Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Zusammenfassung

Wir drückten ectopically NR1 Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins in den menschlichen embryonalen Zellen (HEK293) als Antigen Autoantikörper gegen NMDA-Rezeptor im Blut von Patienten mit Verdacht mit autoimmune Enzephalitis zu erkennen. Diese einfache Methode möglicherweise zu screening-Zwecken in klinischen Umgebungen geeignet.

Zusammenfassung

Das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper kann dazu führen, dass verschiedene neuropsychiatrische Symptome bei den betroffenen Patienten, Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis bezeichnet. Nachweis von spezifischen Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor im Blut oder Liquor cerebrospinalis (CSF) ist wichtig für die genaue Diagnose dieser Erkrankung. Der NMDA-Rezeptor ist ein Ionen-Kanal Proteinkomplex, der vier Untereinheiten, einschließlich zwei obligatorische NMDA-Rezeptor Untereinheit 1 (NR1) und ein oder zwei NMDA-Rezeptor enthält Untereinheit 2A (NR2A), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2 b (NR2B), NMDA-Rezeptor-Untereinheit 2C (NR2C) oder NMDA-Rezeptor Untereinheit 2D (NR2D). Das Epitop des Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper wurde berichtet, dass in den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors anwesend sein. Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der als Screening-Test zum Nachweis von Autoantikörpern gegen NR1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors im Blut, die klinische und Forschung zu erleichtern verwendet werden kann Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis.

Einleitung

Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis ist eine neu erkannten Krankheit-Einheit, die bei Patienten aller Altersgruppen auftreten kann, und betrifft überwiegend weiblichen Patienten^1,2. Es ist eines der am häufigsten diagnostizierten Enzephalitis bei Patienten mit initial unbekannter Ätiologie der Enzephalitis³. Patienten, die mit Anti-NMDA-Rezeptor-Enzephalitis in der Regel haben prodromale Symptome von Kopfschmerzen oder Fieber, gefolgt durch die schnelle Entwicklung des Bewusstseins Ebene ändern und eine Vielzahl von akuten neuropsychiatrischen Symptome, wie Unruhe, Reizbarkeit , Angst, Schlaflosigkeit, Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Aggression, bizarre Verhaltensweisen, Bewegungsstörungen, autonome Dysregulation und Beschlagnahme Angriffe^4,5. Früherkennung von diesem Zustand und rechtzeitige Behandlung mit Immuntherapie sind wichtig für ein besseres Ergebnis und sogar vollständige Erholung der betroffenen Patienten⁶. Daher wird vorgeschlagen, dass Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis als eine wichtige Differentialdiagnose von Patienten mit akuten oder neue einsetzende psychotische Merkmale^7,8betrachtet werden sollte.

Neben der klinischen Merkmale ist die Detektion von Autoantikörper gegen den NMDA-Rezeptor in Blut oder Liquor wesentlich für die genaue Diagnose der Anti-NMDA-Rezeptor autoimmune Enzephalitis⁹. Die meisten der immunologischen Tests zur Erkennung von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper sind verfügbar in einigen Forschung Labors^10,11, und es gibt nur einen handelsüblichen zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay für das Screening der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper¹². Das Ziel dieser Studie ist es, einen einfachen Inhouse zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu entwickeln, der bequem im Labor verwendet werden kann, das Vorhandensein von Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper, die klinische Forschung von Anti-NMDA-Rezeptor zu erleichtern den Bildschirm autoimmune Enzephalitis. Der NMDA-Rezeptor ist ein Heterotetramer Ionen-Kanal Proteinkomplex speziell im Gehirn ausgedrückt. Es besteht aus zwei obligatorischen NR1 Untereinheiten und die Kombination von ein oder zwei Untereinheiten NR2A, NR2B, NR2C oder NR2D¹³. Eine frühere Studie berichtet, dass die wichtigsten Epitop gezielt durch die Antikörper an den extrazellulären N-terminale Domäne des NR1 Untereinheit⁵. Daher in diesem Protokoll wir zum Ausdruck bringen des menschlichen Proteins für rekombinanten NR1-Untereinheit der NMDA-Rezeptor mit dem Stichwort grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) in den menschlichen embryonalen Niere epithelialen Zell-Linie (HEK293), und entwickeln eine zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay zu erkennen der IgG-Klasse der Anti-NMDA-Rezeptor-Autoantikörper im Blut.

Protokoll

Die Studie wurde von der institutionellen Review Board der Chang Gung Memorial Hospital in Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3) genehmigt.

1. Vorbereitung des Plasmids NR1-GFP Expression

1. Mix 10 ng NR1-GFP Plasmids mit 100 µL Escherichia coli kompetente Zellen Stamm DH5α in eine sterile 1,5 mL Röhrchen pipettieren die Mischung sanft bis Zentrifugieren und ab 4 bis 6 Mal, und das Rohr auf dem Eis für 20 min inkubieren.
2. Inkubieren Sie das Rohr bei 42 ° C für 1 min in einem Wasserbad, nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad, fügen Sie 1 mL Lysogeny Brühe (LB) Medium in das Rohr und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Inkubator mit Schütteln für 1 h.
3. 50 µL der Mischung auf eine LB-Agar-Platte mit Ampicillin (0,1 mg/mL) zu verbreiten, und über Nacht die LB Nährbodenplatte bei 37 ° C in einem Inkubator inkubieren.
4. Wählen Sie eine einzige Kolonie von der Übernachtung LB-Agar-Platte mit einer sterilen Spitze, und schwenken Sie die Spitze in einer in einer Bakterienkultur Tube mit 5 mL LB-Medium und Ampicillin (0,1 mg/mL). Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C in einem Inkubator mit schütteln über Nacht.
5. Aliquoten 3 mL die Übernachtung Bakterienkultur in einem 500 mL-Flasche, die sterile 250 mL LB-Medium und Ampicillin (0,1 mg/mL) enthält. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C mit schütteln. Überprüfen Sie regelmäßig die optische Dichte (OD) der bakteriellen Kultur bei Wellenlänge von 600 nm mit einem Spektrometer, bis die OD600 0,6-1,0 erreicht.
   Hinweis: Mischen Sie gut 800 µL über Nacht Bakterienkultur mit 200 µL Glycerin zur Vorbereitung der Glycerin-Lager- und Glycerin Lager unter-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
6. NR1-GFP Expressionsplasmid aus der 250 mL Bakterienkultur vorbereiten
   1. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 15 min bei 4 ° C.
   2. Aufschwemmen der Bakterien Pellet in 10 mL Wiederfreisetzung Puffer mit RNase A; Vortex gründlich, bis keine Klumpen zu sehen ist.
   3. Die Bakteriensuspension 10 mL Lyse Puffer hinzu, sanft invertieren Sie die Mischung 4 - 6 Mal, und inkubieren Sie die lysate bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
   4. Die lysate 10 mL vorgekühlt Niederschlag Puffer hinzu, invertieren Sie sanft die Mischung 4 - 6 Mal.
   5. Gießen Sie die lysate in den Lauf der Filterpatrone mit der Kappe auf; warten Sie 10 min bei RT
   6. Entfernen Sie die Kappe von der Patrone Austrittsdüse, legen Sie einen Kolben in die Patrone und sanft drücken Sie den Kolben. Sammeln Sie die gefilterten lysate in ein 50 mL-Tube.
   7. Fügen Sie 2,5 mL proprietäre Puffer vom Hersteller, die gefilterte lysate hinzu, mischen Sie die Mischung durch das Rohr ca. 10 mal umdrehen und inkubieren Sie die Mischung für 30 min auf Eis.
   8. Wenden Sie die gefilterten lysate Mischung auf eine Filterspalte, die bereits mit 10 mL Gleichgewichtherstellung Puffer equilibriert war. Lassen Sie die Spalte durch die Schwerkraft ablaufen.
   9. Die Spalte mit 30 mL Waschpuffer zweimal waschen, dann DNA aus der Spalte mit 15 mL Elution Puffer eluieren.
   10. Der eluierten DNA-Puffer 10,5 mL (0,7 Bände) Isopropanol hinzufügen, gut mischen und die Mischung bei 20.000 x g für 30 min bei 4 ° c zentrifugiert
   11. Den Überstand vorsichtig abgießen, das DNA-Pellet mit 5 mL Endotoxin-freie 70 % Ethanol einmal waschen und 20.000 x g für 10 min zentrifugieren.
   12. Dekantieren Sie des Überstandes, trocknen Sie das Pellet 5-10 min in einer chemischen Kapuze und lösen Sie das Pellet in 300-500 µL Endotoxin-freie Puffer zu.
   13. Bestimmen Sie die Plasmid-Konzentration durch Messung der Absorption der Lösung bei UV-260/280 nm mit einem Spektralphotometer.
       Hinweis: Bereiten Sie das Expressionsplasmid GFP, die dasselbe Protokoll verwenden.

(2) Transfektion von HEK293 Zellen mit NR1-GFP Expressionsplasmid

1. Aliquoten 200 µL 2 % Gelatine-Lösung zu jedem gut einer Kultur 48-Well-Platte und die Platte bei 37 ° C für mindestens 30 min inkubieren.
2. Abzusaugen Sie die Gelatine-Lösung aus den gut und Samen 5 x 10⁴ HEK293 Zellen in 200 µL Zellkulturmedium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in jedem Bohrloch. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ über Nacht geliefert.
   Hinweis: Zellen gezählt mit einem Hemocytometer.
3. Am nächsten Tag, ersetzen die abgebrannte Kulturmedium mit 200 µL frisches Kulturmedium mit 10 % FBS pro Bohrloch.
4. Für jede einzelne gut, vorbereiten Lösung A durch das Mischen von 100 ng Plasmid NR1-tGFP mit 20 µL Kulturmedium und Lösung B durch das Mischen von 0,8 µL Transfection Reagens mit 20 µL Kulturmedium. Multiplizieren Sie die Anzahl der Bohrungen nötig, um das Gesamtvolumen für jedes Experiment vorzubereiten.
5. Durch Mischen von Lösung A und Lösung B Lösung C ansetzen, und die Mischung bei RT für 20-30 min inkubieren.
6. Aliquoten 40 µL Lösung C auch jeweils die HEK293 Zellen, die Platte vorsichtig schwenken und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ über Nacht geliefert.
7. Überprüfen Sie den Ausdruck des rekombinanten Proteins NR1-GFP in den Wirtszellen unter Fluoreszenz-Mikroskop mit 40 X-200 X Vergrößerung (Anregung/Emission: 482/502 nm), und fahren Sie mit der Zell-basierte Immunfluoreszenz-Assay.
   Hinweis: Transfizieren Sie Expressionsplasmid GFP in HEK293 Zellen mit dem gleichen Protokoll.

(3) Zell-basierte Immunfluoreszenz-Assay

1. Aspirieren der abgebrannten Mediums aus den Brunnen, dann waschen jedes gut mit 200 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) drei Mal.
2. Fügen Sie 200 µL 4 % Paraformaldehyd Lösung in jede Vertiefung; inkubieren Sie die Platte bei RT für 15 min.
3. Aspirieren Paraformaldehyd Lösung aus den Brunnen, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBS dreimal.
4. Fügen Sie 200 µL 10 % Magermilch in PBST (0,1 % Tween 20 in PBS) Lösung für jedes gut und inkubieren Sie die Platte bei RT für 1 h mit sanft schütteln.
5. Aspirieren Sie der 10 % Magermilch in PBST-Lösung aus dem Brunnen, dann einmal waschen Sie die Brunnen mit 200 µL PBST.
6. Inkubieren Sie die Brunnen mit verdünntem Plasma (1: 100 in PBST) als den primären Antikörper mit sanft schütteln bei RT für 1 h.
   Hinweis: Plasma ergibt sich aus dem Blut von Patienten mit Verdacht auf um autoimmune Enzephalitis zu haben.
7. Aspirieren verdünnte Plasma aus den Brunnen, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBST dreimal.
8. Fügen Sie 200 µL der Ziege Anti-Human, die IgG mit Alexa Fluor 594 (1:1, 000 Verdünnung in PBST) in jede Vertiefung konjugiert und inkubieren Sie die Kultur-Platte bei RT mit sanft schütteln für 1 h.
9. Aspirieren Sie die Ziege Anti-Human-IgG mit Alexa Fluor 594 Lösung konjugiert, und waschen Sie jeweils gut mit 200 µL PBST dreimal.
10. Jedes gut 100 µL Glycerin-Lösung (50 % Glycerin in PBS und 1: 100.000 von 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)) hinzufügen.
11. Beobachten und Bild die Zellen unter einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem 10-fach Okular, und 4 X, 10 X und 20 X Ziele.
    Hinweis: Verwenden Sie den richtigen Filter für jede Farbe: für NR1-GLP (Anregung/Emission = 482/502 nm), für Alexa Fluor 594 (Anregung/Emission = 561/594 nm), für DAPI (Anregung/Emission = 358/461 nm). Führen Sie die negative-Kontrolle mit der HEK Zellen GFP in gleicher Weise zum Ausdruck zu bringen.

Ergebnisse

Im Durchschnitt konnten wir 200-300 µg Endotoxin-freie Meinungsäußerung Plasmid NR1-GFP und GFP 250 mL Bakterienkultur, die wie folgt beschrieben in Abschnitt 1 des Protokolls erhalten. Ein Betrag von 100 ng/Well des Plasmids Ausdruck war für die Transfektion der HEK293 Zellen kultiviert in der 48-Well-Platte, wie beschrieben in Abschnitt 2 des Protokolls verwendet. 24-30 h nach Transfektion, die Zellen ausgedrückt NR1-GFP und rekombinante Proteinen GFP unter Fluoreszenz-Mikroskop na...

Diskussion

Es gibt mehrere zellbasierte immunologische Tests auf das Vorhandensein von Autoantikörpern gegen NMDA-Rezeptor beschrieben, darunter live zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay¹¹, zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay^{9 behoben} , und Flow Cytometry-basierte assay¹⁴. Der live zellbasierte Immunfluoreszenz-Test sollte durchgeführt werden, kurz nach der Herstellung der Zellen das NR1-Protein, ectopically auszudrücken, während Flow Cytometry basierende As...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit