JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем здесь заявку на стандартный иммунологический метод (CFSE окрашенных OT-я распространения) предназначен для быстро отслеживать адъювант опосредованных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) поколения в vivo. Этот быстрый оценки возможностей CTL полезен для разработки профилактических вакцин против внутриклеточных возбудителей, а также терапевтического рака вакцины.

Аннотация

Оценка современных подразделение вакцин показывает, что поколения нейтрализующих антител является важным, но не достаточным для отбора адъювантной. Поэтому срочно необходимы адъювантов гуморальные и клеточные иммуно стимулирующее возможности, которые способны содействовать цитотоксических Т лимфоцитов (CTL) ответы. Таким образом верных мониторинг адъювантной кандидатов, которые вызвать кросс грунтовки и впоследствии повышения CTL поколения представляет решающим шагом в разработке вакцин. Здесь мы представляем заявку для метода, который использует SIINFEKL-конкретных (OT-я) Т-клеток следить в кросс Презентация модели антигена овальбумина (OVA) в естественных условиях при наличии различных адъювантной кандидатов. Этот метод представляет собой быстрый тест для выбора адъювантов с лучшими возможностями кросс грунт. С распространением CD8+ T клетки является наиболее ценным признаком кросс грунтовки и он также рассматривается как коррелят адъювант индуцированной кросс-презентации. Эта функция может быть оценен в различных иммунных органов как лимфатических узлах и селезенке. Степени CTL поколения может также контролироваться, тем самым давая информацию о характере местной (главным образом дренаж лимфатических узлов) или системного реагирования (отдаленных лимфатических узлов и селезенки). Этот метод также позволяет несколько модификаций для тестирования препаратов, которые могут препятствовать конкретные пути кросс презентация и также предоставляет возможность для использования в различных штаммов обычных и генетически измененных мышей. Таким образом приложение, которое мы представляем здесь будет полезным для лабораторий вакцины в промышленности и научных кругов, которые разрабатывать или изменять химические адъювантов для исследований и разработок вакцин.

Введение

Цитотоксических лимфоцитов T (CTL), вызывая вакцины являются ключевыми терапевтических вмешательств, которые были разработаны для борьбы с определенных видов рака1. CTL также важны для профилактической вакцины против внутриклеточных возбудителей2. Кроме того CTL являются одним из немногих механизмов иммунной обороны, функционально активных популяции риска таких новорожденных3,4 , которых также зависят от CTL борьбы с ранней жизни инфекции5. В этой связи вакцин против респираторных-синцитиальный вирус (RSV), которые были разработаны с адъювантом, которые не вызывают CTL ответы (квасцы) привели к полным провалом вакцины, ведущих к серьезным осложнениям после инфекции у младенцев6. Эти негативные эффекты вакцинации могут быть отменены CD8+ Т-клеток ответ7. Ранее мы показали, что основные цитокинов (тип и интерферонов) вызвало некоторые стимулятором интерферона генов (Стинг) агонистами важны для CTL ответы, порожденных эти адъюванты8, в частности путем измерения распространения OT-я T-клеток после вакцинации и использования этих результатов как мера CTL, вызывая возможности наблюдается в расширенной вакцинации расписания9. Измерение количества OT-я CD8+ T-клеток в дикого типа (WT) C57BL/6 получателей мыши Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) краситель разрежения является надежной оценки возможности адъювантной вакцины для создания кросс грунт SIINFEKL, (иммуно доминантный пептид овальбумина, OVA). Вариации этой техники широко используются для оценки распространения OT-я CD8+ и OT-II CD4+ T клетки. Например он был использован в отсутствие отдельных цитокинов (KO мышей) или измерить эффективность вакцины после отзыва антигена в WT животных. Мы разработали короткой протокола (4 дня эксперимент) в котором после пассивной передачи CFSE-витражи OT-я CD8 клетки+ T, подкожной иммунизации (с.к.), состоящий из одной дозе 50 мкг бесплатно эндотоксина OVA, дополнена тест адъювантов осуществляется (Рис. 1). Следить за 48 ч после вакцинации результатов обеспечивает надежное доказательство адъювантной способность генерировать CTL ответов. В этой стратегии можно оценить потенции локального иммунного ответа в Дренажный лимфатический узел после иммунизации, а также степени реакции путем измерения активности CTL селезенки (или отдаленных лимфатических узлов).

протокол

Все устройства, используемые в данном исследовании были от фона C57BL/6. Все животные находились в условиях свободной от возбудителя. Все эксперименты проводились согласно нормативной немецкого животного закона о защите (TierSchG BGBl. Я S 1105; 25.05.1998) и были утверждены Комитетом Нижняя Саксония по этике животных экспериментов и государственное управление (Нижняя Саксония государственного управления защиты прав потребителей и безопасность пищевых продуктов), под номером разрешения 33,4-42502-04-13/1281 и 162280.

1. CFSE окрашивание OT-я T клетки и приемных передачи

Примечание: OT-я мышей являются transgenically сгенерированный животных, которые выражают Т-клеточных рецепторов (TCR) с фиксированной α и β-цепи, которые вместе признаем иммуно доминантный пептид OVA, SIINFEKL10,11. В результате, эти мыши имеют значительно большое количество CD8 специфичные для SIINFEKL+ Т-клеток (97%)12 по сравнению с нормальным или OVA-прививки мышей (≤ 1%)13.

  1. Изоляция прослеживается CD8 клетки+ T от OT-я мышей, выражая Т лимфоцитов конкретных Thy1 (Thy1.1) аллеля:
    1. Усыпить OT 6-9 недель-я мышей с CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокация14. Вскрыть селезенки и крупных лимфатических узлов (паховые, подмышечные и шейки матки пар только) путем разрезания кожи с Ножницы хирургические, отсоединение кожу от тела с помощью хирургического клещи и щипцы и поместите их в чашках Петри (60 x 15 мм) каждый из которых содержит 100 мкм поры Кубок сетки для выпуска шлифовка и клеток тканей.
    2. Поддерживать Петри (каждый с одной сетки Кубок) в 3-5 мл полного RPMI среды (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 50 мкг/мл) хранится на льду.
    3. Размять органов с помощью поршень шприца или аналогичные стерильного инструмента (не требуется предварительного резки) и собирать результате подвеска одну ячейку в 15 мл пробирок.
    4. Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 10 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Вымыть клетки в 10 мл холодного PBS центрифугированием и лизируют эритроцитов из селезенки, вновь приостановить гранулы в 1 мл/селезенки хлорид аммония буферу (ACK, коммерчески доступных). Инкубировать клетки для 1,5 мин на льду и впоследствии вымыть клетки с 10 мл холодного PBS центрифугированием (как раньше).
    5. Вновь приостановите гранулы в же трубку в 1 мл сыворотки PBS (рН 7,2) содержащий 5% плода говядину для магнитных изоляции.
  2. Чтобы выполнить магнитного изоляции, перейти к негативный выбор CD8+ T клетки, используя набор магнитных изоляции согласно инструкции производителя или опубликованные протоколы15.
  3. Для выполнения CFSE окрашивание, сначала подсчитать количество CD8+ T клетки, полученные из OT-я мышей с помощью автоматизированных ячейки счетчика (счетчик частиц). Пятно 1-5 x 107 кл/мл в объеме 1-5 мл с 5 мкм CFSE в PBS для 7 минут при 37 ° C, защищенное от света в трубу 15-од Сокола.
  4. Утолить окрашивание CFSE путем добавления такой же объем (1:1) плода бычьим сывороточным клетки и проинкубируйте дополнительные 7 минут при 37 ° C, защищать от света. Вымойте клетки с 10 мл PBS дважды.
  5. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток. Задать номер ячейки до 3-5 x 107 клеток/мл PBS для того, чтобы придать 3-5 х 106 клеток/мышь в 100 мкл внутривенно (и.в.) через Вену хвост.
  6. Для выполнения инъекции Вену хвост, иммобилизации мышей в соответствующие взводы. Теплый, спины и хвоста мышей, чтобы быть введены, используя красный свет лампы, помещается между 20-25 см от мышей для 1-3 мин позволить хвост вен вазодилатации.
    Примечание: Это помогает легкости обнаружения вен и отправления суспензию клеток.
  7. Обеспечения (с рукой, размещенных между мышей и лампа) что это не слишком горячей для мышей и когда отчетливо видны Вены хвост, переходите к инъекции. Inject клетки в боковой или спинной хвост ключе, используя шприц 1 мл с 25-иглы16.

2. Иммунизация (Эндо свободный OVA + / адъювантной)

  1. Место мыши, пересаженные с OT-я клетки (шаг 1.7, рис. 1) в камеру анестезии и администрирование изофлюрановая кислорода в анестезия машины14.
  2. Когда мышь полностью спит под наркозом, вынимают из камеры и брить мех мыши на области над ягодичной superficialis (боковые в пояснице) с помощью электрического волос Кромкообрезной станок, для выполнения чистого впрыска с хорошим видом области приложения.
  3. Придать 50 мкл вакцины, s.c. в районе бритая, с использованием 25-иглы.

3. изоляция лимфоцитов и пятнать для потока Cytometry анализ

  1. Изоляция лимфоцитов и splenocytes
    1. Усыпить прививки мышей с CO2 ингаляции следуют шейки матки дислокации.
    2. Экстракт крылом и отдаленных лимфатических узлах и селезенке и поместите их в отдельный Петри, содержащие 100 мкм поры сетки чашки для выпуска шлифовка и клеток тканей. Выполните шаги 1.1.2 через 1.1.3.
    3. Декант надосадке после центрифугирования и вновь приостановить клетки окатышей в том же объеме остаток PBS (около 100 мкл).
  2. Пятнать для анализа потока цитометрии
    1. В 15 мл пластиковых пробирок Подготовьте мастер смеси, содержащие окрашивание антител в концентрациях, изображены в таблице 1, таким образом давая 2 x концентрации окрашивания микс. Готовить достаточное количество мастер смесь, чтобы иметь 100 мкл на сэмпл. Сочетание клетки и мастер смесь 1:1 и Инкубируйте на 4° C на 30 мин.
      Примечание: Окончательный объем окрашивания на сэмпл должен быть 200 мкл (100 мкл клеток Пелле 100 мкл антител мастер смеси).
    2. Вымойте клетки центрифугированием дважды, как описано в разделе 1.1.3, добавив 10 мл PBS, дважды.
    3. Вновь приостановить окрашенных клеток в 0,5-1 мл PBS для приобретения и передачи приостановки потока цитометр трубы. Всегда храните образцы на льду и защищены от света.

4. проточной цитометрии

  1. Всегда предварительно отфильтруйте образцы клетки, с помощью фильтров 70-100 мкм.
  2. Подготовка одного окрашивания компенсации управления флуорофоров, подробно изложены в таблице 1 (бусы или клетки).
    Примечание: Компенсации следует в цитометр или анализа программного обеспечения17,18,19 и применяется для всех образцов.
  3. Следуйте стробирования стратегия, изображенный на рисунке 2. Вкратце ворота населения в высоту вперед разброс против вперед разброс области (рисунок 2A) и снова стороне разброс широкий против точечной Сиде (SSA, Рисунок 2B), с тем чтобы исключить Дуплеты.
  4. Ворота населения от Рисунок 2B путем построения BV 650 (auto флуоресцентным) vs. FITC (CFSE) для того, чтобы дискриминация истинный CFSE окрашенных клеток с высоким авто люминесцентные клеток. Включайте бусы или клетки окрашивали антитело проспряганное BV 650 в компенсации элементы управления. Этот участок (рис. 2 c) BV 650 против FITC используется для ворот OT-я CFSE окрашенных клеток.
  5. Ворота населения от Рисунок 2 C для Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs. APC (CD8) для того, чтобы отличить клетки, полученные от доноров против получателей мышей.
    Примечание: Клетки, полученные от OT-я мышей доноров являются Thy1.1+ (CD90.1), тогда как WT (C57BL/6, получателя) мышах производный клетки являются Thy1.2+ (CD90.2) (Рисунок 2D). Некоторые лаборатории имеют OT-я мышей в Thy1.2 фон и WT (C57BL/6) в Thy1.1. В этом случае вы должны использовать антитело против Thy1.2 для OT-я мобильных стробирования.
  6. Заново ворота CD8 клетки+ Thy1.1+ населения путем построения на ворота, включающий 450 BV (CD4) vs. APC (CD8) (рис. 2е).
  7. Отображение условного 2E рисунок с помощью гистограммы CD8 населения+ клетки показаны CFSE (FITC, канал - синий лазер - 530/15), ворота распространение населения путем включения света от 10-2 до уровня где пристального контроля населения являются (интенсивности ~ 105, в зависимости от эффективности CFSE окрашивание и параметр напряжения на проточный цитометр) (Рисунок 2F).
  8. Чтобы оценить отмершие клетки параллельно с распространением оценки дополнительные ворота (не отображается на диаграмме 2) построения FITC против L/D маркер (450/20 каналов, УФ лазер).
  9. Приобрести по крайней мере 5000 событий для элементов управления, компенсации и 10.000 (ворота E, рис.2) от образцов проточный цитометр. Запуск на низкой или средней потока цитометр (не превышает расхода 20.000 события/s).

Результаты

Чтобы протестировать лечения, используя различные комбинации адъювантов (ADJ1 и ADJ2), мы оценили CTL генерирующих мощностей путем измерения распространения восприимчивую передаваемых OT-я CD8 клетки+ T подачей cytometry (рис. 2). Для этого мы ранее окрашенных ...

Обсуждение

Современные вакцины являются идеально composedof очищенный антигена и адъювантов, с возможным добавлением системы доставки как липосомы, вирусоподобных частиц, наночастицы или живой векторов. Ключевым аспектом при разработке вакцины необходимо выбрать правильный адъювантной согласно кл...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы в долгу перед нашими техническими помощниками: ю. Bröder и х. Shkarlet, который помог нам в ходе экспериментальных процедур. Эта работа была частично финансируется ЕС гранты (UniVax, контракт № 601738 и TRANSVAC2, контракт № 730964) и Грант Гельмгольца (Хай-IDR). Источники финансирования не влияют исследования дизайн, поколения рукопись или решение представить его для публикации.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSR Fortessa Cell AnalyzerBDSpecial OrderFlow Cytometer
CFSEMolecular ProbesC34554Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation KitBiolegend480007Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitationMolecular ProbesL23105Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7eBioscience25-0900-82antibody
APC anti-mouse CD8a AntibodyBioLegend100712antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4BD740007antibody
Z2 coulter Particle count and Size AnalyzerBeckman Coulter9914591DACell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)Hyglos(Germany)321000Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylonCorning352360Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample VialsBeckman Coulter899366014Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)Harlan (Rossdorf, Germany)Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)Harlan (Rossdorf, Germany)Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubesFischer (Corning)14-959-5Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubesFischer (Corning)05-527-90Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)Fischer (Gibco)20-012-027Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)Dirk Rossmann GmbH (Germany)405096Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)Abbott Laboratories (USA)5260.04-05.Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 AbsorberParkland ScientificV3000PKIsoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 mediumGibco (distributed by ThermoFischer)11-875-093Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)15-140-148Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)Gibco (distributed by ThermoFischer)10082147Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)Gibco (distributed by ThermoFischer)A1049201Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri DishesNunc (distributed by ThermoFischer)15034060 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump FilterCellTrics (Sysmex)04-004-2317CellTrics® 50 μm, sterile

Ссылки

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
  16. Shimizu, S., Bullock, G. . The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136CD8 TOT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены