Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

Résumé

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

Résumé

L’évaluation des vaccins sous-unité moderne révèle que la production d’anticorps neutralisants est important mais insuffisant pour le choix de l’adjuvant. Par conséquent, les adjuvants grâce aux fonctions cellulaires et humorales immuno-stimulant qui sont en mesure de promouvoir les réponses (CTL) les lymphocytes T cytotoxiques sont urgent. Ainsi, la surveillance fidèle des candidats adjuvant qui induisent des croix-amorçage et ensuite améliorent la génération de CTL représente une étape cruciale dans le développement de vaccins. Ici, nous présentons une demande pour une méthode qui utilise SIINFEKL-spécifique (OT-je) les cellules T pour surveiller la présentation croisée du modèle antigène ovalbumine (OVA) in vivo en présence de candidats différents adjuvants. Cette méthode représente un test rapide pour sélectionner les adjuvants avec les meilleures capacités de croix-amorçage. La prolifération des CD8⁺ T cellules est la plus précieuse indication de croix-amorçage et il est également considéré comme un corrélat de la présentation croisée induite par le traitement adjuvant. Cette fonctionnalité peut être évaluée dans les différents organes du système immunitaire comme les ganglions lymphatiques et la rate. L’étendue de la génération de CTL peut être également surveillée, ce qui donne des idées sur la nature d’un local (drainage ganglionnaire principalement) ou une réponse systémique (ganglions éloignées et/ou la rate). Plus loin, cette technique permet plusieurs modifications pour tester des médicaments qui peuvent inhiber les voies spécifiques de présentation croisée et offre également la possibilité d’être utilisé dans différentes souches de souris classiques et génétiquement modifiées. En résumé, l’application que nous vous présentons ici sera utile pour les laboratoires de vaccin dans l’industrie ou des universités qui développent ou modifient des adjuvants chimiques pour la recherche sur les vaccins et le développement.

Introduction

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisant des vaccins sont les principales interventions thérapeutiques qui ont été développées pour lutter contre certains types de cancer¹. CTL sont également importants pour les vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires². En outre, CTL sont l’un de ses mécanismes de défense immunitaires peu fonctionnellement actifs dans les populations à risque tels que les nouveaux-nés^3,4 dont dépendent aussi de CTL pour lutter contre le début vie infections⁵. À cet égard, les vaccins contre le Virus Respiratoire Syncytial (RSV) qui ont été élaborés avec un adjuvant qui ne pas permis d’obtenir les réponses CTL (alun) a abouti à un échec complet du vaccin conduisant à des complications graves sur les infections chez les nourrissons de⁶. Ces effets négatifs de la vaccination peuvent être renversés par un CD8⁺ réaction de lymphocytes T⁷. Nous avons démontré précédemment que les principales cytokines (interférons de type I) provoquées par certains stimulateur d’agonistes de gènes (STING) interféron sont essentiels pour les réponses CTL générés par ces adjuvants⁸, en partie par la mesure de la prolifération des OT-I T cellules après vaccination et en utilisant ces résultats comme une mesure de CTL induisant des capacités fait observer dans l’extension de vaccination annexes⁹. La mesure de la prolifération des OT-j’ai CD8⁺ T des cellules dans une souris destinataire C57BL/6 de type sauvage (WT) de colorant de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) dilution est une estimation fiable de la capacité de l’adjuvant du vaccin à générer Croix-amorçage de SIINFEKL, (le peptide immuno-dominante de l’ovalbumine, ovules). Les variations de cette technique sont largement utilisées pour l’évaluation de la prolifération des OT-j’ai CD8⁺ et OT-II CD4⁺ T des cellules. Par exemple, il a été utilisé en l’absence de certaines cytokines (souris KO) ou pour mesurer l’efficacité du vaccin après rappel antigène chez les animaux de WT. Nous mis au point un protocole court (4 jours experiment) dans lequel après transfert passif des OT CFSE teinté-j’ai CD8⁺ T cells, une vaccination sous-cutanée de (c.s.) consistant en une seule dose de 50 µg d’ovules exempte d’endotoxine additionnée d’adjuvants de test est administré (Figure 1). Le suivi des résultats 48 heures après la vaccination fournit une preuve fiable de la capacité de l’adjuvant pour générer des réponses CTL. Par cette stratégie, il est possible d’évaluer la puissance de la réponse immunitaire locale dans le ganglion lymphatique drainant après vaccination ainsi que l’ampleur de la réponse en mesurant l’activité CTL dans la rate (ou d’éloignés des ganglions).

Protocole

Toutes les souris utilisées dans cette étude proviennent de l’arrière-plan de C57BL/6. Tous les animaux se trouvaient dans des conditions exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été réalisés selon la normative de la loi allemande de protection animale (TierSchG BGBl. J’AI S 1105 ; 25.05.1998) et ont été approuvés par le Comité de Basse Saxe sur l’éthique de l’expérimentation animale et de l’office de l’État (Basse Saxe État Office de la Protection des consommateurs et la sécurité alimentaire), sous le numéro de permis 33,4-42502-04-13/1281 et 162280.

1. CFSE coloration des OT-j’ai T cellules et transfert adoptif

NOTE : OT-je souris sont des animaux transgéniquement générés qui expriment un récepteur des cellules T (TCR) avec α fixe et chaînes β qui ensemble reconnaissent le peptide immuno-dominante des ovules, SIINFEKL^10,11. En conséquence, ces souris ont un nombre considérablement élevé de CD8 spécifiques SIINFEKL⁺ T cells (97 %)¹² par rapport aux souris normales ou ovules vaccinés (≤ 1 %)¹³.

1. Isolement des CD8 traçables les cellules de⁺ T de OT-j’ai des souris exprimant l’allèle de lymphocytes T spécifiques Thy1^un (Thy1.1) :
   1. Euthanasier OT âgés de 6 à 9 semaines-j’ai souris par inhalation de CO₂ suivie de dislocation cervicale¹⁴. Disséquer la rate et les principaux ganglions lymphatiques (paires inguinales, axillaires et col de l’utérus) en coupant la peau avec des ciseaux chirurgicaux, détacher la peau du corps avec l’aide de pinces chirurgicales et forceps et placez-les dans des boîtes de Pétri (60 x 15 mm) contenant chacune un 100µm pore maille coupe libération de meulage et cellule de tissus.
   2. Maintenir Pétri (chacun avec un maillage tasse) dans 3 à 5 mL de milieu RPMI complet (RPMI 1640, 10 % v/v FCS, 100 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine) gardé sur glace.
   3. Écraser les organes à l’aide d’un piston de la seringue ou un instrument stérile similaire (la découpe préalable n’est pas nécessaire) et recueillir la suspension monocellulaire qui en résulte dans des tubes à centrifuger 15 mL.
   4. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Laver les cellules dans 10 mL de PBS froid par centrifugation et lyse des érythrocytes de la rate par re-suspension du culot dans 1 mL/rate de chlorure d’ammonium buffer (tampon ACK, disponible dans le commerce). Incuber les cellules pendant 1,5 min sur glace et par la suite laver les cellules avec 10 mL de PBS froid par centrifugation (comme avant).
   5. Resuspendre le culot dans le même tube dans 1 mL de PBS (pH 7,2) contenant 5 % sérum de veau fœtal pour isolation magnétique.
2. Pour une isolation magnétique, procéder à la sélection négative des CD8⁺ T des cellules à l’aide d’un kit d’isolation magnétique selon les instructions du fabricant ou la publication des protocoles¹⁵.
3. Pour effectuer CFSE coloration, tout d’abord compter le nombre de CD8⁺ T cellules obtenues à partir des OT-je souris à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (compteur de particules). Tache 1-5 x 10⁷ cellules/mL dans un volume de 1 à 5 mL avec 5 µM CFSE dans du PBS pendant 7 min à 37 ° C, abri de la lumière dans un tube falcon de 15 ml.
4. Étancher la CFSE coloration en ajoutant le même volume (1:1) de sérum de veau fœtal aux cellules et les incuber supplémentaire 7 min à 37 ° C, abri de la lumière. Laver les cellules avec 10 mL de PBS.
5. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Définir le nombre de cellules à 3-5 x 10⁷ cellules/mL de PBS afin d’injecter 3 à 5 x 10⁶ cellules/souris dans 100 µL par voie intraveineuse (i.v.) via la veine caudale.
6. Pour effectuer des injections de veine de queue, immobiliser les souris dans retardateurs appropriés. Réchauffer le dos et la queue des souris pour être injecté à l’aide d’une lampe de lumière rouge, placée entre 20 à 25 cm des souris pendant 1-3 min afin de permettre une vasodilatation de la queue veineuse.
   Remarque : Cela contribue à la détection de veine de facilité et de l’administration de la suspension cellulaire.
7. S’assurer que (avec la main placée entre les souris et la lampe) qu’il n’est pas trop chaud pour les souris et lorsque les veines de queue sont clairement visibles, procéder à l’injection. Injecter les cellules dans la veine de queue latéral ou dorsal, à l’aide d’une seringue de 1mL avec une aiguille de calibre 25¹⁶.

2. vaccination (Endo-free OVA +/-Adjuvant)

1. Placez les souris transplantées avec OT-j’ai des cellules (étape 1.7, Figure 1) dans une chambre d’anesthésie et d’administrer isoflurane en oxygène par une anesthésie machine¹⁴.
2. Lorsque la souris est complètement endormie sous anesthésie, sortez-le de la chambre et raser la fourrure de la souris sur la zone au-dessus du gluteus superficialis (latéral bas du dos) à l’aide d’une machine de coupe de cheveux électriques, afin d’effectuer une injection propre avec une bonne vue de la zone d’application.
3. Injecter 50 µL du vaccin, l.c. dans la zone rasée à l’aide d’une aiguille de calibre 25.

3. isolement des Lymphocytes et de coloration pour l’analyse en cytométrie en flux

1. Isolement des lymphocytes et des splénocytes
   1. Euthanasier les souris vaccinées par inhalation de₂ CO suivie par dislocation cervicale.
   2. Extraire le drainants et lointains des ganglions lymphatiques et la rate et les placer dans séparé de Pétri contenant 100 µm pore maille tasses libération de meulage et cellule de tissus. Suivez les étapes 1.1.2 par 1.1.3.
   3. Décanter le liquide surnageant après centrifugation et remettre en suspension les granules cellulaires dans le même volume de vestige PBS (env. 100 µL).
2. Coloration pour l’analyse en cytométrie en flux
   1. Dans un tube à centrifuger de 15 mL, préparez un mélange maître contenant les anticorps coloration dans les concentrations décrites dans le tableau 1, produisant ainsi un 2 x mélange concentré de coloration. Préparer un volume suffisant de mélange maître d’avoir 100 µL par échantillon. Mélanger les cellules et master mix 1:1 et il incuber à 4° C pendant 30 min.
      Remarque : Le volume final de coloration par échantillon devrait être de 200 µL (100 µL de cellules pellet + 100 µL du mélange maître d’anticorps).
   2. Laver les cellules deux fois par centrifugation, tel que décrit en 1.1.3, ajouter 10 mL de PBS, deux fois.
   3. Remettre en suspension les cellules colorées en 0,5 à 1 mL de PBS pour l’acquisition et la cession de la suspension aux tubes cytomètre de flux. Toujours garder les échantillons sur la glace et abri de la lumière.

4. cytométrie en flux

1. Préfiltre toujours les échantillons de cellules à l’aide de filtres de 70 à 100 µm.
2. Préparer les contrôles de compensation coloration unique pour les fluorophores détaillés dans le tableau 1 (perles ou cellules).
   Remarque : Une indemnité devrait être effectuée dans cytomètre ou analyse logiciel^17,18,19 et appliquée à tous les échantillons.
3. Suivre la stratégie de blocage illustrée au tableau 2. En bref, les populations de porte en hauteur avant dispersion vs zone de dispersion vers l’avant (Figure 2 a), puis diffusion latérale large vs zone de dispersion latérale (SSA, Figure 2 b) afin d’exclure les doublets.
4. Porte la population de la Figure 2 b en traçant BV 650 (auto-fluorescence) vs FITC (CFSE) afin de discriminer le vrai CFSE teinté de cellules provenant des cellules auto-fluorescent hautes. Inclure des perles ou cellules colorées avec l’anticorps conjugué à BV 650 dans les contrôles de compensation. Ce terrain BV 650 vs FITC (Figure 2) est utilisé pour la porte de l’ancien testament-j’ai CFSE teinté de cellules.
5. Porte la population de la Figure 2 C pour Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) afin de distinguer les cellules provenant de donneurs vs souris destinataires.
   Remarque : Les cellules dérivées de OT-je souris de donateurs sont Thy1.1⁺ (CD90.1), tandis que les cellules d’origine souris (C57BL/6, destinataires) WT sont Thy1.2⁺ (CD90.2) (Figure 2D). Certains laboratoires ont OT-je souris dans un contexte de Thy1.2 et WT (C57BL/6) dans un Thy1.1. Dans ce cas vous devez utiliser un anticorps contre Thy1.2 pour l’OT-I de cellules Gate.
6. Re-gate CD8 les cellules de⁺ de Thy1.1⁺ population en traçant il sur un portail comprenant 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figure 2E).
7. Afficher la population Figure 2E contrôlée à l’aide d’un affichage de l’histogramme de la CD8⁺ cellules montrant CFSE (FITC, 530/15 canaux - bleu laser-), porte la population constituée en incluant des intensités de 10² jusqu’au niveau où les populations de contrôle indivis sont (intensités ~ 10⁵, selon l’efficacité de la coloration de CFSE et le réglage de la tension sur le cytomètre en flux) (Figure 2F).
8. Faire une porte supplémentaire (ne pas affiché à la figure 2) traçage marqueur FITC vs L/D (450/20 canaux, laser UV) afin d’évaluer les cellules mortes en parallèle à l’évaluation de la prolifération.
9. Acquérir au moins 5000 manifestations pour les commandes de compensation et 10,000 (porte E, Figure 2) des échantillons à un cytomètre en flux. Exécutez le cytomètre à débit faible ou moyenne (ne pas dépasser les vitesses d’écoulement de 20.000 événements/s).

Résultats

Afin de tester les traitements à l’aide d’une combinaison différente des adjuvants (ADJ1 et ADJ2), nous avons évalué la capacité de production de CTL en mesurant la prolifération des OT Moutschen transféré-j’ai CD8⁺ T des cellules par cytométrie en flux (Figure 2). Pour ce faire, nous avons teinté précédemment cellules isolées du drainage des ganglions et rate (tableau 1). En mesurant la prolifération des CD8

Discussion

Idéalement, les vaccins modernes sont composedof antigène purifié et adjuvants, avec l’ajout éventuel d’un système de livraison comme les liposomes, les Pseudo-particules virales, les nanoparticules ou les vecteurs vivants. Un aspect clé lors de la conception d’un vaccin consiste à choisir le bon adjuvant selon les besoins cliniques. Partie du champ d’application pourrait impliquer favorisant un humorale vs réponse immunitaire cellulaire (ou les deux), l’élection d’un local par rapport à une répons...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer	BD	Special Order	Flow Cytometer
CFSE	Molecular Probes	C34554	Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007	Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Molecular Probes	L23105	Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7	eBioscience	25-0900-82	antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody	BioLegend	100712	antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4	BD	740007	antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer	Beckman Coulter	9914591DA	Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)	Hyglos(Germany)	321000	Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon	Corning	352360	Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials	Beckman Coulter	899366014	Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes	Fischer (Corning)	14-959-5	Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes	Fischer (Corning)	05-527-90	Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)	Fischer (Gibco)	20-012-027	Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)	Dirk Rossmann GmbH (Germany)	405096	Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)	Abbott Laboratories (USA)	5260.04-05.	Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber	Parkland Scientific	V3000PK	Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium	Gibco (distributed by ThermoFischer)	11-875-093	Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	15-140-148	Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	10082147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	A1049201	Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes	Nunc (distributed by ThermoFischer)	150340	60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter	CellTrics (Sysmex)	04-004-2317	CellTrics® 50 μm, sterile