Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови

Резюме

Мы ectopically выразил NR1 Субблок NMDA-рецепторов, отмеченных Зеленый флуоресцирующий белок в человеческих эмбриональных клеток (HEK293) как антиген для выявления аутоантител против NMDA-рецепторов в крови пациентов с подозрением с аутоиммунным энцефалита. Этот простой метод могут быть пригодны для скрининга целей в клинических условиях.

Аннотация

Наличие Анти NMDA-рецептора аутоантител может вызвать различные Психоневрологическая симптомы в пострадавших пациентов, называется Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита. Выявление конкретных аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости (CSF) имеет важное значение для точной диагностики данного состояния. NMDA-рецепторов является ионный канал комплекс белков, который содержит четыре подразделения, включая два обязательных NMDA рецепторы Субблок 1 (NR1) и один или два NMDA-рецептора Субблок 2A (NR2A), NMDA рецепторы Субблок 2B (NR2B), NMDA рецепторы субъединица 2C (NR2C), или NMDA-рецептора Субблок 2D (NR2D). Эпитоп Анти NMDA-рецептора аутоантител было сообщено присутствовать на внеклеточные N-концевой домен NR1 субъединицы NMDA-рецептора. Цель этого исследования заключается в разработке простой на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может использоваться в качестве скрининг-тест для обнаружения аутоантител против NR1 Субблок NMDA-рецепторов в крови для облегчения клинических и базовые исследования Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалит.

Введение

Анти-NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита — недавно признанных болезни сущность, которая может возникнуть у пациентов всех возрастов и влияет на преимущественно женские пациенты^1,2. Это один из наиболее часто диагноз энцефалита среди пациентов с первоначальных неизвестной этиологии энцефалита³. Больных, пострадавших с Анти NMDA-рецептора энцефалита обычно имеют продромальный симптомы головной боли или лихорадки, а затем быстрое развитие изменения уровня сознания и множество острых нервно-психических симптомов, включая возбуждение, раздражительность , тревога, бессонница, галлюцинации, бред, агрессии, причудливых поведений, движение аномалии, вегетативной регуляции и захват нападения^4,5. Раннее распознавание этого состояния и своевременного лечения с иммунотерапия являются важными для лучший результат и даже полного восстановления в пострадавших пациентов⁶. Следовательно предполагается, что Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита следует считать важным дифференциальной диагностики пациентов с острой или новое наступление психотического функции^7,8.

Помимо клинических особенностей выявление аутоантител против NMDA-рецепторов в крови и спинномозговой жидкости имеет важное значение для точной диагностики Анти NMDA рецепторы аутоиммунных энцефалита⁹. Большинство из иммунологических тестов для обнаружения Анти NMDA рецепторных аутоантитела доступны в нескольких научно-исследовательских лабораториях^10,11, и есть только один assay коммерчески доступных на основе ячеек иммунофлюоресценции для скрининга Анти NMDA-рецептора аутоантител¹². Цель этого исследования заключается в разработке простой собственными силами на основе ячеек иммунофлюоресценции assay, который может быть удобно использовать в лаборатории для проверки наличия Анти NMDA рецепторы аутоантител для облегчения клинических исследований Анти NMDA-рецептора аутоиммунная энцефалит. NMDA-рецепторов — это heterotetramer ионный канал комплекс белков конкретно выражена в головном мозге. Он изготовлен из двух обязательных NR1 субблоков и сочетание одной или двух подразделений NR2A, NR2B, NR2C или NR2D¹³. Предыдущие исследования сообщили, что в внеклеточной N-концевой домен NR1 Субблок⁵основные epitope мишенью антитела. Следовательно в этом протоколе, мы выражаем человеческий рекомбинантный белок NR1-Субблок NMDA-рецептора, отмеченных Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в строке эпителиальных клеток человеческого эмбриона почек (HEK293) и разработать на основе ячеек иммунофлюоресценции проба для выявления класса IgG Анти NMDA рецепторы аутоантител в крови.

протокол

Это исследование было одобрено институциональных обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь в Linkuo, Таоюань, Тайвань (102-2577A3).

1. Подготовка NR1-GFP выражение плазмиды

1. Смесь 10 нг NR1-GFP плазмида с 100 мкл сведущие клетки штамма кишечной палочки DH5α в стерильных 1,5 мл центрифуга трубки, накапайте смесь осторожно вверх и вниз 4 - 6 раз и инкубировать трубку на льду за 20 мин.
2. Инкубировать трубки при 42 ° C за 1 мин на водяной бане, извлеките трубку из водяной бани, добавить 1 мл lysogeny бульон (LB) среднего в трубку и инкубировать трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания в течение 1 ч.
3. Распространения 50 мкл смесь на плиту LB агар, содержащий ампициллина (0,1 мг/мл) и инкубировать пластину агар фунтов при 37 ° C в инкубаторе одночасье.
4. Выбрать один колонии от ночи LB агар пластины с помощью стерильных кончика, и вихрем кончиком в в бактериальной культуры трубка, содержащая 5 мл LB средних и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте трубки при 37 ° C в инкубаторе с встряхивания на ночь.
5. Аликвота 3 мл ночи бактериальной культуры в 500 мл флакон, содержащий 250 мл стерильного LB среднего и ампициллин (0,1 мг/мл). Инкубируйте настой при 37 ° C при встряхивании. Регулярно проверяйте оптической плотности (OD) бактериальной культуры на длине волны 600 нм с помощью спектрометра, до тех пор, пока OD600 достигает 0,6-1,0.
   Примечание: Смешайте хорошо 800 мкл ночи бактериальной культуры с 200 мкл глицерин подготовить глицерин запас и хранить запас глицерина до-80 ° C для использования в будущем.
6. Подготовить NR1-GFP выражение плазмид бактериальной культуры 250 мл
   1. Собирать клетки центрифугированием при 6000 x g 15 мин при 4 ° C.
   2. Ресуспензируйте Пелле бактерий в 10 мл ресуспендирования буфер, содержащий РНКазы A; Вихрь тщательно до тех пор, пока не комок рассматривается.
   3. Добавить 10 мл буфера lysis бактерий подвеска, нежно инвертировать смесь 4 - 6 раз и инкубировать lysate при комнатной температуре (RT) за 5 мин.
   4. Добавить 10 мл предварительно охлажденные осадков буфера lysate, осторожно перевернуть смесь 4 - 6 раз.
   5. Залить lysate в ствол картриджа фильтра с крышкой; Подождите 10 минут на RT.
   6. Снимите колпачок с напорный патрубок картриджа, вставьте картридж поршень и осторожно нажмите на поршень. Собирать отфильтрованных lysate в 50 мл трубки.
   7. Добавить 2,5 мл несвободных буфер от производителя для отфильтрованных lysate, перемешать смесь, инвертирование трубки примерно в 10 раз и инкубировать смесь на льду за 30 мин.
   8. Применить отфильтрованные lysate смесь в столбец Фильтр, который был предварительно достижение равновесного уровня с 10 мл уравновешивания буфера. Разрешить столбце для слива самотеком.
   9. Промойте колонку с 30 мл буфера мыть дважды, а затем элюировать ДНК из столбца с помощью 15 мл Элюирующий буфер.
   10. Добавить 10,5 мл (0,7 томов) изопропанол eluted дна буфер, хорошо перемешать и центрифуги смеси на 20000 x г за 30 мин при 4 ° C.
   11. Осторожно декантируют супернатанта, раз помыть лепешка ДНК с 5 мл эндотоксинов бесплатно 70% этанол и центрифуги на 20000 x g за 10 мин.
   12. Декант супернатанта, сухие гранулы для 5-10 мин в химические вытяжки и растворяют гранулы в 300-500 мкл буфера эндотоксинов бесплатно.
   13. Определите концентрацию плазмиды путем измерения поглощения раствора УФ 260/280 Нм, используя спектрофотометр.
       Примечание: Подготовьте выражение плазмида GFP, используя тот же протокол.

2. transfection клеток HEK293 с NR1-GFP выражение плазмиды

1. Аликвота 200 мкл раствора желатина 2% каждому хорошо плиты 48-ну культуры и инкубировать пластины при 37 ° C по меньшей мере 30 мин.
2. Аспирационная раствор желатина из клеток 5 х 10⁴ HEK293 хорошо и семян в 200 мкл клеток питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) в каждом хорошо. Инкубируйте пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO₂ на ночь.
   Примечание: Клетки были подсчитаны с помощью Горяева.
3. На следующий день, заменить отработанного питательной среды с 200 мкл свежей питательной среды, содержащие 10% FBS в колодец.
4. Для каждого отдельного хорошо, подготовить раствор А, смешивая 100 нг NR1-tGFP плазмиду с 20 мкл питательной среды и B решение путем смешивания 0,8 мкл Реагента трансфекции с 20 мкл питательной среды. Умножьте количество скважин, необходимо подготовить общий объем для каждого эксперимента.
5. Готовят раствор C, смешивая A и B и инкубировать смеси на RT для 20-30 мин.
6. Аликвота 40 мкл раствора C для каждой хорошо содержащие клетки HEK293, вихревой мягко пластину и инкубировать пластины при 37 ° C в увлажненные инкубатора, поставляется с 5% CO₂ на ночь.
7. Проверьте в выражении NR1-GFP рекомбинантных белков в клетки хозяина под флуоресцентный микроскоп с увеличением 40 X-200 X (возбуждения/выбросов: 482/502 Нм) и провести пробу на основе ячеек иммунофлюоресценции.
   Примечание: Transfect плазмиды выражение гена GFP в HEK293 клетки, используя тот же протокол.

3. cell-based иммунофлюоресценции Assay

1. Аспирационная отработанного среднего из скважин, затем промыть каждой скважины с 200 мкл фосфата буфер солевой (PBS), три раза.
2. Добавить 200 мкл раствора параформальдегида 4% в каждой скважине; Инкубируйте пластину в РТ за 15 мин.
3. Аспирационная параформальдегида решение из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBS три раза.
4. Добавить 200 мкл 10% обезжиренного молока в PBST (0.1% Tween-20 в PBS) решение каждой хорошо и инкубировать пластину на RT 1 h с нежным встряхивания.
5. Аспирационная 10% обезжиренное молоко в PBST растворе из колодца, а затем промыть лунки с 200 мкл PBST раз.
6. Инкубируйте скважин с разбавленной плазмы (1: 100 в PBST) как основного антитела с нежным тряски в РТ за 1 ч.
   Примечание: Плазма получается из крови пациентов, предположительно имеют аутоиммунные энцефалита.
7. Аспирационная разбавленной плазмы из скважин и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
8. 200 мкл коза против человека, который IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 (1:1, 000 разрежения в PBST) для каждой скважины и инкубировать пластину культуры на RT с нежным встряхивания в течение 1 ч.
9. Аспирационная анти человека коза, IgG проспряганное с Alexa Fluor 594 решения и мыть каждый хорошо с 200 мкл PBST три раза.
10. Добавьте 100 мкл раствора глицерина (50% глицерина в PBS и картирование по 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) в каждой скважине.
11. Наблюдать и изображения клетки под микроскопом флуоресцентные, используя 10 X окуляр и 4 X и 10 X 20 X целей.
    Примечание: Используйте правильный фильтр для каждой краски: для NR1-ГФП (возбуждение/выбросов = 482/502 Нм), для Alexa Fluor 594 (возбуждения/выбросов = 561/594 Нм), для DAPI (возбуждения/выбросов = 358/461 Нм). Проводить отрицательный контроль с использованием клеток ГЭС, выражая GFP таким же образом.

Результаты

В среднем мы могли бы получить 200-300 мкг эндотоксина свободного выражения плазмида NR1-GFP и GFP от 250 мл бактериальной культуры после процедур, описанных в разделе 1 этого протокола. Количество 100 нг/колодец выражение плазмида была использована для transfection клетки HEK293, культив...

Обсуждение

Есть несколько на основе ячеек иммунологические анализы на экране наличие аутоантител против NMDA рецепторы, сообщили в литературе, включая живой на основе ячеек иммунофлюоресценции пробирного¹¹, фиксированный на основе ячеек иммунофлюоресценции Пробирная⁹ , и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit