Aquaria에서 물고기의 생식 생태학 연구를위한 기본 방법

요약

수족관에 서식하는 물고기의 생식 생태학을 연구 할 수있는 일련의 기본 방법이 설명되어있다. 이들은 스쿠바 (SCUBA)를 사용하여 물고기를 수집하고 생선을 운송하며 수족관에 보관 된 야생 잡은 생선의 생식 행동을 관찰하는 데 유용한 프로토콜입니다.

초록

포획 사육 관측은 지속적인 현장 조사가 불가능할 때 어류 행동 및 생태계의 측면을 밝히는데 유용합니다. 여기에는 수족관에 보관 된 모델로 야생 잡힌 고비도 물고기의 생식 행동을 관찰 할 수있는 일련의 기본 기술이 설명되어 있습니다. 이 방법은 세 가지 단계에 초점을 둡니다 : 수집, 운송 및 기판 스폰역의 재생산 생태 관찰. 활어 수집 및 운송의 필수적인 측면은 (1) 물고기에 대한 상해 방지 및 (2) 수족관에 대한 신중한 순응입니다. 생선을 수집 할 때 스크래치 나 갑작스런 수압의 변화와 같은 상해를 통한 해를 방지하는 것은 신체적 손상이 생선의 생존과 나중에 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 필수적입니다. 주의 깊게 수조에 적응 시키면 발생 빈도가 감소하고 운송의 충격이 완화됩니다. 포로 기르기 동안의 관찰은 (1) indivi의 확인(2) 생선이나 난에 부정적인 영향을 미치지 않으면 서 산란 된 난을 관찰함으로써 연구 종의 생식 생태에 대한 상세한 조사를 가능하게한다. 눈에 보이는 임플란트 엘라스토머 (VIE) 태그의 피하 주사는 개별 물고기의 후속 식별을위한 정밀한 방법이며, 생존 및 행동에 최소한의 영향을주는 넓은 범위의 물고기와 함께 사용될 수 있습니다. 연구 종이 접착 알을 낳는 기질 스폰자 인 경우, PVC 방수 시트가 추가 된 PVC 튜브로 만든 인공 둥지 사이트는 알을 세고 모니터링하는 것을 용이하게하여 둥지 보유자에 대한 조사자의 영향을 줄입니다. 그리고 물고기의 난기 행동. 이 기본 방법은 연구 기사에서 자세하게 언급되지 않는 기술을 필요로하지만 야생 동물을 사육하는 실험이 필요합니다.

서문

환상적인 적응 진화는 물고기의 형태학, 생태학 및 행동에서 분명합니다 ¹ . 특히 생식과 관련된 생태 학적 특징은 다양하며 이들 대부분은 개인의 건강에 직접적으로 영향을받을 수있다 ² . 다른 물고기 종에서 독특한 특징의 진화를 가져온 선택적 압력에 대한 통찰력을 얻으려면 생선을 사용하는 생식 및 사회적 행동을 직접 관찰하는 것이 종종 이론적 가설을 입증하는 데 유리합니다.

그러나, 어류에 대한 지속적인 현장 관측은 전문화 된 수중 장비 및 유지가 어려운 시설이 필요할 수 있습니다. 이 경우 야생에서 잡은 수족관으로 자란 물고기의 관찰이 도움이 될 수 있습니다 ^{3 , 4 , 5} . 또한 희귀하거나 어색한 어류의 행동을 효과적으로 관찰 할 수 있습니다수족관 ^{6 , 7 , 8} 에서 실험을 조작하면 자연 상태에서 관찰 할 수 있습니다. 인공적인 스트레스와 물리적 손상을 최소화하여 좋은 조건에서 물고기를 양육하는 것은 정확한 생태 조사에 중요합니다.

피그미 문 절망 둑 Trimma marinae는 23-25mm 전체 길이에 도달 9-26m ^(9)의 깊이에, 그것은 조용하고 아늑한 베이에서 발견되는 서부 태평양에 배포됩니다. 이 연구에서 T. marinae 는 자체 수중 호흡 장치 (SCUBA), 어류 운송 및 직접 관측을위한 수족관에 대한 어류 순응을 사용하여 어류 수집을위한 일련의 기본 기술을 설명하는 모델로 사용됩니다 연구 종의 생식 행동 및 생태학에 대한

프로토콜

1. 살아있는 물고기 수집 및 운반

참고 :이 프로토콜은 깊이 15m 이상에서 지표면까지 가스 방광을 가진 물고기를 수집하는 방법을 설명합니다. 표면으로의 신속한 운반은 압력 변화에 의한 가스 방광의 팽창을 유발하여 심각하게 해를 입히거나 죽일 수 있습니다. 이 첫 번째 단계에서 생선이 피해를 입으면 생존과 나중에 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로주의가 필요합니다.

1. 스쿠버 다이빙을하기 전에 다음 자료를 수집하십시오. 수중 표적 종을 포획하기에 적합한 핸드 그물. 물고기를 위해 충분히 큰 두 배 폴리에틸렌 부대; 고무 밴드 (ø 80 mm x 6 mm); 상기 표면에서 상기 수집 백을 팽창시키기위한 산소 실린더; 항균제 인 Elbagin은 10 % sodium nifurstyrenate를 포함합니다. 수집 봉투를 넣을 폴리스티렌 폼 상자; 피펫; 그리고 필요하다면 (1.4 절 참조) 길이가있는 로프최대 잠수 깊이와 동등하며 최소 2kg의 중량이 필요합니다.
2. 다이빙하는 동안 손으로 그물을 사용하여 표적 어류를 수집합니다. 아직도 수중에있는 동안, 붙잡은 물고기를 폴리에틸렌 부대에서두고 고무 밴드로 부대의 입을 묶으십시오. 수족관으로 물고기를 옮기는 데 1 일 이상 걸리면 다른 수하물의 자연 서식지에서 물을 보존하여 물고기를 키우는 물을 새로 만드는데 사용하십시오.
   참고 : 안전을 위해 최소 두 사람이 수중 작업을해야합니다.
3. 1m / min 이하의 속도로 물고기의 부대와 함께 수집 지점에서 표면 : ​​10m 이상의 깊이에서, 2m마다 1 ~ 5 분 동안 오름차순 중지; 10 m의 깊이에서 1 m마다 1 - 5 분 ​​동안 표면 정지까지. 붙잡힌 물고기가 부대에서 부력을 유지할 수 없을 때 ( 즉 , 팽창 된 가스 방광으로 바닥을 향해 헤엄 쳐 가면서 떠 다니는 경우), 같은 깊이를 1 - 5 분 ​​또는 1 분 동안 유지하거나1 - 2 m 깊이로 이동하십시오. 일단 물고기가 그들의 부력을 회복하는 것처럼 보이면, 표면으로 상승을 재개하십시오.
   참고 : 스쿠버 탱크의 공기가 오름차순으로 떨어질 가능성이있는 경우, 로프를 폴리에틸렌 봉지에 고정시키고 무게가 2kg 이상인 것을 부착하십시오. 수중 운전자가 안전하게 승강 한 후에는 위에서 규정 한 속도와 동일한 속도로 표면에 당깁니다.
4. 해변이나 보트에서 10ppm Elbagin을 표면 처리 한 후 각 폴리에틸렌 봉지의 물에 녹입니다.
   참고 : 일부 물고기는 표면에 가져온 직후에 부력을 유지할 수 없지만 대부분은 하루 이내에 회복 될 것으로 예상됩니다.
5. 수집 가방에있는 어류의 밀도가 높으면 운송 중에 서로 마찰하여 서로를 손상시키지 않도록 더 많은 가방 사이에서 물고기를 나눕니다. 물고기가 공격적인 종인 경우 가방 사이에 개별적으로 나눕니다.
6. 산소로 수집 백을 팽창시키고 r을 사용하여 백의 입을 다시 봉인하십시오.ubberbands. 산소를 가방에 넣을 때 노즐을 가방의 물에 넣고 용존 산소량을 늘립니다. 완전히 팽창 된 봉지는 물을 1/4로 가득 채워야합니다.
7. 수증기를 안정적으로 유지하고 어두운 조건에서 어류의 스트레스를 줄이려면 폴리스티렌 폼 상자에 어류와 함께 수거 백을 보관하십시오.
8. 수족관으로 물고기를 옮기는 데 1 일 이상 걸릴 경우 하루에 한 번 서식지에서 보유한 물을 사용하여 각 어류 저장 백에서 물의 1/4에서 1/3을 교환하십시오. 10ppm Elbagin , 산소로 다시 포장하십시오. 매일, 죽은 생선과 배설물을 손 네트 또는 피펫으로 바닥에서 제거하십시오.
   참고 : 비행기 운송이 포함 된 경우 단기간에 두 단계의 압력 변화 (수중에서 표면으로, 표면에서 상부 공기로)가 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 적어도 1 일을 기다린 후에 물고기를 표면에 공기 압력으로 적응 시키십시오. 물고기의 생존. i>

2. 수족관에 물고기 적응시키기

1. 수온을 균일하게하기 위해 수족관에 물고기가 들어있는 가방을 30 분 동안 부어 두십시오.
2. 10 분 동안 물의 화학적 특성 ( 예 : pH, 염분)의 급격한 차이로 인한 충격을 피하기 위해 수족관 물과 증류수를 점차적으로 교환하십시오.
   참고 : 물 화학에서 너무 큰 차이로 인해 충격을받는 물고기는 신체 색 및 / 또는 행동에 비정상적인 변화를 나타낼 수 있습니다. 순응 중 조심스럽게 이것을 모니터하십시오.
3. 수족관 물에 10ppm Elbagin을 녹인다.
4. 그런 다음 하루에 한 번 3 일 동안 수족관 물의 1/3을 교체하고 Elbagin 10ppm을 보충 수에 첨가하십시오.
5. 마지막으로 수족관 물의 절반을 하루에 한 번씩 색이 바래 때까지 교환하여 엘바 긴을 제거하십시오.

3. 개개의 물고기를 식별하기위한 Visible Implant Elastomer (VIE) 태그 삽입

t "> 참고 :이 연구에서, 개별 물고기는 VIE 꼬리표를 사용하여 식별되며, 예를 들어, Frederick ¹⁰ , Olsen and Vøllestad ¹¹ 및 Leblanc and Noakes ^{12를 참조하십시오} . 단계 3.2에서 사용 된 외과 테이블은 필요하지 않습니다.

1. 각 개인의 사출 위치와 태그 색상을 결정하십시오. 가장 안전한 방법은 두꺼운 근육의 등쪽 또는 꼬리 부분의 주사 점을 선택하고 내부 장기가 뚫린 복부에 주사하는 것을 피하는 것입니다.
   참고 : 번호 매기기 시스템은 그림 1에 설명되어 있습니다. 검사 종족이 가능한 8 개의 위치에 주입하기에 충분히 큰 경우이 시스템은 단일 색상을 사용하여 154 명의 개인을 식별 할 수 있습니다. VIE 태그의 10 가지 색상은 상업적으로 이용 가능합니다. 물고기의 몸 색깔에 따라 구별 할 수있는 색을 선택하십시오.
2. <손에 잡을 수있는 것보다 작은 물고기는 다음과 같이 수술 테이블을 준비하십시오 (Kinkel et al . ^{13 참조} ) ( 그림 2 ).
   1. 페티 접시 높이보다 5 - 10mm 낮은 5cm L x 5cm W의 부드러운 스폰지를 잘라내십시오.
   2. 약 5 - 10mm 깊이의 스폰지에 홈을 자르고 물고기의 대략적인 몸 너비의 너비로 조정하십시오. 폴리 염화 비닐 (PVC) 보드 (0.3mm 두께)를 5cm L x 5cm W로 자르고 골짜기 접기 (또는 M 자 모양)로 구부립니다.
   3. 홈이있는 스폰지 위에 홈이있는 PVC 보드를 놓은 다음 스폰지를 페트리 접시 (ø 160 mm, 깊이 30 mm)에 넣으십시오. PVC 보드가 적절히 잠길 때까지 회수 탱크의 물을 사용하여 페트리 접시를 채 웁니다.
3. VIE 태깅 매뉴얼에 따라 VIE 태그를 준비하십시오. 엘라스토머 물질을 혼합하고 혼합물을 3 mL syri키트에 들어있는 29 게이지 바늘을 사용하십시오.
4. 태그 주입을 수행하는 동안 사용할 두 개의 물 탱크를 준비하십시오 : 하나는 마 취용이고 다른 하나는 회복 용입니다. 양육 수족관의 물과 일치하도록 이들의 온도와 염분 농도를 조정하십시오. 에어 스톤이 달린 에어 펌프를 사용하여 물을 가볍게 순환 시키십시오.
5. 99.5 % 에탄올 같은 양으로 2- 메틸 퀴놀린을 혼합하여 마취 액체를 준비하십시오. 이것을 마취 탱크에 넣고 농도가 18ppm이되도록하십시오.
   참고 : 마취 액체의 최적 농도는 개인의 종류와 신체 크기에 따라 다릅니다. 그러므로 미리 연구 종의 최적 농도를 조사하십시오.
6. 마늘 탱크로 개별 물고기를 옮기고 마취가되도록하십시오 : 즉, 탱크 외부가 두드려 졌을 때 물고기가 만졌을 때 반응하지 않거나 진동을받을 때까지 기다리십시오. 마취되면 몸 색깔이 변함에 따라많은 물고기에서 zed, 또한 몸 색깔을주의 깊게 감시하고 물고기가 그것의 변화에서 마취되는지 재판하십시오. 마취 탱크에서 물고기가 튀어 나오는 경우가 있으므로 물고기가 천천히 움직이기 시작할 때까지 투명한 아크릴 판으로 덮어 둡니다.
   참고 : 연구 종 및 체격에 따라 마취 액의 농도를 마취 및 / 또는 마취하는데 필요한 시간을 미세 조정하십시오. 마취에 의해 오구 수술이 중단되면 물고기는 사망 위험이 높습니다.
7. 몸이 따뜻해지면 물고기가 약 해지므로 물고기를 마취하면서 비교적 찬물에 손가락을 넣어 두십시오.
8. 마취 탱크에서 물고기를 들고 신속하게 측정하거나 필요한 데이터 (총 길이, 성별 등 )를 기록하십시오. 측정 중에 물고기가 회복되면 즉시 마취 탱크로 다시 옮깁니다.
9. 물고기를 외과 테이블로 옮긴다. 물고기 복부 측면을 아래로 설정하십시오.그는 PVC 그루브입니다. 몸의 크기가 매우 작 으면 주사를 만드는 동안 쌍안 현미경을 사용하십시오. 연구 종족이 손에 쥐기에 충분히 큰 경우, VIE 꼬리표를 잡고있는 상태에서 주사하십시오.
10. 바늘의 경 사진면을 바깥쪽으로 향하게하고 물고기의 머리쪽으로 향하게하십시오. 바늘을 피하에, 신체에 다소 평행하게, 가능한 한 피부 바로 아래에 삽입하십시오. 물고기의 몸 크기와 궁극적으로 태그를 볼 수있는 정도에 따라 삽입 깊이를 조정하십시오.
11. 바늘을 당기면서 VIE 태그를 삽입하고, 바늘 베벨이 바늘 진입 점에 도달하기 전에 주입을 중지하십시오 (상대적으로 넓은 영역에 태그를 삽입하는 경우 식별하기 쉽습니다).
12. 꼬리표 주사를 완료 할 때, 즉시 물고기를 회복 탱크로 옮기십시오. 회복이 너무 느리게 나타나는 경우 손으로 부드럽게 물을 순환 시키십시오.
13. 회복 후 물고기를 양육 수족관으로 되돌려 놓고 10ppm El을 계속 추가하십시오3 일 동안 물에 바진.
    참고 : VIE 태그에 대한 가시성이 낮은 조건에서 UVA로 필터링 된 빛은 태그 인식을 용이하게합니다.

4. Demersal Adhesive Eggs 계산하기

1. 물고기가 접착 알을 낳을 수있는 인공 산란 장소를 만들려면 불투명 한 PVC 파이프 (직경 5cm, 길이 6cm)를 지름에 반으로 반으로 자릅니다.
   참고 : 위의 파이프 크기는 비교적 작은 고비 T. marinae 산란에 적합합니다. 따라서 연구 종에 적합한 PVC 파이프 크기와 양식을 조정하십시오.
2. 방수 시트에 5mm x 5mm 격자를 인쇄하고 PVC 파이프의 안쪽 부분에 맞게 잘라냅니다.
3. 고무 밴드를 사용하여 방수 시트를 PVC 파이프 안쪽에 고정하십시오.
   참고 : 암컷이 방수 시트에 달걀을 부착하기 어렵고 알이 시트에서 떨어지면, 그 종이를 사포로 질감을 만드십시오.
4. 모래 층으로 수족관 바닥을 덮으십시오, 1- 2cm 두께. PVC 파이프의 약 1/3을 시트 고정면을 아래로하여 모래에 비스듬히 넣습니다.
5. 물고기에 의해 성공적으로 산란 후, PVC 파이프에서 계란 질량과 시트를 제거하고 수족관 물 페트리 접시에 넣으십시오. PVC 파이프 안쪽에 새 시트를 고치고 수족관 바닥에 다시 놓습니다. 마지막으로, 계란 질량을 촬영하여 계란을 계산합니다.
   1. 또는, 산란 후 부모의 알 돌기 관리를 관찰 할 경우 알을 물에서 꺼내지 않도록주의하십시오. 오히려 페트리 접시를 사용하여 계란과 수족관 물을 훑어 내고 신속하게 계란 덩어리를 찍은 다음 조심스럽게 달걀 덩어리로 시트를 다시 같은 PVC 파이프로 다시 채우기 전에 모든 것을 원래 위치로 되돌려 놓습니다. 수족관의 하단입니다. 마지막으로 그림을 사용하여 알을 계산합니다.
6. ImageJ를 사용하여 알을 계산하십시오 ( 그림 3 ). 이러한 자동 및 수동 셀 카운팅 방법은 다음과 같이 자세히 설명됩니다. 기본 셀 카운팅 (시카고 대학, Integrated Light Microscopy Core Facility, http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php); 입자 분석 (http://imagej.net/Particle_Analysis); 셀 카운터 (https://imagej.net/Cell_Counter).
   1. 그렇지 않으면, 계란이 조밀하게 퇴적 된 경우 면적 - 밀도 비율을 계산하여 난의 수를 계산하십시오 : 5 x 5 mm ² 격자로 인쇄 된 계란을 계산하여 난 밀도를 계산하고, ImageJ에 의해 계란으로 덮인 표면적을 측정하고, 단위 및 표면적 당 위의 밀도로부터 난의 총 수를 추정하십시오. ImageJ의 위의 표면적 측정 방법은 다음과 같이 설명됩니다. Set scale ... (Research Services Branch, https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html); 이미지의 공간 스케일을 정의하는 방법을 설명합니다. ImageJ를 사용하여 표면적 측정 (Keene State College, Academic)Technology, https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/).
      참고 : 계란이 투명하면 ImageJ가 계란의 윤곽을 개별적으로 인식 할 수 있기 때문에 검은 방수 시트가 자동 계산 방법에 더 적합합니다.

결과

위의 방법에 따라 T. marinae 의 41 마리 , 15 마리 및 96 마리의 개체 가 일본 카고시마 현 아마미 오시 마 앞바 다에서 2014 년 4 월, 2015 년과 2016 년에 각각 수집되었다 ( 표 1 ). 각각의 경우에 수족관에 알을 낳기 전까지 25 (61 %), 14 (93 %) 및 91 (95 %)의 개인이 살았습니다. Fukuda et al . ^{그림 3} 에서 볼 수 있듯이 2014 년 ?...

토론

수많은 물고기의 생식 생태계는 실험적 양육을 통해 종종 드러났습니다. 특히 성 변화 ^{6 , 8 , 14} , 배우자 선택 ^{15 , 16} 및 종내 경쟁 ^{7 , 17} 은 수족관에 보관 된 물고기를 사용하여 상세한 조사의 주제가되어 왔습니다. 게다가, 수족관에서 관?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hand net	Nisso	AQ-17	Select for the target species size.
Polyethylene bag	San-U Fish Farm	8194
Rubber band	ESCO Co. LTD.	78-0420-64	ø 80 mm x 6 mm
Oxygen cylinder	N/A	N/A	Oxgen cylinder for diving equipment suits.
Elbagin	Japan Pet Design Co. Ltd.	75950	Pafurazine F (provided from same company) is equivalent drug to Elbagin.
Polystyrene foam box	N/A	N/A
Pipette	AS ONE	1-8625-04
Rope	Mizukami Kinzoku Co. LTD.	95301601
Weight	N/A	N/A	Weight for diving equipment suits.
Water tank	N/A	N/A
Air pump	KOTOBUKI	4972814 062115
Air stone	KOTOBUKI	4972814 232204
2-Methylquinoline	Wako	170-00376
Ethanol (99.5)	Wako	057-00456
Visible implant elastomer tag kit	Northwest Marine Technology	N/A	http://www.nmt.us/products/vie/vie.shtml
Soft sponge	N/A	N/A
PVC board	N/A	N/A	0.3 mm thickness is easy to use.
Petri dish	N/A	N/A	A large one, such as  ø 160 mm and 30 mm depth, is convenient for the injection of the VIE tag.
Transparent acrylic board	N/A	N/A
UVA filtered light	N/A	N/A
PVC pipe	N/A	N/A	ø 5 cm
Waterproof sheet	SOMAR Corp.	3EKW03	The film for the plain copier.
Sand	N/A	N/A
Stereo microscope	N/A	N/A
Camera	N/A	N/A