NMR-Spektroskopie als robustes Werkzeug für die schnelle Bewertung des Lipidprofil von Fischöl

Zusammenfassung

Hier hochauflösenden ¹ H und ¹³ C - Kernresonanzspektroskopie (NMR) wurde als ein schnelles und zuverlässiges Werkzeug für die quantitative und qualitative Analyse von verkapselten Fischölergänzungen verwendet.

Zusammenfassung

Die westliche Ernährung ist arm an n - 3 - Fettsäuren, also der Verzehr von Fischöl empfohlen wird , um die Aufnahme dieser essentiellen Nährstoffe zu erhöhen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die qualitative und quantitative Analyse von verkapselten Fischtranergänzungen unter Verwendung hochauflösender ¹ H und ¹³ C - NMR - Spektroskopie unter Verwendung von zwei verschiedenen NMR - Instrumente zu demonstrieren; Ein 500 MHz und einem 850 MHz-Instrument. Sowohl Proton ⁽¹ H) und Kohlenstoff ⁽¹³ C) NMR - Spektren können zur quantitativen Bestimmung der Hauptbestandteile der Fischölergänzungen verwendet werden. Die Quantifizierung der Lipide in Fischöl wird durch die Integration der entsprechenden NMR-Signale in den entsprechenden 1D-Spektren erreicht. Ergebnisse von ¹ H und ¹³ C - NMR sind in guter Übereinstimmung miteinander erhalten wird , trotz der Unterschiede in der Auflösung und die Empfindlichkeit zwischen den beiden Kernen und den beiden Instrumenten. ¹ H NMR Angebotsa schnellere Analyse im Vergleich zu ¹³ C - NMR, als das Spektrum in weniger als 1 min aufgezeichnet werden, im Gegensatz zu ¹³ C - NMR - Analyse, die von 10 min bis eine Stunde dauert. Das ¹³ C - NMR - Spektrum ist jedoch viel informativer. Es kann für eine größere Anzahl von einzelnen Fettsäuren quantitative Daten zur Verfügung stellt und kann zur Bestimmung der Positionsverteilung von Fettsäuren auf dem Glycerin-Backbone verwendet werden. Beide Kerne können in quantitative Informationen liefern nur ein Experiment, ohne die Notwendigkeit der Reinigung oder Trennschritte. Die Stärke des Magnetfeldes vor allem die Spektren ¹ H NMR wirkt aufgrund seiner geringeren Auflösung mit Bezug auf ¹³ C NMR jedoch auch geringer Kosten NMR Instrumente effizient als Standardverfahren der Lebensmittelindustrie und die Qualitätskontrolle Laboratorien angewandt werden können.

Einleitung

Der Verbrauch von n - 3 - Fettsäuren in der Nahrung hat sich als vorteilhaft gegen mehrere Bedingungen sein , wie beispielsweise Herzerkrankungen ^{1, 2, 3, 4} und entzündlichen Erkrankungen Diabetes ^5. Die westliche Ernährung ist in n - 3 - Fettsäuren als arm und damit der Verbrauch von Fischöl empfohlen wird , um die n -6 / n -3 Gleichgewicht in Verbraucherernährung ¹ zu verbessern. Trotz der jüngsten Zunahme der Fischtranergänzung Verbrauch, bleiben Fragen über die Sicherheit, Authentizität und Qualität einiger dieser Produkte. Die schnelle und genaue Analyse der Zusammensetzung von Fischöl ist wichtig, um richtig die Qualität dieser kommerziellen Produkte zu bewerten und die Sicherheit der Verbraucher zu gewährleisten.

Die am häufigsten verwendeten Methoden zur Bewertung von Fischöls sind Gaschromatographie (GC) und Infrarotspektroskopie (IR). Während diese hochsensible Methoden sind, leiden sie unter verschiedenen Nachteilen ^6. Die GC - Analyse ist zeitaufwendig (4-8 h) , da die Trennung und Derivatisierung von einzelnen Verbindungen erforderlich ⁷ und Lipidoxidation kann bei der Analyse ^{8, 9} auf. Während der IR - Spektroskopie quantitativ sein kann, wird ein Vorhersagemodell unter Verwendung von Partial Least Squares Regression (PLSR) konstruiert werden benötigt, obwohl es Ausnahmen gibt , in denen IR - Banden können ¹⁰ zu einer einzigen Verbindung zugeschrieben werden. PLSR erfordert die Analyse einer großen Anzahl von Proben, die ¹¹ , um die Zeit der Analyse erhöht. Aus diesem Grunde gibt es ein zunehmendes Interesse an der Entwicklung neuer analytischer Methoden, die genaue und schnelle Analyse einer großen Anzahl von Fischölproben ermöglichen. Organisationen wie der Office von Nahrungsergänzungsmitteln (ODS) an dem National Institutes of Health (NIH) und die Food and Drug Administration (FDA) hat mit der Association of Official Analytical Chemists (AOAC) zusammengearbeitet , diese neuen Methoden ¹² zu ^{entwickeln, 13.}

Eine der vielversprechendsten analytischen Methoden für das Screening und die Auswertung von Mehrkomponenten - Matrizen, wie beispielsweise Nahrungsergänzungsmittel ist, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) -Spektroskopie ^{14, 15.} NMR-Spektroskopie hat mehrere Vorteile: es ist eine nicht-destruktive und quantitative Technik, es ohne Probenvorbereitung minimal erforderlich ist, und es wird durch eine hervorragende Genauigkeit und Reproduzierbarkeit gekennzeichnet. Darüber hinaus ist die NMR-Spektroskopie eine umweltfreundliche Methode, da sie nur geringe Mengen an Lösungsmitteln verwendet. Der Hauptnachteil der NMR-Spektroskopie ist seine relativ geringe Empfindlichkeit im Vergleich zu anderen analytical Methoden haben jedoch die jüngsten technologischen Fortschritte in der Instrumentierung, wie beispielsweise stärkere Magnetfelder, kryogenen Sonden mit verschiedenen Durchmessern, fortschrittliche Datenverarbeitung, und vielseitige Pulssequenzen und Techniken, um die Empfindlichkeit bis zu nM-Bereich erhöht. Während NMR Instrumentierung hohen Kosten ist, senken die lange Lebensdauer von NMR-Spektrometern und die vielen Anwendungen der NMR die Kosten für die Analyse auf lange Sicht. Dieses detaillierte Video - Protokoll sollte neue Praktiker auf dem Gebiet helfen , Gefahren mit ¹ H und ¹³ C - NMR - spektroskopische Analyse von Fischölergänzungen assoziiert zu vermeiden.

Protokoll

1. NMR-Probenvorbereitung

Hinweis: Achtung, wenden Sie sich bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Deuteriertem Chloroform (CDCl ₃₎ bei der Probenherstellung verwendet wird , ist toxisch. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Probenvorbereitung einschließlich der Verwendung einer Abzugshaube und persönliche Schutzausrüstung durchführen (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe).

1. Herstellung von ¹ H und ¹³ C - Proben
   1. Extrahieren 120 ul (~ 110 mg) von Fischöl aus einer Nahrungs Kapsel unter Verwendung einer Spritze und gibt ihn in ein 4 ml-Glasfläschchen. Das Gewicht des Fischöls.
   2. Probe Auflösung
      1. Man löst etwa 120 & mgr; l von Fischöl in 500 ul CDCl ₃ , enthaltend 0,01% Tetramethylsilan (TMS) , das als Referenz für die ¹ H und ¹³ C - chemische Verschiebungen verwendet wird.
         HINWEIS: TMS ist die Verwendungd nur für die chemische Verschiebung der Kalibrierung nicht für die Quantifizierung (siehe Schritt Nummern 2.2.1.3 und 2.2.2.3) Zwecke (Schrittnummern 2.2.1.2.7 und 2.2.2.2.7 sehen).
      2. Vorbereiten einen 2,6-Di - tert - butyl-4-methylphenol (BHT) Stammlösung, falls die Quantifizierung , ausgedrückt in mg / g erwünscht ist , um etwa 220 mg BHT Lösen und 15 mg Chrom (III) -acetylacetonat (Cr ( acac) ₃₎ in 20 ml CDCl ₃ 0,01% TMS enthält. Verwenden 500 & mgr; l der Stammlösung von 100 mg (± 10 mg) von Fischöl zu lösen.
   3. (Dies dauert einige Sekunden) nach dem Lösen von Öl, übertragen die gesamte Lösung direkt in ein hochwertigen 5-mm-NMR-Röhrchen und eine Kappe befestigen. Analysieren Sie die Proben innerhalb von 24 Stunden nach der Herstellung der Proben.

2. NMR Instrumentenaufbereitung

Hinweis: Vorsicht, Vorsicht, dass das Vorhandensein von starken Magnetfelder, die durch NMR-Geräte produziert medizinische Geräte beeinflussen können und implAmeisen wie Schrittmacher und chirurgische Prothesen, sowie elektronische Elemente wie Kreditkarten, Uhren, etc. Zusätzliche Vorsicht ist erforderlich, wenn die Analyse nicht-Abschirm - Magneten durchgeführt wird. Zwei NMR Instrumente wurden für den Erwerb von ¹ H und ¹³ C - NMR - Spektren verwendet wird ; ein Spektrometer bei 850,23 MHz und 213,81 MHz für ¹ H und ¹³ C - Kern arbeiten, jeweils mit einer Dreifachresonanzheliumgekühlten inverser (TCI) 5 mm - Sonde und einem Spektrometer ausgestattet bei 500,20 MHz und 125,77 MHz für ¹ H und ¹³ C - Betrieb Kerne, die jeweils mit einem breiten Band ausgestattet beobachtet (BBO) 5 mm-Sonde Stickstoff gekühlt. Alle Experimente bei 25 ± 0,1 ° C durchgeführt wurden und die Spektren durch ein Standard-NMR-Datenanalyse Erfassung und Verarbeitung von Softwarepaket verarbeitet wurden (siehe Materialliste).

1. Vorbereitung für die NMR - Spektren Erwerb
   Anmerkung: ¹ H und ¹³ C NMR - Spektrenkann folglich erworben werden, ohne die Probe aus dem Gerät zu entfernen.
   1. Stecken Sie die NMR-Röhrchen in eine Schleuder Turbine (siehe Materialliste).
   2. Platzieren Sie den Spinner und das Rohr auf der Oberseite eines abgestuften Tiefenmaß und sanft drückt die Oberseite des Rohrs, bis sein Bodenteil den Boden des Sensors berührt.
   3. Legen NMR-Probe in einer offenen Stelle des SampleCase. Man beachte die Schlitznummer in der Probe angeordnet wird.
   4. Um die Probe in der NMR zu laden, kehren Sie zu dem Steuercomputer und geben Sie ‚sx #‘, wobei # der Schlitz in der SampleCase Halten Sie Ihre Probe ist.
   5. Warte auf das Deuterium - Signal von CDCl ₃ auf dem Sperrfenster - Bildschirm angezeigt. Wenn es nicht automatisch angezeigt wird, geben Sie „lockdisp“. Sobald das Deuteriumsignal sichtbar ist, Typ „sperrt“ auf der Befehlszeile und wählt „CDCl _3“ aus der Liste der Lösungsmittel, um die Probe unter Verwendung der _CDCI3 Deuterium Resonanz zu verriegeln.
      HINWEIS: Deuterium signal möglicherweise nicht angezeigt, wenn vorherige Benutzer ein anderes Lösungsmittel verwendet wird. Der Benutzer sollte für die Anzeige warten, dass die Probe nach unten ist, dann sperren.
   6. Type „bsmsdisp“ in der Befehlszeile Spinnen, um sicherzustellen, ist nicht aktiv. Wenn die Taste „Schleudern“ grün ist, klicken Sie Spinnen zu deaktivieren.
   7. Geben Sie den Befehl „Neu“ einen neuen Datensatz zu erstellen. Geben Sie einen Namen für die Daten, die im „NAME“ Tab und dem Experiment Nummer in der „EXPNO“ aus. Verwenden Nummer „1“ in der „PROCNO“ aus. Im „Experiment“ Registerkarte klicken Sie auf „Auswählen“ und wählen Sie die „PROTON“ Parameterdatei. Schreiben Sie den Titel des Experiments in der „TITLE“ aus. OK klicken."
   8. Geben Sie „getprosol“ in die Befehlszeile die Standard-Parameter für den aktuellen NMR-Sonde und Lösungsmittel zu erhalten.
   9. Wiederholen Sie Schritt 2.1.7 für ¹³ C, die "C13IG" Pulssequenz in dem "Experiment" Register für die ¹³ C 1D Auswählen inverse gated entkoppelt Experiment.
   10. Geben Sie „getprosol“ in die Befehlszeile die Standard-Parameter für den aktuellen NMR-Sonde und Lösungsmittel zu erhalten.
   11. Geben Sie den Befehl „Atma“, um die automatische Abstimmung und Anpassung der Sonde sowohl für Kohlenstoff und Protonenkerne zu führen.
   12. Durchführen einer eindimensionalen Gradienten ein hoch homogenes Magnetfeld zu erreichen Shimmen, und damit eine optimale Linienform für die NMR-Signale.
       1. Verwenden Sie den Standard-automatisches Verfahren für 1D- Shim, einfach durch sequentielles Ausführen der Befehle „qu topshim 1dfast ss“, „qu topshim tuneb ss“ und „qu topshim report“ in die Befehlszeile.
2. Parameteroptimierung
   1. 90 ° -Impuls Kalibrierungs
      1. Erstellen einen neuen Datensatz für ¹ H (siehe Schritte 2.1.7 und 2.1.8).
      2. Geben Sie den Befehl „paropt“ in der Befehlszeile für die Kalibrierung des 90 ° pul das Automatisierungsprogramm zu startense. Wählen Pulsdauer, p1, als Parameter geändert werden.
      3. Beginnen mit „2“ & mgr; s als den Anfangswert von P1, geben Sie „2“ & mgr; s-Schritte und durchzuführen, „16“ Experimente.
      4. Erstellen einen neuen Datensatz für C ¹³ (siehe Schritt 2.1.9) und wiederholt den Vorgang für ¹³ C - Kern (siehe Schritte 2.2.1.2 und 2.2.1.3).
   2. T ₁ Messung durch die Nullmethode gemessen ¹⁶ für ¹ H
      HINWEIS: Die Null - Methode verwendet die Inversion - Recovery - Pulssequenz, bestehend aus einem 180 ° -Impuls durch eine Folgeverzögerung (tau), Entspannung entlang der Z - Achse zu ermöglichen , und einem letzten 90 ° Impuls, der die beobachtbare transversale Magnetisierung erzeugt.
      1. Erstellen einen neuen Datensatz für ¹ H (siehe Schritte 2.1.7 und 2.1.8).
      2. Geben Sie „pulprog t1ir1d“, um die Impulsfolge zu dem Experiment Inversion-Recovery zu ändern.
      3. Geben Sie die folgenden Befehle auf dem commanD-Linie, um die spektrale Breite in ppm, in der Mitte des HF-Senders auf, die Anzahl von Abtastungen der Anzahl des Dummy-Scans und die Anzahl der Datenpunkte „SW 8“, „O1P 3.8“, „ns 2“, „ds 2" und "td 64K".
      4. Type „p1 (Wert)“ und gibt die Werte für die Dauer 90 ° Impuls, wie durch die Impuls Kalibrierung bestimmt (siehe Schritt 2.2.1) und Typ „p2 (Wert)“ für das 180 ° -Impuls (den Dauerwert für den 180 & deg; Impuls ist die Impulsdauer 90 ° mit zwei multipliziert).
      5. Stellen Sie die Recycling-Verzögerung auf einen sehr großen Wert, wie 10 s durch Eingabe von „d1 10“.
      6. Set tau auf einen kurzen Wert, wie 10 ms, durch „d7 10ms“ in der Befehlszeile eingeben.
      7. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
      8. Führen Sie ein Spektrum durch den Befehl „zg“ eingeben.
      9. Führen Sie Fourier-Transformation durch Eingabe von "EFP"in der Befehlszeile.
      10. Führen Sie die automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol, um den Phasenkorrekturmodus.
          1. Verwenden nullter Ordnung (0) und erste Ordnung (1) Phasenkorrektur-Symbole durch Ziehen der Maus, bis alle Signale in negativem Absorptionsmodus befinden. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
      11. Erhöhen Sie den Tau , bis alle Peaks entweder positiv oder auf Null gesetzt sind durch Wiederholen der Schritte 2.2.2.6-2.2.2.9. Um den T ₁ - Wert zu bestimmen, teilen Sie einfach den Tau - Wert , bei dem die Spitze mit LN2 auf Null gesetzt wird.
   3. T ₁ Messung durch die Nullmethode gemessen ¹⁶ für C ¹³
      1. Erstellen eines neuen Datensatzes für C ¹³ (siehe Schritt 2.1.9)
      2. Type „pulprog t1irpg“, um die Impulsfolge an das für Kohlenstoffkerne Inversion-Recovery-Experiment zu verändern.
      3. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans und die Anzahl von Datenpunkten: „SW 200“, „O1P 98“ "ns 8", "ds 2" und "td 64K".
      4. Type „p1 (Wert)“ und gibt die Werte für die Dauer 90 ° Impuls, wie durch die Impuls Kalibrierung bestimmt (siehe Schritt 2.2.1) und Typen „p2 (Wert)“ für das 180 ° -Impuls (der Zeitdauerwert ist 90 ° Impulsdauer mit zwei multipliziert).
      5. Stellen Sie die Recycling-Verzögerung auf einen sehr großen Wert, wie 100 s durch Eingabe von „d1 100“.
      6. Set Tau auf einen kurzen Wert, wie zum Beispiel 100 ms von „d7 100ms“ in der Befehlszeile eingeben.
      7. Stellen Sie den Fordeer Verstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
      8. Führen Sie ein Spektrum durch den Befehl „zg“ eingeben.
      9. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in der Befehlszeile eingeben.
      10. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Adjust Phase“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und Phase erster Ordnung (1) Korrektur.
          1. Während auf den Null-Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in negativer Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
      11. Erhöhen Sie den Tau , bis alle Peaks entweder positiv oder auf Null gesetzt sind durch Wiederholen der Schritte 2.2.3.6-2.2.3.9. Bestimmendie T & _sub1 ; -Wert, teilen einfach den Tau - Wert , wo die Spitze mit LN2 genullt wird.
3. Eindimensionale (1D) NMR Spectra
   1. ¹ H-NMR - Spektren
      1. Akquisition der NMR - Daten
         1. Geh zu dem ¹ H - Datensatz in Schritt erstellten 2.1.7 und verwenden die Standard „pulse-acquire“ Impulsfolge „zg“ von „pulprog zg“ in der Befehlszeile eingeben.
         2. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans, um die Anzahl von Datenpunkten, und die Impulsdauer für einen 90 ° -Impuls Winkel : "SW - 8", "O1P 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" und "p1 (wie durch Impuls Kalibrierung bestimmt)" (siehe Schritt 2.2.1).
            HINWEIS: 32K Datenpunkte können für das 500-MHz-Instrument verwendet werden.
         3. Stellen Sie einen Relaxationsverzögerung von 7 s für das 500 MHz-Instrument oder 9 s für das 850 MHz-Instrument mit "d1 7S" oder "d1 9s" ist, in der Befehlszeile eingeben.
         4. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
         5. Geben Sie „digmod baseopt“, um ein Spektrum mit einem verbesserten Ausgangswert zu erwerben.
         6. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie die Impuls-acquire Befehl „zg“ in der Befehlszeile.
      2. Verarbeitung der NMR - Daten
         1. Geben Sie „si 64K“ in der Befehlszeile Null-Füllung anzuwenden und die Größe des realen Spektrums auf 64 KB gesetzt.
         2. Stellen Sie den Zeilenparameter auf 0,3 Hz Verbreiterung von „0,3 lb“ in der Befehlszeile eingeben eine Gewichtungsfunktion (exponentieller Abfall) mit einem Linienverbreiterungsfaktor von 0,3 Hz vor der Fourier-Transformation anzuwenden.
         3. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in dem Befehl eingebenLinie.
         4. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und erster Ordnung (1) Phasenkorrektur .
            1. Während auf den Null-Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in positive Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
         5. Tragen Sie eine Polynom-Funktion vierter Ordnung für Basislinienkorrektur bei der Integration durch den Befehl „abs n“ eingeben.
            HINWEIS: Dies sorgt für eine flache spektrale Basislinie mit einer minimalen Intensität.
         6. Bericht chemische Verschiebungen in ppm von TMS (δ = 0). Klicken Sie auf die Kalibrierung ( "Calib. Ax"Symbol) und setzen Sie den Cursor mit der roten Linie auf der Oberseite des TMS-NMR-Signals (Peak am nächsten 0) gewonnen. Linksklick und geben Sie‚0‘.
      3. NMR Datenanalyse
         1. Integrieren Spektralbereich von δ 1,1 0,6 bis & delta; sowie die Peaks bei δ 4,98, δ 5,05 und δ 5,81 unter Verwendung des „Integrate“ -Symbol (unter dem „Process“ TAB) und die Beleuchtung ( „Define neue Region“) -Symbol. Linksklick und ziehen durch die Integrale.
            HINWEIS: Wenn es auf eine Region konzentrieren müssen, klicken Sie auf das Symbol markieren mit der Maus auf die Region vergrößern deaktivieren und klicken Sie links und ziehen. Zum Einstellen Taste, um die Schwellenintensität, verwenden Sie die mittlere Maus, wenn nötig. Klicken Sie auf das Highlight Symbol wieder die Integrationsfunktion zu aktivieren, dann zum nächsten Gipfel bewegen.
            1. Normalisieren die Summe der obigen Integrale bis 100 mit einem rechten Mausklick auf dem Integralwert, die angezeigt werdens unter dem Signal und wählen Sie „Normalisieren Summe von Integralen“. Geben Sie den Wert „100“ in das Feld ein und klicken Sie auf den „Return und Speichern“, um den Integrationsmodus zu verlassen.
         2. Wenn BHT als interner Standard verwendet wird , die Integration der Peaks bei δ 6,98 und stellen das Integral gleich den Millimol BHT pro 0,5 ml der Vorratslösung.
         3. Integrieren der Peaks von Interesse (siehe Schritt 2.3.1.3.1), die sich von 10 Hz von jeder Seite des Peaks, wenn möglich.
         4. Verfahren ¹³ C-NMR - Spektren Erfassung und Verarbeitung auf ähnliche Weise durchzuführen.
   2. ¹³ C-NMR - Spektren
      1. Akquisition der NMR - Daten
         1. Gehe zu der ¹³ C - Datensatz und verwenden , um die inverse gated entkoppelten Impulsfolge „zgig“ durch Eingabe von „pulprog zgig“ in die Befehlszeile.
            HINWEIS: Um ein Kohlenstoff-Experiment mit dem Standard-Breitband Decou läuftPLED-Pulssequenz, Typ „pulprog zgpg“ in die Befehlszeile.
         2. Die folgenden Befehle in der Befehlszeile, die spektrale Breite in ppm einzurichten, in der Mitte des HF-Senders, um die Anzahl der Abtastungen, die Anzahl der Dummy-Scans, um die Anzahl von Datenpunkten, und die Impulsdauer für einen 90 ° -Impuls Winkel : "SW-200", "O1P 95", "16 ns", "ds 2", "td 64K" und "p1" (wie durch Puls Kalibrierung bestimmt) (siehe Schritt 2.2.1.4).
         3. Stellen Sie einen Relaxationsverzögerung von 35 s für das 500-MHz-Instrument oder 45 s für das 850 MHz-Instrument mit "d1 35s" oder "45s d1", bzw. in der Befehlszeile eingeben. Wenn BHT verwendet wird, sollte Relaxationsverzögerung 50 s in dem 500 MHz-Gerät und 60 s in dem 850 MHz-Gerät.
         4. Stellen Sie die Empfängerverstärkung (RG) auf einen geeigneten Wert den Befehl „RGA“ für die automatische Berechnung von RG verwenden.
         5. Geben Sie „digmod baseopt“ in der Befehlszeile ein Spektrum zu erwerben with verbesserte Basislinie.
         6. Starten Sie die Aufnahme, indem Sie die Impuls-acquire Befehl „zg“ in der Befehlszeile.
      2. Verarbeitung der NMR - Daten
         1. Geben Sie „si 64K“ in der Befehlszeile Null-Füllung anzuwenden und die Größe des realen Spektrums auf 64 KB gesetzt.
         2. Stellen Sie den Zeilenparameter auf 1,0 Hz Verbreiterung durch „lb 1.0“ in der Befehlszeile eingeben eine Gewichtungsfunktion (exponentieller Abfall) mit einem Linienverbreiterungsfaktor von 1,0 Hz vor der Fourier-Transformation anzuwenden.
         3. Führen Sie Fourier-Transformation durch „EFP“ in der Befehlszeile eingeben.
         4. Führen Sie automatische Phasenkorrektur durch den Befehl „apk“ in der Befehlszeile eingeben. Wenn zusätzliche Phasen Anpassungen erforderlich sind, um weiter das Spektrum zu verbessern, klicken Sie auf den „Process Registerkarte“ dann klicken Sie auf die „Phase Adjust“ Symbol und die Phasenkorrektur Symbole für Ordnung Null (0) und Phase erster Ordnung (1) Korrektur .
            1. Während auf der nullten Ordnung und erster Ordnung Phasenkorrektur Symbole klicken, ziehen Sie die Maus, bis alle Signale in positive Absorptionsmodus sind. Übernehmen und die Phasenkorrekturwerte speichern, indem Sie den „Return und Speichern“ -Buttons des Phasenkorrekturmodus zu verlassen.
               HINWEIS: Für Kohlenstoffspektren auf Larmorfrequenz von 214 MHz (850 MHz-Gerät) die Korrektur der frequenzabhängigen Fehler (erster Ordnung) aufgezeichnet ist, kann schwierig und zeit für weniger erfahrene Anwender aufwendig sein wegen der großen Off-Resonanz-Effekte von der 90 ° Puls.
         5. Tragen Sie eine Polynom vierter Ordnung Funktion für Basislinienkorrektur bei der Integration durch den Befehl „abs n“ in der Befehlszeile eingeben.
         6. Bericht chemische Verschiebungen in ppm von TMS (δ = 0). Klicken Sie auf der Kalibrierung ( „Calib. Achse“) Symbol und setzen Sie den Cursor mit der roten Linie auf dem NMR-Signal zu referenzieren. Linksklick und geben Sie in „0“.
      3. NMR Datenanalyse
         1. Integrieren Sie die spektralen Bereich von δ 175 171 bis & dgr; mit der „Integration“ -Symbol (unter dem Register „Entwickeln“) und das Highlight ( „Define neue Region“) Symbol. Linksklick und ziehen durch die Integrale.
            HINWEIS: Wenn es auf eine Region konzentrieren müssen, klicken Sie auf das Symbol markieren mit der Maus auf die Region vergrößern deaktivieren und klicken Sie links und ziehen. Klicken Sie auf das Highlight Symbol wieder die Integrationsfunktion zu aktivieren, dann zum nächsten Gipfel bewegen.
            1. Stellen Sie das Integral auf 100 durch einen Rechtsklick auf den Integralwert zu tun, die unter dem Signal erscheint, und wählen Sie „Kalibrieren Current Integral“. Geben Sie den Wert „100“ in das Feld ein und klicken Sie auf den „Return und speichern“, um den Integrationsmodus zu verlassen.
         2. Wenn BHT als interner Standard verwendet wird , die Integration der Peaks bei δ 151,45 und stellen das Integral gleichdie Millimol BHT pro 0,5 ml der Stammlösung.
         3. Integrieren den Peaks von Interesse erstreckt 5 Hz von jeder Seite des Peaks (siehe Schritt 2.3.2.3.1).

Ergebnisse

¹ H und ¹³ C NMR - Spektren wurden für im Handel erhältlichen Fischtranergänzungen NMR unter Verwendung von zwei Instrumenten gesammelt; ein 850 MHz und einem 500 MHz-Spektrometer. Diese Spektren können zur quantitativen Bestimmung von Bestandteilen von Fischöl, wie Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA), als auch andere Verbindungen, wie n - 1 Acylketten und ernährungsphysiologisch wichtigen Index, wie die n verwendet werden ...

Diskussion

Technische Änderungen und Strategien zur Problemlösung

Spectral Qualität. Die Linienbreite des NMR-Signals und damit die Auflösung des NMR-Spektrums ist in hohem Maße abhängig von Shim, die ein Verfahren zur Optimierung der Homogenität des Magnetfeldes ist. Für die Routineanalyse ist 1D Shim ausreichend und eine 3D-Shim nicht erforderlich ist, da es durch NMR-Personal in regelmäßigen Abständen durchgeführt wird. Ist dies nicht der Fall ist, muss ein 3D - Shimming vo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avance III 850 NMR instrument	Bruker
Avance III 500 NMR instrument	Bruker
TCI 5mm probe	Bruker		Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5mm probe	Bruker		Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin	Bruker		NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5	Bruker
deuterated chloroform	Sigma-Aldrich	865-49-6	99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,	Sigma-Aldrich	128-37-0	purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes	New Era	NE-RG5-7	5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS	Bruker		Bruker Systems Management System; control system device