Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Zusammenfassung

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Zusammenfassung

Die Bewertung der modernen Untereinheit Impfstoffe zeigt, dass die Generation von neutralisierenden Antikörpern wichtig, aber nicht ausreichend für die adjuvante Auswahl. Daher sind Hilfsstoffe mit humorale und zelluläre Immuno-stimulierende Funktionen, die in der Lage, zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) Antworten zu fördern sind dringend notwendig. So steht treu Überwachung der adjuvanten Kandidaten, die Kreuz-Grundierung zu induzieren und anschließend verbessern CTL-Generation einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung von Impfstoffen. Hier präsentieren wir einen Antrag auf eine Methode, die SIINFEKL-spezifische verwendet (OT-ich) T-Zellen, die Kreuz-Präsentation des Modells Antigen Ovalbumin (OVA) in Vivo in Anwesenheit von verschiedenen adjuvante Kandidaten zu überwachen. Diese Methode stellt ein Schnelltest Adjuvantien mit den besten Cross-Priming-Funktionen auswählen. Die Proliferation von CD8⁺ T Zellen ist die wertvollste Angabe des Kreuz-Grundierung und es gilt auch als Korrelat des Adjuvans-induzierte Kreuz-Präsentation. Diese Funktion kann in verschiedenen immun Organen wie Lymphknoten und Milz ausgewertet werden. Das Ausmaß der CTL-Generation auch überwacht werden kann, wodurch es Erkenntnisse über die Natur eines einheimischen (Lymphknoten vor allem entleeren) oder eine systemische Reaktion (entfernte Lymphknoten und/oder Milz). Diese Technik weiter erlaubt mehrere Modifikationen zum Testen Medikamente, die können hemmen bestimmte Wege Kreuz-Präsentation und bietet auch die Möglichkeit in verschiedene Stämme von konventionellen und gentechnisch veränderten Mäusen verwendet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen wird die Anwendung, die wir hier präsentieren nützlich für Impfstoff-Labors in Industrie oder Wissenschaft sein, entwickeln oder ändern chemischen Hilfsstoffe für Impfstoff-Forschung und Entwicklung.

Einleitung

Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) induzieren Impfstoffe sind wichtige therapeutische Interventionen, die entwickelt wurden, um bestimmte Arten von Krebs¹zu kämpfen. CTL sind auch wichtig für prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger². Darüber hinaus CTL sind eine der wenigen immun Abwehrmechanismen in Gefahr Bevölkerungen wie Neugeborene^3,4 wen auch abhängig von CTL gegen frühen Lebens Infektionen⁵funktionell aktiv. In diesem Zusammenhang führte Impfstoffe gegen Respiratory Syncytial Virus (RSV), die mit Adjuvans entwickelt wurden, die nicht CTL-Antworten (Alaun) entlocken wird ein Totalausfall des Impfstoffes führt zu schwerwiegenden Komplikationen bei Infektionen bei Säuglingen⁶. Diese negativen Auswirkungen der Impfung können rückgängig gemacht werden, indem eine CD8⁺ T-Zell Antwort⁷. Wir haben bereits gezeigt, dass die wichtigsten Zytokine (Typ-I-Interferone) hervorgerufen durch einige Stimulator der Interferon-Genen (STING)-Agonisten unerlässlich für die CTL-Antworten generiert durch diese Adjuvantien⁸, teilweise sind durch die Messung der Verbreitung von OT-I T-Zellen nach Impfung und anhand dieser Ergebnisse als ein Maß für die CTL induzierende Fähigkeiten beobachtet Impfung Zeitpläne⁹erweitert. Die Messung der Verbreitung von OT-ich CD8⁺ T-Zellen in einem Wild-Typ (WT) C57BL/6 Empfänger Maus durch Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Farbstoff Verdünnung ist eine robuste Einschätzung der Fähigkeit des Adjuvans eines Impfstoffs zu generieren Kreuz-Grundierung von SIINFEKL, (die Immuno-dominante Peptid von Ovalbumin, Eizellen). Variationen dieser Technik sind weit verbreitet für die Beurteilung der Verbreitung von OT-ich CD8⁺ und OT-II CD4⁺ T Zellen. Zum Beispiel hat es in Abwesenheit des ausgewählten Zytokine (KO-Mäusen) oder impfstoffwirksamkeit nach Antigen-Rückruf bei WT Tieren Messen eingesetzt. Wir entwickelten ein kurzes Protokoll (4 Tage-Experiment) in dem nach Passive Übertragung der CFSE--gefärbten OT-ich CD8⁺ T-Zellen, eine subkutane (s.c.)-Immunisierung, bestehend aus einer Dosis von 50 µg von Endotoxin-freie OVA ergänzt mit Test Adjuvantien verabreicht (Abbildung 1). Die Follow-up der Ergebnisse 48 h nach der Impfung bietet zuverlässigen Beweis für die Fähigkeit des Adjuvans, CTL-Antworten zu generieren. Mit dieser Strategie ist es möglich, die Wirksamkeit der lokalen Immunantwort in die drainierenden Lymphknoten nach Immunisierung sowie das Ausmaß der Reaktion zu bewerten, durch Messung der CTL-Aktivität in der Milz (oder entfernte Lymphknoten).

Protokoll

Alle Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden aus dem C57BL/6-Hintergrund. Alle Tiere wurden unter Pathogen-freies Bedingungen gehalten. Alle Experimente wurden nach den normativen das deutsche Tierschutzgesetz (TierSchG BGBl. durchgeführt. ICH S 1105; 25.05.1998) und des unteren Sachsen-Ausschusses für die Ethik von Tierversuchen und das Landesamt (untere Sachsen Stand für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit), unter der Genehmigung Nr. 33,4-42502-04-13/1281 und 162280 angenommen wurden.

1. CFSE-Färbung des OT-I T-Zellen und Adoptiv-Transfer

Hinweis: OT-ich Mäuse sind Transgen generierten Tiere, die einen T-Zell-Rezeptor (TCR) Ausdrücken mit festen α und β-Ketten, die zusammen die Immuno-Dominant-Peptid der OVA, erkennen SIINFEKL^10,11. Infolgedessen haben diese Mäuse eine deutlich hohe Anzahl von SIINFEKL-spezifische CD8⁺ T-Zellen (97 %)¹² im Vergleich zu normalen oder OVA geimpften Mäuse (≤ 1 %)¹³.

1. Isolierung von nachvollziehbar CD8⁺ T-Zellen von OT-ich Mäuse mit dem Ausdruck T-Lymphozyten-spezifischen Thy1^ein (Thy1.1) Allel:
   1. Einschläfern 6-9 Wochen alten OT-ich Mäuse durch CO₂ Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation¹⁴. Die Milz und große Lymphknoten (leisten-, axillären und zervikalen Paare nur) indem die Haut mit chirurgische Scheren, ablösen der Haut aus dem Körper mit Hilfe von chirurgischen Zangen und Pinzetten zu sezieren und legen Sie sie in Petrischalen (60 x 15 mm) jeweils ein 100 µm Pore Netz Tasse Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung.
   2. Pflegen Sie Petrischalen (jeweils mit einem Mesh-Cup) in 3-5 mL des kompletten RPMI Medium (RPMI 1640, 10 % V/V FCS, 100 U/mL Penicillin, Streptomycin 50 µg/mL) auf Eis gehalten.
   3. Pürieren Sie die Organe mit Hilfe von einem Spritzenkolben oder ein ähnliches steriles Instrument (vorherige schneiden ist nicht erforderlich) und sammeln Sie die entstandene Suspension Einzelzelle in 15 mL Zentrifuge Röhren.
   4. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugation und lyse der Erythrozyten aus der Milz wieder aussetzen das Pellet in 1 mL/Milz Ammoniumchlorid Puffers (ACK-Puffer, im Handel erhältlich). Brüten Sie die Zellen für 1,5 min auf Eis, und waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 mL kaltem PBS durch Zentrifugieren (wie zuvor).
   5. Wieder aussetzen Sie das Pellet in das gleiche Rohr in 1 mL PBS (pH 7,2) mit 5 % fötalen Rinderserum für magnetische Isolierung.
2. Um magnetische Isolierung durchzuführen, gehen Sie zu der negativen Auslese der CD8⁺ T-Zellen durch die Verwendung eines magnetischen isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers oder Protokolle¹⁵veröffentlicht.
3. Zur Durchführung CFSE-Färbung, zuerst die Anzahl der CD8⁺ T Zellen gewonnenen OT-ich Mäuse mit einem automatisierten Zelle Zähler (Partikelzähler). Fleck 1-5 x 10⁷ Zellen/mL in ein Volumen von 1-5 mL mit 5 µM CFSE mit PBS-Puffer für 7 min bei 37 ° C, lichtgeschützt in einem 15 ml Falcon-Röhrchen.
4. Stillen Sie die CFSE-Färbung der Zellen das gleiche Volumen (1:1) des fötalen Rinderserum hinzufügen zu, und inkubieren sie zusätzliche 7 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL PBS zweimal.
5. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zelle Zähler. Festlegen der Zellzahl auf 3-5 x 10⁷ Zellen/mL PBS um 3-5 x 10⁶ Zellen/Maus in 100 µL intravenös zu injizieren (i.v.) über die Rute Vene.
6. Zum Heck Vene Injektionen durchführen zu immobilisieren die Mäuse in entsprechenden wachstumsbefürworter. Wärmen Sie den Rückenbereich und Tail der Mäuse injiziert werden, mithilfe einer Rotlicht-Lampe, zwischen 20 bis 25 cm entfernt von den Mäusen für 1-3 min zum Heck Vene Vasodilatation zu ermöglichen.
   Hinweis: Dadurch Leichtigkeit Vene Erkennung und Verwaltung der Zellsuspension.
7. (Mit der Hand zwischen die Mäuse und die Lampe platziert) sicherzustellen, dass es nicht zu heiß für die Mäuse und wenn die Rute Venen deutlich sichtbar sind, fahren Sie mit der Injektion. Injizieren Sie die Zellen in der seitlichen oder dorsalen Schweif Ader mit einer 1mL Spritze mit einem 25-Gauge-Nadel¹⁶.

2. Immunisierung (Endo-freie OVA +/-adjuvante)

1. Legen Sie die Mäuse transplantiert mit OT-ich Zellen (Schritt 1.7, Abbildung 1) in einer Narkose-Kammer und Isofluran in Sauerstoff durch eine Anästhesie Maschine¹⁴zu verwalten.
2. Wenn die Maus völlig eingeschlafen unter Narkose ist, nehmen Sie es aus der Kammer und rasieren Sie das Fell der Maus auf den Bereich über den Gluteus Superficialis (seitlichen unteren Rücken) mithilfe einer elektrischen Haar Beschneidemaschine, um eine saubere Injektion durchführen mit einen guten Blick auf das Einsatzgebiet.
3. 50 µL des Impfstoffes, s.c. in den rasierten Bereich mit einer 25-Gauge-Nadel zu injizieren.

3. Isolation von Lymphozyten und Färbung für Flow Cytometry Analysis

1. Isolierung von Lymphozyten und splenocyten
   1. Einschläfern Sie die geimpften Mäuse durch CO₂ Einatmen, gefolgt von zervikale Dislokation.
   2. Extrahieren Sie der Entwässerung und entfernten Lymphknoten und der Milz und legen Sie sie in separaten Petrischalen mit 100 µm Pore Netz Tassen Gewebe Schleifen und Zelle Freilassung. Führen Sie die Schritte 1.1.2 durch 1.1.3.
   3. Abgießen Sie den überstand nach Zentrifugation und wieder auszusetzen Sie, die Zelle Pellets in das gleiche Volumen der Überrest PBS (ca. 100 µL).
2. Färbung für Flow-zytometrie-Analyse
   1. In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen bereiten Sie einen master-Mix enthält die Färbung Antikörper in den Konzentrationen, die in Tabelle 1dargestellt, ein 2 X so nachgiebig Färbung Mischung konzentriert. Bereiten Sie genügend Volumen des master-Mix, 100 µL pro Probe zu haben. Die Zellen und die master-Mix 1:1 mischen und bei 4° C für 30 min inkubieren.
      Hinweis: Der letzte Färbung Band pro Probe sollte 200 µL (100 µL der Zelle Pellet + 100 µL Antikörper-master-Mix).
   2. Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugation, wie unter 1.1.3, Hinzufügen von 10 mL PBS, zweimal.
   3. Wieder aussetzen der gefärbten Zellen in 0,5-1 mL PBS für Erwerb und die Übertragung der Aussetzung zu Flow Cytometer Röhren. Immer die Proben auf Eis und vor Licht geschützt werden.

4. die Durchflusszytometrie

1. Immer Vorfilter die Zellproben mit 70-100 µm filtern.
2. Die Fluorophore detailliert in Tabelle 1 (Perlen oder Zellen) bereiten Sie einheitliche Färbung Entschädigung Kontrollen vor.
   Hinweis: Entschädigung sollte durchgeführt im Cytometer oder Analyse-Software^17,18,19 und auf alle Proben angewendet werden.
3. Folgen Sie der gating-Strategie in Abbildung 2dargestellt. Kurz, Tor Populationen im forward Scatter Höhe vs. forward Scatter Bereich (Abbildung 2A), und wieder Seite streuen breit vs. Scatter Seitenbereich (SSA, Abb. 2 b), um Dubletten auszuschließen.
4. Tor der Bevölkerung aus Figur 2 b durch Plotten BV 650 (Auto-Fluoreszenz) vs. FITC (CFSE) um echte CFSE-zu diskriminieren gefärbten Zellen aus hohen Auto-fluoreszierende Zellen. Enthalten Sie Perlen oder Zellen befleckt mit Antikörper konjugiert BV 650 in Entschädigung Steuerelemente. Dieses Grundstück (Abbildung 2) BV 650 vs. FITC wird verwendet, um die OT Tor-ich CFSE gefärbten Zellen.
5. Tor der Bevölkerung aus Figur 2 C für Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) um Zellen aus Spender vs. Empfänger Mäusen zu unterscheiden.
   Hinweis: Zellen abgeleitet von OT-ich Spender Mäuse sind Thy1.1⁺ (CD90.1), WT (C57BL/6, Empfänger) Mäuse-abgeleitete Zellen Thy1.2⁺ (CD90.2) (Abb. 2D). Einige Labore haben OT-ich Mäuse in einem Thy1.2 Hintergrund und WT (C57BL/6) in einem Thy1.1. In diesem Fall müssen Sie einen Antikörper gegen Thy1.2 für OT verwenden-ich Handy-gating.
6. Re Tor CD8⁺ Zellen von Thy1.1⁺ Bevölkerung durch Plotten es auf ein Tor, bestehend aus BV 450 (CD4) vs. APC (CD8) (Abb. 2E).
7. Anzeigen die Bevölkerung in Abbildung 2E mithilfe eine Histogrammanzeige von der CD8 gated⁺ Zellen zeigen CFSE (FITC, 530/15-Kanal - blaue Laser-), Tor die proliferierte Bevölkerung durch die Einbeziehung der Intensitäten von 10² bis auf die Ebene wo die ungeteilten Kontrolle Bevölkerungen sind (Intensitäten ~ 10⁵, abhängig von der Wirksamkeit der CFSE-Färbung und die Spannungseinstellung auf das Durchflusszytometer) (Abb. 2F).
8. Machen Sie einen zusätzliches Tor (nicht in Abbildung 2 dargestellt) Plotten FITC vs. L/D-Marker (450/20 Kanal, UV-Laser), um tote Zellen parallel zur Verbreitung Bewertung bewerten.
9. Erwerben Sie mindestens 5000 Ereignisse für die Entschädigung Steuerelemente und 10,000 Ereignisse (Tor E, Abbildung 2) aus den Proben in einem Durchflusszytometer. Laufen die Cytometer mit geringer oder mittlerer Durchfluss (Flussraten von 20.000 Veranstaltungen/s nicht überschreiten).

Ergebnisse

Um die Behandlungen mit einer anderen Kombination von Adjuvantien (ADJ1 und ADJ2) zu testen, beurteilten wir die CTL-Erzeugungskapazitäten durch Messung der Verbreitung von adoptively übertragenen OT-ich CD8⁺ T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2). Hierzu gebeizt wir zuvor isolierte Zellen aus der drainierenden Lymphknoten und der Milz (Tabelle 1). Durch die Messung der Proliferation von CD8⁺ T Zellen in Lym...

Diskussion

Moderne Impfstoffe sind im Idealfall Composedof gereinigte Antigen und Hilfsstoffe, mit den möglichen Zusatz eines Liefersysteme wie Liposomen, virusähnliche Partikel, Nanopartikel oder live Vektoren. Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung eines Impfstoffes ist, die richtigen adjuvanten nach den klinischen Bedürfnissen wählen. Bestandteil des Lieferumfangs könnte begünstigt eine humorale vs. zelluläre Immunantwort (oder beides), die Wahl eines lokalen vs. einer systemischen Immunantwort (oder beides) und die Art...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer	BD	Special Order	Flow Cytometer
CFSE	Molecular Probes	C34554	Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007	Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Molecular Probes	L23105	Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7	eBioscience	25-0900-82	antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody	BioLegend	100712	antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4	BD	740007	antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer	Beckman Coulter	9914591DA	Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)	Hyglos(Germany)	321000	Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon	Corning	352360	Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials	Beckman Coulter	899366014	Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes	Fischer (Corning)	14-959-5	Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes	Fischer (Corning)	05-527-90	Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)	Fischer (Gibco)	20-012-027	Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)	Dirk Rossmann GmbH (Germany)	405096	Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)	Abbott Laboratories (USA)	5260.04-05.	Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber	Parkland Scientific	V3000PK	Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium	Gibco (distributed by ThermoFischer)	11-875-093	Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	15-140-148	Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	10082147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	A1049201	Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes	Nunc (distributed by ThermoFischer)	150340	60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter	CellTrics (Sysmex)	04-004-2317	CellTrics® 50 μm, sterile