Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

요약

우리는 ectopically NMDA 수용 체에 대 한 자가 면역 뇌염으로 의심 되는 환자의 혈액에서 검출 하는 항으로 인간 배아 세포 (HEK293)에서 녹색 형광 단백질 태그로 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위를 표현. 이 간단한 방법 임상 설정에서 심사 적합 있을 수 있습니다.

초록

안티-NMDA 수용 체 autoantibody의 존재 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 되 나 영향을 받는 환자에서 다양 한 정신병 증상을 일으킬 수 있습니다. 혈액 또는 뇌 척추 액체 (CSF)에 NMDA 수용 체에 대 한 특정 autoantibody의 검출은이 조건의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. NMDA 수용 체는 이온 채널 단백질 복잡 한 두 필수 NMDA 수용 체 소 단위 1 (NR1)와 하나 또는 두 개의 NMDA 수용 체를 포함 하 여 4 개의 소 단위를 포함 하는 소 단위 2A (NR2A), NMDA 수용 체 소 단위 2B (NR2B), NMDA 수용 체 소 단위 2 C (NR2C), 또는 NMDA 수용 체 소 단위 2D (NR2D). 안티-NMDA 수용 체 autoantibody epitope NMDA 수용 체의 NR1 소 단위의 extracellular N 맨끝 도메인에 있어야 보고 되었다. 이 연구의 목표는 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위에 대 한 신경의 임상 및 기초 연구를 촉진 하기 위하여 혈액에서 검출 하는 검사로 사용할 수 있는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염

서문

안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 새로 인식 된 질병 엔터티는 모든 연령대의 환자에서 발생할 수 있으며 주로 여성 환자^1,2에 영향을 미치는입니다. 그것은 가장 자주 진단된 뇌염 뇌염³의 초기 알 수 없는 병을 가진 환자 들 중 하나입니다. 일반적으로 안티-NMDA 수용 체 뇌염으로 영향을 받는 환자는 두통이 나 발열, 의식 수준의 변화 및 다양 한 동요, 과민성을 포함 한 급성 정신병 증상의 빠른 발전에 의해 다음의 prodromal 증상이 불안, 불면증, 환각, 망상, 침략, 기괴 한 행동, 운동 이상, 자율 dysregulation, 그리고 발작 공격^4,5. 이 조건과 immunotherapy 적시 치료의 초기 인식 더 나은 결과 영향을 받는 환자⁶전체 복구에 대 한 중요 하다. 따라서, 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염 환자 급성 또는 새로운 발병 정신병 특징^7,8제시의 중요 한 감 별 진단으로 고려 되어야 한다 건의 된다.

임상 기능 외 autoantibody CSF 또는 혈액에 NMDA 수용 체에 대 한의 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염⁹의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. 안티-NMDA 수용 체 autoantibody 감지 하 면역 테스트의 대부분은 몇 가지 연구 실험실^10,의¹¹, 사용할 수 거기 이며 심사에 대 한 단 하나의 상용 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경¹². 이 연구의 목표는 사용할 수 있는 편리 하 게 실험실에서 안티 NMDA 수용 체의 임상 연구를 촉진 하기 위하여 안티 NMDA 수용 체 신경의 존재를 화면에 간단한 사내 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 뇌염은 면역 NMDA 수용 체는 heterotetramer 이온 채널 단백질 복잡 한 두뇌에서 구체적으로 표현. 그것은 두 개의 필수 NR1 소 단위, 및 NR2A, NR2B, NR2C, 또는 NR2D¹³의 하나 또는 두 개의 소 단위 조합의 만들어진다. 이전 연구는 항 체에 의해 대상 주요 epitope NR1 소 단위⁵의 extracellular N 맨끝 도메인에는 보고. 따라서,이 프로토콜에 우리 인간 미 발달 신장 상피 세포 라인 (HEK293), 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 NMDA 수용 체의 인간 재조합 형 NR1 소 단위 단백질을 표현 하 고 개발 감지 하는 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경에 혈액의 IgG 클래스.

프로토콜

연구 기관 검토 위원회의 장 공 기념 병원 Linkuo, 타오 위 엔, 대만 (102-2577A3)에 의해 승인 되었다.

1. NR1 GFP 식 플라스 미드의 준비

1. 살 균 1.5 mL에 대장균 유능한 세포 변형 DH5α의 100 µ L로 NR1 GFP 플라스 미드의 믹스 10 ng까지 부드럽게 튜브를 피펫으로 혼합물을 원심 및 아래쪽 4-6 시간, 20 분 동안 얼음에 튜브를 품 어 고.
2. 물 욕조에 1 분 동안 42 ° C에 튜브를 품 어 물 탕에서 튜브를 제거, 튜브에 1 mL lysogeny 국물 (파운드) 매체를 추가 하 고 1 시간 동안 흔들어와 인큐베이터에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
3. 50 µ L 암 피 실린 (0.1 mg/mL)를 포함 하는 파운드 한 천 배지 위에 혼합물의 확산과 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 파운드 천 배지를 품 어.
4. 멸 균 팁을 사용 하 여 하룻밤 파운드 한 천 배지에서 단일 식민지를 선택 하 고에서 팁을 소용돌이 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL) 5 mL를 포함 하는 세균성 문화 관에서. 37 ° c 하룻밤 떨고와 인큐베이터에서 튜브를 품 어.
5. Aliquot 3 mL 250 mL 살 균 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL)에 포함 된 500 mL 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화. 떨고와 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 600의 파장에서 세균성 문화 광학 밀도 (OD)를 정기적으로 확인 nm는 OD600 0.6-1.0에 도달할 때까지 한 분석기를 사용 하 여.
   참고: 글리세롤 재고를 준비 하 여 글리세롤 재고 미래 사용을 위한-80 ° C이 하 저장 200 µ L 글리세롤과 잘 800 µ L의 하룻밤 세균성 문화를 혼합.
6. NR1 GFP 식 플라스 미드 250 mL 세균성 문화에서 준비
   1. 4 ° c.에 15 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집
   2. 10 mL 물의 resuspension 버퍼 RNase A;를 포함 하는 박테리아 펠 릿 resuspend 와 동 없는 덩어리를 볼 때까지 철저 하 게
   3. 세균 현 탁 액을 10ml 세포의 용 해 버퍼를 추가, 부드럽게 반전 혼합물, 4-6 시간 하 고 lysate 5 분 실 온 (RT)에서 품 어.
   4. 10 mL 미리 냉장된 강수량 버퍼는 lysate를 추가, 부드럽게 반전 혼합 4-6 시간.
   5. Lysate의 모자와 필터 카트리지를 통에 부 어 실시간에서 10 분 동안 대기
   6. 카트리지 출구 노즐에서 뚜껑을 제거, 카트리지에 플런저를 삽입 하 고 플런저를 조심 스럽게 누릅니다. 수집 하는 필터링 된 50 mL 튜브에 lysate.
   7. 2.5 mL 독점 버퍼 제조 업체에서 하는 필터링 된 lysate를 추가 하 고 약 10 배, 튜브를 거꾸로 하 여 혼합물을 섞어 30 분 동안 얼음에 혼합물을 품 어.
   8. 필터 열을 미리 equilibrated 10 mL 평형 버퍼 필터링된 lysate 혼합물을 적용 합니다. 중력에 의해 배수를 열을 수 있습니다.
   9. 30 mL 워시 버퍼 열 두 번 세척 후 15 mL 차입 버퍼를 사용 하 여 열에서 DNA을 elute.
   10. 10.5 mL (0.7 볼륨) 소 프로 파 놀 eluted DNA 버퍼에 추가, 잘, 그리고 20000 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 혼합물을 원심
   11. 신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다, 한 번, 5 mL도 무료 70% 에탄올과 DNA 펠 릿을 세척 하 고 10 분 20000 x g에서 원심.
   12. 상쾌한 가만히 따르다, 화학 후드, 5-10 분 동안 펠 릿 건조 하 고도 무료 버퍼의 300-500 µ L에 펠 릿을 녹.
   13. 분 광 광도 계를 사용 하 여 UV 260/280 nm에 해결책의 흡수를 측정 하 여 플라스 미드 농도 결정 합니다.
       참고: 식 플라스 미드 GFP 동일한 프로토콜을 사용 하 여 준비 합니다.

2. NR1 GFP 식 플라스 미드와 HEK293 세포의 transfection

1. 각각 2% 젤라틴 솔루션의 aliquot 200 µ L 48-잘 문화 판의 고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
2. 세포 배양 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 각 잘 포함 하의 200 µ L에 잘, 그리고 씨앗 5 x 10⁴ HEK293 세포에서 젤라틴 솔루션 발음 37 ° c 하룻밤 5% CO₂ 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 접시를 품 어.
   참고: 셀을 hemocytometer를 사용 하 여 계산 했다.
3. 다음 날, 바꿉니다 소비 문화 중간 10%를 포함 하는 신선한 문화 매체의 200 µ L FBS 잘 당.
4. 각 단일, 100를 혼합 하 여 솔루션 A를 준비 20 µ L 문화 매체, 및 0.8 µ L transfection 시 약 20 µ L 문화 매체와 혼합 하 여 솔루션 B NR1 tGFP 플라스 미드의 ng. 각 실험에 대 한 전체 볼륨을 준비 하는 데 필요한 우물의 수를 곱하면.
5. 솔루션 및 솔루션 B, 혼합 하 여 솔루션 C를 준비 하 고 20-30 분에 대 한 실시간에 혼합물을 품 어.
6. C 솔루션 필요 각 잘 포함 하는 HEK293 세포의 aliquot 40 µ L 플레이트를 부드럽게, 소용돌이 그리고 하룻밤 5% CO₂ 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어.
7. NR1 GFP 40 X-200 X 확대와 함께 형광 현미경 호스트 세포에서 재조합 형 단백질의 표정을 확인 (여기/방출: 482/502 nm), 세포 기반 면역 형광 분석을 진행 하 고.
   참고: 동일한 프로토콜을 사용 하 여 HEK293 세포로 식 플라스 미드 GFP Transfect.

3. 세포 기반 면역 형광 분석 결과

1. 우물에서 보낸된 중간 발음, 다음 세척의 인산 염 200 µ L 각 잘 버퍼링 염 분 (PBS) 3 번.
2. 각 잘;에 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L를 추가 15 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
3. 우물에서 paraformaldehyde 솔루션을 발음 하 고 각각 씻어 PBS의 200 µ L 세 번 잘.
4. PBST에 10% 탈지 우유의 200 µ L를 추가 (0.1 %PBS 트윈-20) 솔루션을 각각 잘 고 부드러운 진동으로 1 시간에 대 한 실시간에 접시를 품 어.
5. 잘에서 PBST 솔루션 10% 탈지 우유를 발음 다음 200 µ L PBST와 웰 스를 한 번 세척.
6. 1 시간에 대 한 실시간에 부드러운 동요와 1 차 항 체로 희석된 플라즈마 (PBST에 1: 100)와 웰 스를 품 어.
   참고: 플라즈마 면역 뇌염이 있기 위하여 의심 되는 환자의 혈액에서 얻은 것입니다.
7. 우물에서 희석된 플라즈마를 발음 하 고 각각을 씻어 PBST의 200 µ L 세 번 잘.
8. 염소 안티 인간 IgG 각 음에 알 렉 사 Fluor 594 (1:1, PBST에서 000 희석)와 활용의 200 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어와 RT에서 문화 접시를 품 어.
9. IgG 알 렉 사 Fluor 594 솔루션 활용 된 염소 항 인간의 발음 및 각 세척 PBST의 200 µ L 세 번 잘.
10. 각 잘을 100 µ L 글리세롤 솔루션 (PBS와 1:100,000의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)에 50% 글리세롤)를 추가 합니다.
11. 관찰 하 고 형광 현미경 접 안 렌즈, 그리고 4 배, 10 배, 20 X 목표 X 10을 사용 하 여 셀을 이미지.
    참고: 각 염료에 대 한 올바른 필터를 사용 하 여: NR1 GFP에 대 한 (여기/방출 = 482/502 nm), 알 렉 사 Fluor 594 대 한 (여기/방출 = 561/594 nm), DAPI에 대 한 (여기/방출 358/461 = nm). 같은 방식으로 표현 하는 GFP HEK 세포를 사용 하 여 부정적인 제어를 수행 합니다.

결과

평균적으로, 우리는 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 절차에 따라 250 mL 세균성 문화에서 200-300 µ g 내 무료 식 플라스 미드 NR1 GFP와 GFP를 얻을 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 48-잘 접시에 배양 HEK293 세포의 transfection는 양의 식 플라스 미드의 100 ng/잘 사용 되었다. transfection 후 24-30 h, 셀 표현 NR1 GFP 그리고 GFP 재조합 단백질 형광 현미경에서 검출 될 ?...

토론

라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과¹¹, 고정 세포 기반 면역 형광 분석 결과^{9 포함 하 여 문학에서 보고 된 NMDA 수용 체에 대 한 신경의 존재를 화면에 여러 세포 기반 면역 분석을 있다} , cytometry 기반 흐름 시험¹⁴및. 라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과 흐름 cytometry 기반 분석 결과 훈련 된 인력과 특수 장비를 요구 하면서 ectopically NR1 단백?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit