadas na geladeira.
      Nota: É essencial para selecionar um anticorpo secundário que reconhece o isotipo correto do mAb de interesse. AF647 é selecionado por causa de sua emissão de infravermelho, que não interfere com coloração de propidium iodeto (PI) do núcleo.
  6. Adicione PI para uma concentração de 10 μg/mL para o recipiente com as células. Em seguida, monte a 1 x 105 células em lâminas de vidro, usando meios de montagem e cobrir com uma lamela de vidro.
  7. Examine as células com um objectivo de imersão de óleo Apo plano 60 X at 1.42 sobre um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Detecta a fluorescência de PI usando o laser de argônio 488 nm e o prisma de varredura espectral definida para 600-650 nm. Para fluorescência AF647 use o laser de hélio-neon 633 nm e o prisma de varredura espectral definida para 650-700 nm. Colete as emissões da fluorescência de PI e AF647 sequencialmente.
    Nota: Utilize a mesma configuração em toda a avaliação e comparação das células. No entanto, você terá que ajustar as configurações para as células trypsinized em comparação com células não-trypsinized.
  8. Use software de microscópio para adquirir imagens. Recolha imagens usando seriais ópticas seções horizontais de 1.024 x 1.024 pixels com linha X 2 com média de tomadas a intervalos 0,5 μm através da espessura de toda a célula. Estiveram presentes as imagens empilhadas como z-projeções de quatro fatias consecutivas a intensidade de fluorescência máxima.
  9. Analise as células com software de microscópio. O padrão de distribuição celular dos conjugados de registro. Especificamente, avalie se a fluorescência intracelular no citoplasma é agrupada e perto da célula superfície ou difusa e homogênea. Também avalie a intensidade de fluorescência relativo por célula.

3. radiolabeled AC construção e fracionamento celular para a avaliação da eficiência de entrega intracelular Cu 64

Atenção: Os procedimentos 3 e 4 envolvem a manipulação e a manipulação de radioatividade. Antes de executar essas etapas, pesquisadores devem aprovado treinamento de segurança e protocolos aprovados de autoridade de segurança de radiação de sua instituição de origem.

Nota: Para os procedimentos 3 e 4 usamos o mAb A14, que é específico para o antígeno de câncer de bexiga invasivo IL-5Rα41. Além disso, todas as experiências são tempo sensível devido a meia-vida curta de 64Cu. Em geral, é melhor não esperar 1 semana para realizar experimentos em vitro e não mais de 72 h para estudos em vivo .

  1. Em um tubo de 1,7 mL suspenda o ácido 2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic (NOTA-NHS) em DMSO a uma concentração de 10 mM.
  2. Reagir 50-fold excesso molar de NOTA-NHS com A14 (2 mg de material começar) de bicarbonato de sódio 0,1 M em pH 8,6 por 1h à temperatura ambiente em um volume ≤ 0,5 mL (volume final NOTA-NHS não deve exceder 2% v/v de volume total).
  3. Purificar e amortecedor-troca NOTA-A14 usando um dispositivo de ultrafiltração em PBS, pH 7,6 (consulte a etapa 1.4).
  4. Para posterior colocação de ChAcNLS, siga os passos 1,2-1,6.
  5. NOTA-A14-ChAcNLS (lotes de 250 μg) de reagir com 100 megabecquerel (MBq) de 64CuCl2 em bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 5,5 para 1 h a 37 ° C ≤ 0,1 mL. 64 Cu é produzido sobre o ciclotron TR-PET na CIMS 42.
  6. Concentre-se 64Cu-A14-ChAcNLS em pH PBS 7.4 usando um dispositivo de ultrafiltração para a concentração desejada (consulte a etapa 1.4).
  7. Determine a eficiência radiolabeling de 64Cu-A14-ChAcNLS por cromatografia de camada fina instantânea (ITLC) usando cromatografia de tiras e 0,1 M, pH 5.5 citrato de sódio (ITLC eluente) como solvente. Aplicam-se à faixa de ITLC 0,5 alíquota μL da solução de reação. Executar uma autoradiograph da tira e obter uma imagem digital.
    1. Realize densitometria para obter a proporção de limite e grátis 64Cu. Se livre 64Cu conteúdo > 5%, volte ao passo anterior e realizar a purificação adicional.
    2. Além disso, realize SDS-PAGE com Coomassie coloração para avaliar as agregações. Execute um segundo SDS-PAGE seguido por um autoradiograph do gel para determinar se existem radiolabeled espécies agregadas.
  8. Afinidade de ligação de ponto de verificação de qualidade: incube 64Cu-A14 conjugados em concentrações crescentes (0-100 nM) em duplicado com 1 x 106 células-alvo por mL. Para estimar a ligação inespecífica, misturar as amostras duplicadas de 64Cu-A14 conjuga com células em presença de 100 vezes excesso molar de A14 sem rótulo.
    1. Após incubação de 1 h no gelo, lavar as células e contagem total anticorpo acoplado amostras e amostras de total inespecífica anticorpo acoplado em um contador gama. Gráfico ligação específica (anticorpo limite total - inespecífica vinculado anticorpo) contra reativa livre 64Cu-A14 (nM) usado no ensaio. Determine a constante de dissociação (Kd) por regressão não linear utilizando software gráfico.
  9. Para estudos de Cu acumulação celular 64: tratar as células com 100 nM do 64Cu-rotulado A14 conjuga para 1 h, 6 h, e 24 horas a 37 ° C conforme descrito anteriormente33. Inclua parâmetros adicionais, tais como o tratamento na presença de A14 não modificado para bloquear IL-5Rα sites e em 4 ° C para bloquear a internalização mediada.
  10. No momento definido pontos, como descrito anteriormente no passo 2.3 - 2.3.2, adicionam 0,5 mL de tripsina de 0,25% contendo PBS e EDTA a 37 ° C seguido de neutralização e lavagem.
  11. Incubar as células em tampão de lise de membrana plasmática que contém 1% NP-40, pH de 10 mM Tris 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl2 amortecedor no gelo durante 10 min. Centrifugar as células da membrana plasmática-lysed a 90 x g por 5 min.
  12. Remover o sobrenadante e colocar num tubo de fresco. Isto representa a fração citoplasmática. Lave os núcleos 3 x em PBS gelado e adicionar lavagens para a fração citoplasmática.
  13. Certifique-se de frascos contendo as frações nucleares e citoplasmáticas são selados. Coloque-os em uma gama de contador calibrada para 64Cu para converter contagens crus para MBq.
  14. Determinar a qualidade do isolamento núcleos realizando análise ocidental do borrão para dulcineia a/c, uma proteína nuclear restrita e Rab7, uma proteína citoplasmática abundante em toda a célula lisadas, nucleares e citoplasmáticas fracções.
    1. Deleite de 5 x 106 células com 500 μL de tampão do ensaio (RIPA) rádio-imunoprecipitação e a lise de membrana plasmática em passo 3,12 contendo 1%, 2% e 4% NP-40. Além disso, trate os núcleos isolados em 500 μL de tampão, RIPA para obter proteínas nucleares isoladas.
    2. Precipitar proteínas de célula inteira, citoplasmática e nuclear isolado usando 4 x volume da amostra de acetona gelada por 60 min a-20 ° C. Centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos e decante o sobrenadante com cuidado para não deslocar o pellet de proteína. Adicione 100 μL de PBS para dissolver proteínas.
    3. Carrega 10 μg de proteína em cada poço de um gel de SDS-PAGE 10%. Execute eletroforese, conforme descrito em 1.7-1.9. Execute transferência Western Blot como descrito anteriormente no refeference 43.
    4. Identifica a escada marcadores que melhor correspondem a um MW de ~ 40 kDa. Corte a membrana em metade a este marcador. Teste do borrão contendo as proteínas MW superiores com anticorpos específicos lamina A/C. Teste da membrana com as proteínas MW inferiores com os anticorpos específicos 7 de Rab. Borrão ocidental é uma técnica bem conhecida e não descrito neste protocolo.

4. PET imagem avaliação do Tumor como alvo

Nota: As técnicas de implantação de células tumorais em camundongos para gerar xenografts heterotópica são bem conhecidas e a maioria dos laboratórios têm protocolos in-house, adaptados para o seu sistema de tumor. Assim, isto não é coberto no protocolo. O modelo de enxerto será obesos diabéticos/grave combinados imunodeficientes (NOD/SCID) ratos rolamento tumores de bexiga invasivo positivo-IL-5Rα HT-1376 e HT-B9. Células de tumor de bexiga invasivo IL-5Rα-positivo compreendem > 66% de células totais do enxerto. Em contraste, apenas ~ 11% de células positivas-IL-5Rα HT-B9 estavam contidos em xenografts desenvolvidos41. Assim, este modelo fornece um excelente exemplo para avaliar AC tumor direcionamento em dois tumores que representam a heterogeneidade de tumor paciente previsível.

  1. Em grupos contendo ≥ 4 ratos (NOD/SCID), injetar 20-30 μg (6-9 MBq) de 64Cu-A14-ChAcNLS 64Cu-A14-NLS e 64Cu-A14 a veia da cauda.
  2. No mesmo dia coloca um fantasma cilíndrico (24,8 mL) contendo 5 MBq de 64Cu para converter as radioativas contagens por segundo em dose injetada por grama de tecido (%ID/g).
  3. Esperar 48 horas e então anestesiar ratos, colocando-os em uma câmara de indução com 1,5 L/min de fluxo de oxigênio com 2% de isoflurano. Aplica pomada oftálmica estéril para os olhos de rato após a indução e antes da colocação em PET scanner.
  4. Transferi rapidamente o mouse para uma tabela de PET scanner na posição de bruços headfirst com um cone de nariz para isoflurano. Posição a respiração e sondas retais e monitor taxa de temperatura e respiração, para garantir a manutenção de condições fisiológicas durante o experimento, como anteriormente descrevem 44.
  5. Inicie a aquisição de dados de PET usando uma configuração de modo de amostragem regular e uma janela de energia de 250-650 keV. Normalmente, um scan estático de 45 minutos por rato é suficiente para fornecer suficientes eventos coincidentes para a reconstrução e produção de imagens de PET de alta qualidade.
  6. Após a verificação de 64Cu-AC, remover o rato do scanner e colocá-lo de volta na gaiola. Permitem o mouse para recuperar suficientemente antes de retornar para as instalações de animais.
  7. Obter imagens reconstruídas utilizando 20 iterações de um algoritmo de maximização de expectativa de probabilidade máxima tridimensional.
  8. Realize análise de interesse (ROI) do tumor e órgãos avaliável visualmente, usando o software de AMIDA da região.
    1. Desenhar ROIs para obter dados quantitativos %ID/g manualmente usando a configuração ferramenta Freehand 3D e cuidadosamente delinear os tumores ou do músculo da coxa adjacentes. As contagens por pixel no ROI serão convertidas em %ID/g da etapa anterior 4.2.
  9. Compare 64Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, imagens 64Cu-A14-NLS para contraste do tumor e quantitativos ROI % ID/g e rácios de tumor-de-fundo.

Resultados

Para o procedimento 1, a construção de 7 3 modificado com ChAcNLS usando sulfo-SMCC como um agente reticulante é muito confiável. Normalmente, quando carregado em um gel de 12% e analisadas por SDS-PAGE, isso resulta em distinguível gradual aumento proporcional ao aumento de rácios de sulfo-SMCC-para - 7 3 MW usado e permite para as cadeias pesadas e leves ser avaliada individualmente para ChAcNLS conjugação (Figura 3). 7G 3 reagiu em 10, 20, 25-e rácios de sulfo...

Discussão

Objetivos principais da entrega sistêmica dos agentes anti-câncer são aumentar a acumulação no local do tumor e absorção dentro de células cancerosas e diminuir efeitos colaterais indesejados em tecidos saudáveis. Entrega de AC alvejado de cargas moleculares de células tumorais é uma abordagem altamente promissor para tratar e detectar tumores. No entanto, a falta de eficácia causada por uma armadilha do endossomo e para baixo de degradação lisossomal fluxo permanece um desafio importante. Enquanto este pro...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela sociedade de pesquisa de câncer (Canadá) e o CIMS. Os autores Obrigado Dr. Samia Ait-Ludi e Jean-Francois Beaudoin para assistência. Dr. Angel Lopez (Universidade do Sul Austrália) para mAb A14.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal FiltersEMD MilliporeUFC505096There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor recombinant proteins from 10 - 250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redThermo Scientific25200056100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateThermo ScientificA-212351 - 10 μg/mL recommended
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antibody (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Thermo ScientificNP0007
2-MercaptoethanolSigma AldrichM3148-25ML
TF-1a cellsATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction bufferThermo Scientific89900
AMIDE medical imaging softwareavailable at amide.sourceforge.netCompletely free download
FluoView FV1000 Confocal MicroscopeOlympus
Fluoview SoftwareOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC stripsBiodex150-771

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