Métodos Básicos para o Estudo da Ecologia Reprodutiva do Peixe em Aquário

Resumo

Uma série de métodos básicos para permitir o estudo da ecologia reprodutiva de peixes mantidos em aquários são descritos. Estes são protocolos úteis para a coleta de peixe usando SCUBA, transporte de peixes vivos e observação do comportamento reprodutivo de peixes selvagens capturados em aquários.

Resumo

As observações criativas são valiosas para revelar aspectos do comportamento dos peixes e da ecologia quando as investigações de campo contínuas são impossíveis. Aqui, uma série de técnicas básicas são descritas para permitir observações do comportamento reprodutivo de um peixe gobiid capturado na selva, como modelo, mantido em um aquário. O método se concentra em três etapas: coleta, transporte e observações de ecologia reprodutiva de um reprodutor de substratos. Os aspectos essenciais da coleta e transporte de peixes vivos são (1) evitando lesões nos peixes e (2) aclimatação cuidadosa ao aquário. Evitar danos causados ​​por lesões, como arranhões ou uma mudança brusca de pressão da água, é imperativo ao coletar peixes vivos, pois qualquer dano físico provavelmente afetará negativamente a sobrevivência e o comportamento posterior do peixe. A aclimatação cuidadosa aos aquários diminui a incidência de morte e mitiga o choque do transporte. As observações durante a criação em cativeiro incluem (1) a identificação de indiviDuplo peixe e (2) monitoramento de ovos gerados sem efeitos negativos para o peixe ou os ovos, permitindo uma investigação detalhada da ecologia reprodutiva das espécies do estudo. A injeção subcutânea de uma etiqueta de elastômero de implante visível (VIE) é um método preciso para a identificação subseqüente de peixes individuais, e pode ser usado com uma grande variedade de peixes, com influência mínima em sua sobrevivência e comportamento. Se a espécie de estudo é um criador de substrato que deposita ovos adesivos, um local de nidificação artificial construído a partir de tubos de cloreto de polivinilo (PVC) com a adição de uma folha impermeável removível facilitará a contagem e monitoramento dos ovos, diminuindo a influência do investigador sobre a retenção do ninho E o comportamento de guarda dos ovos dos peixes. Embora este método básico implique técnicas que são raramente mencionadas em detalhes em artigos de pesquisa, são fundamentais para a realização de experimentos que exigem a criação em cativeiro de um peixe selvagem.

Introdução

A evolução adaptativa espetacular é evidente na morfologia, ecologia e comportamento dos peixes ¹ . Especialmente, as características ecológicas relacionadas à reprodução são especialmente diversas, e a maioria delas pode ser diretamente influenciada pela condição física individual ² . Para obter informações sobre as pressões seletivas que levaram à evolução de características únicas em diferentes espécies de peixes, a observação direta de comportamentos reprodutivos e sociais usando peixes vivos é muitas vezes benéfica para fundamentar hipóteses teóricas.

No entanto, as observações de campo contínuas de peixes podem exigir equipamento subaquático especializado e instalações difíceis de manter. Nestes casos, as observações de peixes criados pelo aquário capturados de forma selvagem podem ser úteis ^{3 , 4 , 5} . Além disso, observações eficientes de comportamentos de peixes que são raras ou difíceisO ult para observar sob condições naturais pode tornar-se possível através da manipulação de experimentos em aquários ^{6 , 7 , 8} . A criação de peixes em boas condições, minimizando o estresse artificial e o dano físico é fundamental para investigações ecológicas precisas.

O gafanhoto Trimma marinae atinge o comprimento total de 23-25 ​​mm e é distribuído no Oceano Pacífico ocidental, onde é encontrado em baías abrigadas e silenciosas, a profundidades de 9-26 m ⁹ . Neste trabalho, T. marinae é usado como modelo para descrever uma série de técnicas básicas para a coleta de peixe usando o aparelho de respiração subaquática autônomo (SCUBA), transporte de peixe e eventual aclimatação do peixe para aquários para observação direta Do comportamento reprodutivo e da ecologia das espécies de estudo.

Protocolo

1. Coletando e Transportando Peixe Vivo

NOTA: Este protocolo descreve como coletar peixes que possuem uma bexiga de gás, de uma profundidade ≥ 15 m para a superfície. O transporte rápido para a superfície induzirá a expansão da veia do gás por uma mudança de pressão, que pode prejudicar ou matar os peixes. O cuidado é garantido, pois os danos causados ​​aos peixes durante este primeiro passo afetarão negativamente a sua sobrevivência e comportamento posterior.

1. Antes de mergulhar com SCUBA, junte os seguintes materiais: uma rede manual apropriada para capturar a espécie alvo debaixo d'água; Sacos duplos de polietileno que são grandes o suficiente para o peixe; Bandas de borracha (ø 80 mm x 6 mm); Um cilindro de oxigênio para inflar os sacos de coleta na superfície; O Elbagin, que é um antimicrobiano, compreende 10% de nifurstrirenato de sódio; Uma caixa de espuma de poliestireno para colocar os sacos de recolha; Pipetas; E, se necessário (consulte o passo 1.4), uma corda com um comprimentoEquivalente a profundidade máxima de mergulho, bem como um peso de pelo menos 2 kg.
2. Recolher as espécies de peixes alvo com uma rede de mão enquanto mergulha; Enquanto ainda está subaquático, coloque o peixe capturado em uma bolsa de polietileno e prenda a boca do saco com uma fita de borracha. Se levará ≥ 1 dia para transportar o peixe para um aquário, também preservar a água do habitat natural em outros sacos, para ser usado para renovar a água que consome peixes.
   NOTA: Para segurança, as tarefas subaquáticas devem ser trabalhadas por pelo menos duas pessoas.
3. Superfície do ponto de coleta com os sacos de peixe a uma velocidade não superior a 1 m / min: a uma profundidade de 10 m ou mais, pare de subir de 1 a 5 minutos a cada 2 m; E de uma profundidade de 10 m para a superfície, para 1 a 5 min a cada 1 m. Quando o peixe capturado é incapaz de manter a sua flutuabilidade no saco ( ou seja , se eles flutuam com uma vasilha de gás expandida enquanto ainda tentam nadar em direção ao fundo), mantenha a mesma profundidade por 1 a 5 min ouScend para 1 - 2 m mais profundo. Uma vez que os peixes parecem recuperar sua flutuabilidade, retome a ascensão para a superfície.
   NOTA: Se houver a possibilidade de que o ar no tanque SCUBA se esgote enquanto suba, prenda uma corda no saco de polietileno e coloque um peso ≥ 2 kg; Depois que o operador subaquático subiu de forma segura, puxe isto para a superfície com as mesmas velocidades estipuladas acima.
4. Na praia ou no barco, dissolva 10 ppm de Elbagin na água de cada saco de polietileno após o revestimento.
   NOTA: Embora alguns peixes possam não conseguir manter sua flutuabilidade logo após serem trazidos para a superfície, a maioria pode esperar recuperar em um dia.
5. Se a densidade de peixe em uma bolsa de coleta for alta, divida o peixe entre mais sacos para evitar que eles se danifiquem se esfregando um contra o outro durante o transporte. Se o peixe é uma espécie agressiva, divida-os individualmente entre os sacos.
6. Inflar o saco de recolha com oxigénio e novamente selar a boca da bolsa utilizando rUbberbands. Ao introduzir o oxigênio no saco, abaixe o bico na água do saco para aumentar o teor de oxigênio dissolvido; O saco totalmente expandido deve ser 1/4 cheio com água.
7. Mantenha as bolsas de recolha com peixe em uma caixa de espuma de poliestireno, para manter uma temperatura estável da água e diminuir o estresse do peixe em condições escuras.
8. Se levará ≥ 1 dia para transportar o peixe para um aquário, uma vez por dia troque 1/4 a 1/3 da água em cada saco de manutenção de peixes, usando água retida do habitat ao qual foi adicionado 10 ppm Elbagin , E reembalar cada um com oxigênio. Todos os dias, retire os peixes mortos e as excretas no fundo pela rede manual ou pela pipeta.
   NOTA: Se o transporte de avião estiver envolvido, espere pelo menos 1 dia para acalmar peixes à pressão do ar na superfície antes do transporte, porque a mudança de pressão de dois passos (de subaquática para superfície e superfície para ar superior) no curto prazo pode afetar negativamente A sobrevivência do peixe. I>

2. Aclimatando o peixe a um aquário

1. Flutue a bolsa contendo peixes em um aquário por 30 minutos para igualar a temperatura da água.
2. Durante um período de 10 min, troque gradualmente a água do saco com água do aquário, para evitar o choque causado por uma diferença repentina na química da água ( por exemplo , pH, salinidade).
   NOTA: Um peixe que fica chocado com uma diferença muito grande na química da água pode exibir uma alteração anormal na cor e / ou no comportamento do corpo. Monitore isso com cuidado durante a aclimatação.
3. Dissolver 10 ppm de Elbagin na água do aquário.
4. Posteriormente, uma vez ao dia durante 3 dias, renovar 1/3 da água do aquário, tendo adicionado 10 ppm de Elbagin à água de reposição.
5. Finalmente, comece a eliminar o Elbagin trocando metade da água do aquário uma vez por dia, até que a cor fade.

3. Injetar uma etiqueta de elastômero de implante visível (VIE) para identificar peixes individuais

T "> NOTA: Neste trabalho, os peixes individuais são identificados usando etiquetas VIE, por exemplo, consulte Frederick ¹⁰ , Olsen e Vøllestad ¹¹ e Leblanc e Noakes ^12. Além disso, se a espécie do estudo for grande o suficiente para segurar uma mão , A tabela cirúrgica utilizada no passo 3.2 não será necessária.

1. Determine a posição da injeção e marque a cor para cada indivíduo. A opção mais segura é escolher um ponto de injeção na parte dorsal musculosa grossa ou caudal do corpo e evitar a injeção no abdômen onde os órgãos internos podem ser perfurados.
   NOTA: Um sistema de numeração é descrito na Figura 1 : se a espécie do estudo for suficientemente grande para injeção em 8 posições possíveis, este sistema permitirá a identificação de 154 indivíduos usando uma única cor. Dez cores das etiquetas VIE estão disponíveis comercialmente. Escolha a cor distinguível com base na cor do corpo dos peixes.
2. Para peixes que são menores do que podem ser mantidos na mão, prepare uma tabela cirúrgica da seguinte maneira (consulte também Kinkel et al ., ¹³ ) ( Figura 2 ).
   1. Corte uma esponja macia que mede 5 cm L x 5 cm W e que seja pelo menos 5-10 mm inferior à altura de uma placa de Petri.
   2. Corte uma ranhura na esponja de aproximadamente 5 a 10 mm de profundidade e ajuste sua largura à da largura corporal aproximada do peixe. Corte a placa de cloreto de polivinilo (PVC) (0,3 mm de espessura) até 5 cm L x 5 cm W e dobre-a em uma dobra do vale (ou em forma de M).
   3. Coloque a placa de PVC ranhurada em cima da esponja ranhurada e, em seguida, coloque a esponja na placa Petri (ø 160 mm, 30 mm de profundidade). Use água do tanque de recuperação para encher a placa de Petri até que a placa de PVC esteja suavemente imersa.
3. Prepare as etiquetas VIE de acordo com o manual de marcação VIE. Misture os materiais elastoméricos e adicione a mistura ao syri de 3 ml.Nge com agulha de calibre 29, conforme contida no kit.
4. Prepare dois tanques de água para usar enquanto executa as injeções de etiquetas: uma para anestesia e outra para recuperação; Ajuste a temperatura e a concentração de salinidade destes para combinar a água no aquário de criação. Use uma bomba de ar com uma pedra de ar para circular levemente a água no tanque de recuperação.
5. Prepare um líquido de anestesia misturando 2-metilquinolina com um volume igual de 99,5% de etanol; Adicione isso ao tanque de anestesia para atingir uma concentração de 18 ppm.
   NOTA: A concentração ideal do líquido de anestesia dependerá da espécie e do tamanho corporal dos indivíduos. Portanto, examine a concentração ideal para as espécies de estudo com antecedência.
6. Transfira peixes individuais para o tanque de anestesia e deixe-os anestesiar: é esperar que os peixes não reajam a tocar ou a aquecer as vibrações quando o tanque é pressionado. À medida que a cor do corpo muda quando é anesthetiZed em muitos peixes, também monitorar cuidadosamente a cor do corpo e avaliar se o peixe é anestesiado a partir de suas mudanças. Porque há alguma possibilidade de que os peixes possam saltar do tanque de anestesia, mantê-lo coberto usando uma placa acrílica transparente, pelo menos até o peixe começar a se mover devagar.
   NOTA: ajuste o tempo necessário para anestesiar e / ou ajustar a concentração de líquido de anestesia, dependendo das espécies do estudo e do seu tamanho corporal. Se o movimento do opérculo for interrompido pela anestesia, o peixe estará em alto risco de morte.
7. Como os peixes enfraquecerão se seu corpo estiver aquecido, mantenha os dedos na água relativamente fria enquanto anestesia o peixe.
8. Levante um peixe do tanque de anestesia e avalie-o rapidamente ou registre os dados necessários (comprimento total, sexo, etc. ). Se um peixe parece recuperar durante a medição, transfira-o imediatamente para o tanque de anestesia.
9. Transfira o peixe para uma mesa cirúrgica. Coloque o lado ventral do peixe para baixo em tO sulco do PVC. Se o tamanho do corpo é muito pequeno, use um microscópio binocular ao fazer a injeção. Se a espécie do estudo for grande o suficiente para segurar uma mão, injete a etiqueta VIE enquanto ela está sendo mantida.
10. Posicione o lado chanfrado da agulha para o exterior e apontado para a cabeça do peixe. Insira a agulha subcutaneamente, mais ou menos paralelamente ao corpo, e tão perto quanto possível da pele. Ajuste a profundidade de inserção dependendo do tamanho do corpo do peixe e da facilidade para finalmente ver a etiqueta.
11. Injete a etiqueta VIE enquanto retira a agulha e pare a injeção antes que o chanfro da agulha atinja o ponto de entrada da agulha (isso será fácil de discernir se injetar a etiqueta em uma área relativamente ampla).
12. Ao completar a injeção de etiquetas, transfira imediatamente o peixe para o tanque de recuperação. Se a recuperação parecer muito lenta, circule suavemente a água manualmente.
13. Após a recuperação, devolver o peixe ao aquário de criação e continuar a adicionar 10 ppm de ElBagin para a água por 3 dias.
    NOTA: Em condições de baixa visibilidade para etiquetas VIE, a luz filtrada UVA facilitará o reconhecimento das tags.

4. Contando os ovos adesivos Demersal

1. Para criar um ninho de criação artificial ao qual o peixe pode depositar ovos adesivos, corte um tubo de PVC opaco (ø 5 cm, 6 cm de comprimento) ao meio, perpendicular ao diâmetro.
   NOTA: O tamanho do tubo acima é adequado para gerar o T. smally pequeno relativamente pequeno. Assim, ajuste o tamanho do tubo de PVC e forme, conforme apropriado para as espécies do estudo.
2. Imprima uma grade de 5 mm x 5 mm em uma folha impermeável e corte-a para caber na área interna do tubo de PVC.
3. Corrija a chapa impermeável no interior do tubo de PVC usando uma fita de borracha.
   NOTA: Se é difícil para as fêmeas colocar ovos na folha impermeável, e os ovos caem da folha, faça a folha texturizada com lixa.
4. Cubra o fundo do aquário com uma camada de areia, 1- 2 cm de espessura. Insira aproximadamente um terço do tubo de PVC obliquamente na areia, com o lado fixo da folha para baixo.
5. Após o aparecimento do peixe, remova a folha com a massa de ovo do tubo de PVC e coloque-a em uma placa de Petri com água de aquário. Corrija uma nova folha dentro do tubo de PVC e coloque esta de volta no fundo do aquário. Finalmente, conte os ovos fotografando a massa de ovo.
   1. Alternativamente, se as observações do cuidado dos óleos parentais forem realizadas após a reprodução, tenha cuidado para não retirar os ovos da água. Em vez disso, use uma placa de Petri para colher os ovos e as folhas juntamente com a água do aquário, fotografar a massa de ovo rapidamente e, em seguida, reafirmar cuidadosamente a folha com a massa de ovo de volta para o mesmo tubo de PVC antes de retornar a sua posição original no Fundo do aquário. Finalmente, conte os ovos usando a imagem.
6. Conte os ovos usando ImageJ ( Figura 3 ). Estes métodos de contagem celular automática e manual são explicados detalhadamente no seguinte: Contagem celular básica (The University of Chicago, Integrated Core Microscopy Core Facility, http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php); Análise de partículas (http://imagej.net/Particle_Analysis); Contador de células (https://imagej.net/Cell_Counter).
   1. Caso contrário, se os ovos forem depositados densamente, avalie o número de ovos calculando a relação área-densidade: conte os ovos em uma grade impressa de 5 x 5 mm ² para calcular a densidade do ovo, mede a área de superfície coberta por ovos por ImageJ, E estimar o número total de ovos acima da densidade por unidade e área de superfície. O método de medição da área de superfície acima por ImageJ é explicado no seguinte: Definir escala ... (Branch de Serviços de Pesquisa, https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html); Explica como definir a escala espacial da imagem; Usando ImageJ para medir área de superfície (Keene State College, AcademicTecnologia, https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/).
      NOTA: Se os ovos são transparentes, a folha à prova de água preta é mais adequada para o método de contagem automática porque ImageJ pode reconhecer o contorno dos ovos individualmente.

Resultados

Seguindo os métodos acima, 41, 15 e 96 indivíduos de T. marinae foram coletados em abril de 2014, 2015 e 2016, respectivamente, no exterior de Amami Oshima, Prefeitura de Kagoshima, Japão ( Tabela 1 ). Em cada caso, viviam 25 (61%), 14 (93%) e 91 (95%) até depositar ovos em um aquário. Conforme relatado em Fukuda et al . ³ , apenas um peixe morreu antes do final do período de observação em 2014, e a criação de peixes, d...

Discussão

A ecologia reprodutiva de numerosos peixes foi frequentemente revelada através da criação experimental. Especialmente, mudança de sexo ^{6 , 8 , 14} , escolha do parceiro ^{15 , 16} e competição intraespecífica ^{7 , 17} foram tópicos freqüentes de investigações detalhadas usando peixes mantidos por aquário. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hand net	Nisso	AQ-17	Select for the target species size.
Polyethylene bag	San-U Fish Farm	8194
Rubber band	ESCO Co. LTD.	78-0420-64	ø 80 mm x 6 mm
Oxygen cylinder	N/A	N/A	Oxgen cylinder for diving equipment suits.
Elbagin	Japan Pet Design Co. Ltd.	75950	Pafurazine F (provided from same company) is equivalent drug to Elbagin.
Polystyrene foam box	N/A	N/A
Pipette	AS ONE	1-8625-04
Rope	Mizukami Kinzoku Co. LTD.	95301601
Weight	N/A	N/A	Weight for diving equipment suits.
Water tank	N/A	N/A
Air pump	KOTOBUKI	4972814 062115
Air stone	KOTOBUKI	4972814 232204
2-Methylquinoline	Wako	170-00376
Ethanol (99.5)	Wako	057-00456
Visible implant elastomer tag kit	Northwest Marine Technology	N/A	http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml
Soft sponge	N/A	N/A
PVC board	N/A	N/A	0.3 mm thickness is easy to use.
Petri dish	N/A	N/A	A large one, such as  ø 160 mm and 30 mm depth, is convenient for the injection of the VIE tag.
Transparent acrylic board	N/A	N/A
UVA filtered light	N/A	N/A
PVC pipe	N/A	N/A	ø 5 cm
Waterproof sheet	SOMAR Corp.	3EKW03	The film for the plain copier.
Sand	N/A	N/A
Stereo microscope	N/A	N/A
Camera	N/A	N/A