Grundlegende Methoden für die Untersuchung der Fortpflanzungsökologie von Fischen in Aquarien

Zusammenfassung

Eine Reihe von grundlegenden Methoden, um das Studium der Fortpflanzungsökologie von Fisch, die in Aquarien gehalten werden, zu ermöglichen, werden beschrieben. Dies sind nützliche Protokolle für das Sammeln von Fischen mit SCUBA, den Transport von lebenden Fischen und die Beobachtung des Fortpflanzungsverhaltens von wild gefangenen Fischen, die in Aquarien gehalten werden.

Zusammenfassung

Captive-Aufzucht-Beobachtungen sind wertvoll für die Aufdeckung von Aspekten des Fischverhaltens und der Ökologie, wenn kontinuierliche Felduntersuchungen unmöglich sind. Hier wird eine Reihe von Grundtechniken beschrieben, um Beobachtungen des Fortpflanzungsverhaltens eines wild gefangenen gobiiden Fisches als Modell in einem Aquarium zu ermöglichen. Die Methode konzentriert sich auf drei Schritte: Sammlung, Transport und Beobachtungen der Fortpflanzungsökologie eines Substrat-Spawers. Wesentliche Aspekte der lebenden Fischsammlung und -transport sind (1) Verhinderung der Verletzung der Fische und (2) sorgfältige Akklimatisierung des Aquariums. Vermeidung von Schäden durch Verletzungen wie Kratzer oder eine plötzliche Änderung des Wasserdrucks ist zwingend erforderlich, wenn man lebende Fische sammelt, da jeder physische Schaden das Überleben und das spätere Verhalten des Fisches negativ beeinflussen kann. Sorgfältige Akklimatisierung der Aquarien verringert den Inzidenztod und lindert den Schock des Transports. Beobachtungen während der Zwangsaufzucht umfassen (1) die Identifizierung von indiviDualfisch und (2) Überwachung von Eiern ohne negative Auswirkungen auf die Fische oder Eier, wodurch eine detaillierte Untersuchung der Reproduktionsökologie der Studienart ermöglicht wird. Die subkutane Injektion eines sichtbaren Implantat-Elastomers (VIE) ist eine präzise Methode für die anschließende Identifizierung einzelner Fische und kann mit einem breiten Größenbereich von Fischen verwendet werden, mit minimalem Einfluss auf ihr Überleben und Verhalten. Wenn die Studie Spezies ein Substrat-Spawner ist, der Klebstoff-Eier abscheidet, wird eine künstliche Nest-Stelle aus Polyvinylchlorid (PVC) Rohr mit dem Zusatz einer abnehmbaren wasserdichten Platte erleichtern Zählen und Überwachen der Eier, wodurch der Einfluss des Ermittlers auf die Nest-Holding Und Eierschutzverhalten der Fische Obwohl diese Grundmethode Techniken mit sich bringt, die in Forschungsartikeln selten erwähnt werden, sind sie für die Durchführung von Experimenten, die die gefangene Aufzucht eines Wildfisches erfordern, von grundlegender Bedeutung.

Einleitung

Spektakuläre adaptive Evolution zeigt sich in der Morphologie, Ökologie und Verhalten der Fische ¹ . Besonders die ökologischen Merkmale der Reproduktion sind besonders vielfältig, und die meisten davon können direkt von der individuellen Fitness beeinflusst werden ² . Um einen Einblick in selektiven Druck zu gewinnen, der zur Entwicklung von einzigartigen Merkmalen bei verschiedenen Fischarten geführt hat, ist die direkte Beobachtung von reproduktiven und sozialen Verhaltensweisen, die lebende Fische verwenden, oftmals von Vorteil, um theoretische Hypothesen zu begründen.

Allerdings können kontinuierliche Feldbeobachtungen von Fischen spezialisierte Unterwasserausrüstung und Einrichtungen, die schwer zu pflegen sind, erfordern. In diesen Fällen können Beobachtungen von wild gefangenen Aquarium-aufgezogenen Fischen hilfreich sein ^{3 , 4 , 5} . Darüber hinaus sind effiziente Beobachtungen von Fischverhalten, die sonst selten oder diffus sindUltra unter natürlichen Bedingungen zu beobachten, kann durch Manipulation von Experimenten in Aquarien ^{6 , 7 , 8 möglich werden} . Die Aufzucht von Fischen unter guten Bedingungen durch Minimierung von künstlichem Stress und körperlicher Schädigung ist entscheidend für genaue ökologische Untersuchungen.

Der pygmäische Goby Trimma marinae erreicht 23-25 ​​mm Gesamtlänge und verteilt sich im westlichen Pazifischen Ozean, wo er in ruhigen, geschützten Buchten in Tiefen von 9-26 m ^{9 gefunden wird} . In dieser Arbeit wird T. marinae als Modell verwendet, um eine Reihe von Grundtechniken für die Sammlung von Fischen mit dem in sich geschlossenen Unterwasseratemgerät (SCUBA), Fischtransport und eventuelle Akklimatisierung der Fische an Aquarien zur direkten Beobachtung zu beschreiben Der Studienart "Fortpflanzungsverhalten und Ökologie".

Protokoll

1. Sammeln und Transportieren von Live Fish

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt, wie man Fische, die eine Gasblase besitzen, von einer Tiefe von ≥15 m zur Oberfläche sammeln kann. Schnelle Beförderung an die Oberfläche wird die Ausdehnung der Gasblase durch einen Druckwechsel bewirken, der den Fisch ernsthaft schädigen oder töten kann. Vorsicht ist gerechtfertigt, da Schäden, die den Fischen während dieses ersten Schrittes verursacht werden, ihr Überleben und späteres Verhalten negativ beeinflussen werden.

1. Vor dem Tauchen mit SCUBA, sammeln Sie die folgenden Materialien: ein Hand-Netz geeignet für die Erfassung der gezielten Arten unter Wasser; Doppelte Polyethylen-Beutel, die groß genug für den Fisch sind; Gummibänder (ø 80 mm x 6 mm); Eine Sauerstoffzylinder zum Aufblasen der Sammelbeutel an der Oberfläche; Das Elbagin, das ein antimikrobielles Mittel ist, umfasst 10% Natriumnifurstyrenat; Eine Polystyrol-Schaumbox, in der die Sammelbeutel platziert werden können; Pipetten; Und ggf. (siehe Schritt 1.4) ein Seil mit einer LängeGleichbedeutend mit der maximalen Tauchtiefe sowie einem Gewicht von mindestens 2 kg.
2. Sammeln Sie die gezielten Fischarten mit einem Handnetz beim Tauchen; Während noch unter Wasser, platzieren Sie den gefangenen Fisch in einem Polyethylen-Beutel und binden Sie den Mund des Beutels mit einem Gummiband. Wenn es ≥1 Tage dauert, um den Fisch zu einem Aquarium zu transportieren, auch Wasser aus dem natürlichen Lebensraum in anderen Beuteln zu bewahren, um für die Erneuerung des Fischfangwassers verwendet zu werden.
   HINWEIS: Für die Sicherheit müssen die Unterwasseraufgaben von mindestens zwei Personen bearbeitet werden.
3. Oberfläche von der Sammelstelle mit den Beuteln von Fischen mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 1 m / min: bei einer Tiefe von 10 m oder mehr, aufhören für 1 - 5 min alle 2 m; Und von einer Tiefe von 10 m bis zur oberflächlichen Haltestelle für 1 - 5 min alle 1 m. Wenn die gefangenen Fische nicht in der Lage sind, ihren Auftrieb in der Tasche aufrechtzuerhalten ( dh wenn sie mit einer ausgedehnten Gasblase schwimmen, während sie immer noch versuchen, nach unten zu schwimmen), beibehalten sie dieselbe Tiefe für 1 - 5 min oder deAuf 1 - 2 m tiefer schauen. Sobald die Fische ihren Auftrieb wiederherstellen, den Aufstieg auf die Oberfläche wieder aufnehmen.
   HINWEIS: Wenn es eine Möglichkeit gibt, dass die Luft im SCUBA-Tank während des Aufstiegs ausläuft, befestigen Sie ein Seil an den Polyäthylenbeutel und befestigen Sie ein Gewicht von ≥2 kg; Nachdem der Unterwasser-Betreiber sicher aufgestiegen ist, ziehen Sie diesen an die Oberfläche mit den oben beschriebenen Geschwindigkeiten.
4. Am Strand oder Boot, lösen Sie 10 ppm Elbagin im Wasser jeder Polyethylen-Tasche nach dem Auftauchen.
   HINWEIS: Obwohl einige Fische nicht in der Lage sind, ihren Auftrieb aufrechtzuerhalten, kurz nachdem sie an die Oberfläche gebracht worden sind, können die meisten erwartet werden, sich innerhalb eines Tages zu erholen.
5. Wenn die Dichte von Fischen in einem Sammelbeutel hoch ist, teilen Sie den Fisch unter den mehr Beuteln, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig beschädigen, indem sie während des Transports gegeneinander reiben. Wenn der Fisch eine aggressive Art ist, teilen sie sie einzeln zwischen den Taschen.
6. Aufblasen Sie die Sammelbeutel mit Sauerstoff und versiegeln Sie den Mund der Tasche mit rUbberbands Beim Einführen des Sauerstoffs in den Beutel die Düse in das Wasser des Beutels senken, um den Gehalt an gelöstem Sauerstoff zu erhöhen; Die voll ausgedehnte Tasche sollte 1/4 voll mit Wasser sein.
7. Halten Sie die Sammelbeutel mit Fischen in einer Polystyrol-Schaumbox, um eine stabile Wassertemperatur zu erhalten und den Stress des Fisches unter dunklen Bedingungen zu verringern.
8. Wenn es ≥1 Tage dauert, um die Fische zu einem Aquarium zu transportieren, tauschen Sie einmal pro Tag 1/4 bis 1/3 des Wassers in jedem Fischbeutel aus, wobei Wasser aus dem Lebensraum, dem 10 ppm Elbagin hinzugefügt wurde, zurückgehalten wurde , Und verpacken jeweils mit Sauerstoff. Jeden Tag entfernen Sie tote Fische und Exkremente auf der Unterseite von Hand Netz oder Pipette.
   HINWEIS: Wenn der Flugzeugtransport beteiligt ist, warten Sie mindestens 1 Tag, um den Luftdruck auf die Oberfläche vor dem Transport zu beschränken, da zwei Stufen Druckänderung (von Unterwasser zu Oberfläche und Oberfläche zur Oberluft) kurzfristig negativ beeinflussen kann Das Überleben der Fische. I>

2. Akklimatisierung der Fische zu einem Aquarium

1. Schwimmen Sie die Tasche mit Fisch in einem Aquarium für 30 min, um die Wassertemperatur auszugleichen.
2. Über einen Zeitraum von 10 min wechselt das Beutelwasser inkrementell mit Aquarienwasser, um Schock durch einen plötzlichen Unterschied in der Wasserchemie ( zB pH-Wert, Salzgehalt) zu vermeiden.
   HINWEIS: Ein Fisch, der durch einen zu großen Unterschied in der Wasserchemie erschüttert wird, kann eine abnormale Veränderung der Körperfarbe und / oder des Verhaltens zeigen. Überwachen Sie diese sorgfältig während der Akklimatisierung.
3. 10 ppm Elbagin im Aquarienwasser auflösen.
4. Danach, einmal am Tag für 3 Tage, erneuern 1/3 des Aquarien-Wasser, mit 10 ppm Elbagin auf das Ersatzwasser.
5. Schließlich fängt an, die Elbagin zu beseitigen, indem ich die Hälfte des Aquariums Wasser einmal täglich tausche, bis die Farbe verblasst.

3. Injizieren eines sichtbaren Implantat-Elastomers (VIE), um einzelne Fische zu identifizieren

T> HINWEIS: In dieser Arbeit werden einzelne Fische mit VIE-Tags identifiziert, zum Beispiel beziehen sich auf Frederick ¹⁰ , Olsen und Vøllestad ¹¹ und Leblanc und Noakes ^12. Auch wenn die Studienart groß genug ist, um in der Hand zu halten , Ist der in Schritt 3.2 verwendete chirurgische Tisch nicht notwendig.

1. Bestimmen Sie die Einspritzposition und die Tag-Farbe für jede Person. Die sicherste Option ist, einen Einspritzpunkt im dicken muskulösen dorsalen oder kaudalen Teil des Körpers zu wählen und es zu vermeiden, ihn in den Bauch zu injizieren, wo innere Organe durchbohrt werden können.
   HINWEIS: Ein Numerierungssystem ist in Abbildung 1 beschrieben : Wenn die Untersuchungsart groß genug für die Injektion in 8 mögliche Positionen ist, wird dieses System die Identifizierung von 154 Individuen mit einer einzigen Farbe ermöglichen. Zehn Farben von VIE-Tags sind im Handel erhältlich. Wählen Sie die unterscheidbare Farbe, die auf der Körperfarbe des Fisches basiert.
2. Für Fische, die kleiner sind als in der Hand gehalten werden können, bereite eine chirurgische Tabelle wie folgt vor (siehe auch Kinkel et al . ¹³ ) ( Abbildung 2 ).
   1. Schneiden Sie einen weichen Schwamm ab, der 5 cm L x 5 cm W misst und der mindestens 5 - 10 mm niedriger ist als die Höhe einer Petrischale.
   2. Schneiden Sie eine Nut in den Schwamm von ca. 5 - 10 mm Tiefe, und passen Sie die Breite an die der ungefähre Körperbreite des Fisches an. Die Polyvinylchlorid (PVC) -Platte (0,3 mm Dicke) auf 5 cm L x 5 cm W schneiden und in eine Tal-Falte (oder M-Form) biegen.
   3. Setzen Sie die gerillte PVC-Platte auf den gerillten Schwamm und setzen Sie dann den Schwamm in die Petrischale (ø 160 mm, 30 mm Tiefe). Verwenden Sie Wasser aus dem Rückgewinnungstank, um die Petrischale zu füllen, bis die PVC-Platte ausreichend eingetaucht ist.
3. Bereiten Sie die VIE-Tags nach dem VIE-Tagging-Handbuch vor. Mischen Sie die Elastomermaterialien und fügen Sie die Mischung dem 3-ml-Syri hinzuNge mit 29-gauge-Nadel, wie im Kit enthalten.
4. Bereiten Sie zwei Wassertanks vor, um während der Durchführung der Tag-Injektionen zu verwenden: eine für die Anästhesie und eine für die Erholung; Stellen Sie die Temperatur und die Salzgehalt-Konzentration von diesen an das Wasser im Aufzucht-Aquarium an. Verwenden Sie eine Luftpumpe mit einem Luftstein, um das Wasser im Rücklaufbehälter leicht zu zirkulieren.
5. Vorbereitung einer Anästhesieflüssigkeit durch Mischen von 2-Methylchinolin mit einem gleichen Volumen von 99,5% Ethanol; Fügen Sie diese an den Anästhesie-Tank, um eine Konzentration von 18 ppm zu erreichen.
   HINWEIS: Die optimale Konzentration der Anästhesieflüssigkeit hängt von der Art und Körpergröße der Individuen ab. Prüfen Sie daher die optimale Konzentration für die Studienarten im Voraus.
6. Übertragen Sie einzelne Fische in den Anästhesie-Tank und lassen Sie sie betäubt werden: das heißt, warten, bis Fisch nicht reagiert auf Berührung oder Wasser Vibrationen, wenn die Außenseite des Tanks geklopft wird. Wie die Körperfarbe ändert, wenn es Anästhesi istZed in vielen Fischen, überwachen auch die Körperfarbe sorgfältig und beurteilen, ob Fisch von seinen Veränderungen anästhesiert wird. Weil es irgendeine Möglichkeit gibt, dass Fische aus dem Anästhesie-Tank springen können, halten Sie es mit einem transparenten Acryl-Brett bedeckt, zumindest bis die Fische beginnen, sich langsam zu bewegen.
   HINWEIS: Feinabstimmung der Zeit, die benötigt wird, um die Konzentration der Anästhesieflüssigkeit zu betäuben und / oder anzupassen, abhängig von der Studienart und ihrer Körpergröße. Wenn die Operculum-Bewegung jemals durch die Anästhesie gestoppt wird, wird der Fisch ein hohes Todesrisiko haben.
7. Wenn der Fisch schwächt, wenn ihr Körper erwärmt wird, halten Sie die Finger in dem kalten Wasser, während Sie den Fisch betäuben.
8. Heben Sie einen Fisch aus dem Anästhesie-Tank und schnell messen oder notieren Sie die notwendigen Daten (Gesamtlänge, Geschlecht, etc. ). Wenn sich ein Fisch während der Messung erholt, sofort den Rücken zum Anästhesiebehälter zurückführen.
9. Übertragen Sie den Fisch auf einen chirurgischen Tisch. Setzen Sie den Fisch ventral Seite nach unten in tEr PVC-Nut. Wenn die Körpergröße sehr klein ist, verwenden Sie ein binokulares Mikroskop, während Sie die Injektion machen. Wenn die Studie Spezies groß genug ist, um in einer Hand zu halten, injizieren Sie das VIE-Tag, während es gehalten wird.
10. Positioniere die abgeschrägte Seite der Nadel nach außen und zeigte auf den Kopf des Fisches. Setzen Sie die Nadel subkutan, mehr oder weniger parallel zum Körper, und so nah wie möglich unter der Haut. Passen Sie die Einstecktiefe in Abhängigkeit von der Größe des Fischkörpers und der Leichtigkeit an, um den Tag zu sehen.
11. Injizieren Sie das VIE-Etikett, während Sie die Nadel zurückziehen und die Einspritzung stoppen, bevor die Nadel-Fase den Nadeleintrittspunkt erreicht (dies ist leicht zu erkennen, wenn das Etikett in einem relativ großen Bereich injiziert wird).
12. Nach Beendigung der Tag-Injektion sofort den Fisch in den Rückgewinnungsbehälter überführen. Wenn die Erholung zu langsam erscheint, zirkulieren Sie das Wasser vorsichtig von Hand.
13. Nach der Erholung, die Fische an die Aufzucht Aquarium, und weiterhin 10 ppm El hinzufügenBagin zum Wasser für 3 Tage.
    HINWEIS: Bei niedrigviskosen Bedingungen für VIE-Tags erleichtert UVA-gefiltertes Licht die Erkennung der Tags.

4. Zählen der Demersal Adhesive Eggs

1. Um ein künstliches Laichnest zu schaffen, auf das der Fisch Klebeeier abgeben kann, schneide ein opakes PVC-Rohr (ø 5 cm, 6 cm lang) in der Hälfte, senkrecht zum Durchmesser.
   HINWEIS: Die oben genannte Rohrgröße eignet sich zum Laichen des relativ kleinen Goby T. marinae . So passen Sie die PVC-Rohrgröße und -form an, wie es für die Studienarten geeignet ist.
2. Drucken Sie ein 5 mm x 5 mm Raster auf eine wasserdichte Platte und schneiden Sie es aus, um den Innenbereich des PVC-Rohres zu passen.
3. Befestigen Sie die wasserdichte Folie an der Innenseite des PVC-Rohres mit einem Gummiband.
   HINWEIS: Wenn es für Frauen schwierig ist, Eier auf dem wasserdichten Blatt zu befestigen, und Eier fallen aus dem Blatt, machen das Blatt mit Sandpapier strukturiert.
4. Decke den Aquarienboden mit einer Sandschicht ab, 1- 2 cm dick Setzen Sie etwa ein Drittel des PVC-Rohres schräg in den Sand ein, mit der blattfixierten Seite nach unten.
5. Nach erfolgreichem Laichen durch den Fisch, entfernen Sie das Blatt mit der Eimasse aus dem PVC-Rohr und legen Sie es in eine Petrischale mit Aquarienwasser. Fix ein neues Blatt in der PVC-Rohr und legen Sie diese wieder auf den Boden des Aquariums. Schließlich zählen die Eier, indem sie die Eiermasse fotografieren.
   1. Alternativ, wenn nach dem Laichen Beobachtungen der elterlichen Eipflege durchgeführt werden müssen, achten Sie darauf, die Eier nicht aus dem Wasser zu bringen. Verwenden Sie stattdessen eine Petrischale, um die Eier und das Blatt zusammen mit Aquarienwasser zu schaufeln, die Eiermasse schnell zu fotografieren und dann das Blatt mit der Eimasse wieder in das gleiche PVC-Rohr zurückzukehren, bevor es alles wieder in seine ursprüngliche Position gebracht wird Unterseite des Aquariums. Schließlich zählen die Eier mit dem Bild.
6. Zähle die Eier mit ImageJ ( Abb. 3 ). Diese automatischen und manuellen Zellzählmethoden werden im Folgenden näher erläutert: Grundlegende Zellzählung (Die Universität von Chicago, Integrated Light Microscopy Core Facility, http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php); Partikelanalyse (http://imagej.net/Particle_Analyse); Zellzähler (https://imagej.net/Cell_Counter).
   1. Andernfalls, wenn Eier dicht abgeschieden werden, schätzen Sie die Anzahl der Eier durch die Berechnung der Fläche-Dichte-Verhältnis: zählen Eier in einem gedruckten 5 x 5 mm ² Raster, um die Ei-Dichte zu berechnen, messen Sie die Oberfläche, die mit Eiern von ImageJ bedeckt ist, Und schätzen die Gesamtzahl der Eier von der obigen Dichte pro Einheit und Fläche. Die oben genannte Oberflächenbereichsmessmethode von ImageJ wird im Folgenden erläutert: Set scale ... (Research Services Branch, https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html); Es erklärt, wie man die räumliche Skala des Bildes definiert; Verwenden von ImageJ zur Messung der Oberfläche (Keene State College, AcademicTechnologie, https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/).
      HINWEIS: Wenn Eier transparent sind, ist das schwarze wasserdichte Blatt für die automatische Zählmethode besser geeignet, da ImageJ den Umriß von Eiern individuell erkennen kann.

Ergebnisse

Nach den oben genannten Methoden wurden 41, 15 und 96 Personen von T. marinae im April 2014, 2015 und 2016, jeweils Offshore von Amami Oshima, Kagoshima-Präfektur, Japan ( Tabelle 1 ) gesammelt. In jedem Fall lebten 25 (61%), 14 (93%) und 91 (95%) Personen bis zur Hinterlegung von Eiern im Aquarium. Wie in Fukuda et al . ³ , nur ein Fisch starb vor dem Ende der Beobachtungsperiode im Jahr 2014, und Fisch Laichen sonst schien zu ...

Diskussion

Die Fortpflanzungsökologie zahlreicher Fische wurde oft durch experimentelle Aufzucht aufgedeckt. Vor allem, Geschlechtswechsel ^{6 , 8 , 14} , mate Wahl ^{15 , 16} und intraspezifische Konkurrenz ^{7 , 17} wurden häufig Themen der detaillierten Untersuchungen mit Aquarium gehaltenen Fisch. Darüber hinaus wurden einig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hand net	Nisso	AQ-17	Select for the target species size.
Polyethylene bag	San-U Fish Farm	8194
Rubber band	ESCO Co. LTD.	78-0420-64	ø 80 mm x 6 mm
Oxygen cylinder	N/A	N/A	Oxgen cylinder for diving equipment suits.
Elbagin	Japan Pet Design Co. Ltd.	75950	Pafurazine F (provided from same company) is equivalent drug to Elbagin.
Polystyrene foam box	N/A	N/A
Pipette	AS ONE	1-8625-04
Rope	Mizukami Kinzoku Co. LTD.	95301601
Weight	N/A	N/A	Weight for diving equipment suits.
Water tank	N/A	N/A
Air pump	KOTOBUKI	4972814 062115
Air stone	KOTOBUKI	4972814 232204
2-Methylquinoline	Wako	170-00376
Ethanol (99.5)	Wako	057-00456
Visible implant elastomer tag kit	Northwest Marine Technology	N/A	http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml
Soft sponge	N/A	N/A
PVC board	N/A	N/A	0.3 mm thickness is easy to use.
Petri dish	N/A	N/A	A large one, such as  ø 160 mm and 30 mm depth, is convenient for the injection of the VIE tag.
Transparent acrylic board	N/A	N/A
UVA filtered light	N/A	N/A
PVC pipe	N/A	N/A	ø 5 cm
Waterproof sheet	SOMAR Corp.	3EKW03	The film for the plain copier.
Sand	N/A	N/A
Stereo microscope	N/A	N/A
Camera	N/A	N/A