Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Der jüngste Anstieg virusähnliche Partikel (untersuchten) in biomedizinischen und Materialforschung kann einfache Biosynthese, diskrete Größe, genetische Programmierbarkeit und biologische Abbaubarkeit zugeschrieben werden. Während sie biokonjugaten Reaktionen für das Hinzufügen von synthetischen Liganden auf ihrer Oberfläche sehr zugänglich sind, ist das Angebot in biokonjugaten Methoden auf diese wässrigen geboren Capsids relativ begrenzt. Um die Ausrichtung der funktionalen Biomaterialien Forschung zu erleichtern, müssen nicht traditionele biokonjugaten Reaktionen berücksichtigt werden. Die Reaktion in diesem Protokoll beschriebenen verwendet Dibromomaleimides, neue Funktionen in dem Lösungsmittel vorstellen exponierten Disulfid-Bindungen der ein VLP Bakteriophagen Qβ zugrunde. Darüber hinaus ist das Endprodukt Leuchtstofflampen, die hat den zusätzlichen Vorteil eine verfolgbaren in-vitro- Sonde mit einem handelsüblichen Filtersatz zu erzeugen.

Einleitung

Mit viralen Capsids nanogrösse entstanden als ein spannendes Gebiet, die darauf abzielt, die Ausweitung der Anwendungen in der biomedizinischen Forschung^1,2,3. Rekombinant ausgedrückt virusähnliche Partikel (untersuchten) strukturell Viren abgeleitet sind, aber es fehlt das original virale Erbgut so dass sie nicht-infektiösen proteinhaltige Nanopartikel. Da die Oberflächen-Features genetisch programmiert sind und jede Kapsid sich identisch zu den davor und dahinter drückt, ist es möglich, die Lage und Anzahl der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren mit atomistischen Präzision kennen. In vielen Fällen besitzen die äußeren und inneren Oberflächen viele Arten von Lösungsmittel ausgesetzt Aminosäurereste, die praktisch durch biokonjugaten Reaktionen - Reaktionen funktionalisiert werden können, die bilden kovalente Bindungen zwischen ein Biomolekül und ein synthetisches Molekül-^4,-⁵.

Biokonjugaten Reaktionen helfen Biomoleküle von Interesse vielfältigere Funktionen auf relativ einfache Weise haben. Moleküle von Interesse, wie Medikamente⁶, fluoreszierende Tags⁷ und Polymere^8,9 können Pre synthetisiert und charakterisiert, bevor sie auf der Oberfläche des untersuchten zugeordnet sind. Eine besonders häufige VLP in biomedizinischen und Biomaterialien Forschung wurde der VLP basiert auf Bakteriophagen Qβ, die als rekombinant ausgedrückt, ein 28 nm ikosaedrischen Kapsid virale¹⁰. Die häufigsten Lokalisationen der Reaktion auf Qβ sind Lysines bei weitem, obwohl wir vor kurzem die erfolgreiche Konjugation¹¹ Dibromomaleimide Verbindungen zu den reduzierten Disulfides kommuniziert haben, die die Poren des Qβ über eine Haddleton-Baker-Reaktion säumen. Die Reaktion verläuft mit gutem Ertrag und ebenso wichtig ist, ohne die thermische Stabilität der Partikel zu verlieren. Zur gleichen Zeit erzeugt diese Reaktion Konjugation-induzierte Fluoreszenz, die verwendet werden, um die Aufnahme dieser Partikel in Zellen zu verfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir die Konjugation von Polyethylenglykol (PEG) auf die Oberfläche des Qβ durch die Haddleton-Baker-Reaktion, die Ergebnisse in einem hellen gelben Fluorophor. Diese Partikel können dann verfolgt werden, wie sie von den Zellen aufgenommen werden. Das Protokoll hier hilft Forschern neue fluoreszierende pegylierten Qβ, proteinhaltige Nanopartikel Grundlage zu generieren, obwohl seine Prinzipien auf einer der vielen anderen untersuchten mit Lösungsmittel ausgesetzt Disulfides anwendbar sind.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Machen Sie Lysogeny Brühe (LB) Agar und Gießen Sie Platten¹².
2. BL21(DE3) mit einem pET28 Plasmid enthält die Proteinsequenz WtQβ Mantel zu verwandeln.
   1. E. Coli BL21(DE3) kompetente Zellen im Eisbad Auftauen. Platz 50 μL der Zellen in einem Microcentrifuge Schlauch.
   2. Fügen Sie 2 μL des Plasmids in eine Röhre und sanft flick das Rohr. Inkubieren Sie dann für 30 min auf Eis.
   3. Hitzeschock Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei genau 42 ° C. Legen Sie das Rohr zurück in das Eisbad unmittelbar nach der Hitze schockierend, und 5 min inkubieren.
   4. Fügen Sie 950 μl LB-Medium, die keines Antibiotikum enthält.
   5. Schütteln Sie die Kultur bei 200 u/min für 60 min bei 37 ° C.
   6. Platte 100 μL der Kultur auf LB-Agar-Platten (mit Kanamycin) und die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wählen Sie weiße Kolonien bei Bedarf.
3. Machen Sie Super optimale Brühe (SOB) Medien.
   1. Autoklaven 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben auf einem superdry Zyklus.
   2. In eine aseptische Umgebung abwiegen und fügen 20,0 g Tryptone, 5,0 g Hefe-Extrakt, 2,469 g wasserfreies Magnesiumsulfat, 0,584 g Natriumchlorid und 0,186 g Kaliumchlorid zu jedem Kolben.
   3. Bringen Sie die Lautstärke auf 1 L mit Reinstwasser in jeder Flasche und Autoklaven auf dem flüssigen Zyklus.
   4. Sobald die SOB-Medien nach dem Autoklavieren zuerst auf Zimmertemperatur kommen, jeder Liter Medien 1 mL Kanamycin (100 mg/mL) hinzu und Lagerung bei 4 ° C.
4. 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) zu machen.
   1. Machen Sie 1 M Kalium monobasic Lösung durch 68,045 g Kalium in 500 mL Reinstwasser monobasic auflösen.
   2. Machen Sie 1 M Kalium Diabas-Lösung durch 87,09 g Kalium in 500 mL Reinstwasser Diabas-auflösen.
   3. Eine 1 L Flasche 38,5 mL Kalium monobasic Lösung und 61,5 mL Kalium Diabas-hinzufügen.
   4. PH bis 7.00 Uhr bei Bedarf anpassen, und bringen auf ein Volumen von 1 L.
5. Machen Sie 5 – 40 % Saccharose Steigungen in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
   1. Erarbeiten Sie in 50 mL Zentrifuge Röhren Lösungen mit 5 – 40 % (in Schritten von 5 % Steigerung) Saccharose in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) aufgelöst.
   2. Zahlen Sie 3,3 mL 5 % Saccharoselösung am unteren Rand ein 38 mL Rundboden Polycarbonat Rohr mit einer langen Nadel Spritze ein, und wiederholen Sie dies für fünf andere Röhren.
   3. Hinterlegen Sie 3,3 mL 10 % Saccharose-Lösung an der Unterseite des Schlauches sorgfältig zu, und entfernen Sie vorsichtig die Nadel, die Steigung nicht zu stören. Wiederholen Sie für die anderen fünf Röhren.
       
6. Weiterhin einzahlen 3,3 mL Schichten von Saccharose-Lösungen, Steigerung von 15 % bis 40 % in jedem Röhrchen vorsichtig zu sein, die Steigung nicht zu stören.
7. Wenn Sie fertig sind, die Spitzen der Gradienten mit Folie abdecken und lagern bei-80 ° C.

(2) Ausdruck der Qβ

1. Wischen Sie Bank Fläche mit Bleichmittel/Ethanol 1:1.
2. Machen Sie zwei 3 mL Starterkulturen in eine aseptische Umgebung, indem einzelne Kolonien von E. Coli BL21(DE3) in 3 mL SOB Medien in eine aseptische Umgebung.
3. Über Nacht auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % Relative Luftfeuchtigkeit (rH) wachsen.
4. Impfen Sie Starterkultur in SOB Medien:
   1. Der Shaker beide 3 mL Starterkulturen ausziehen und in eine aseptische Umgebung jeder Starter-Kultur in einer der beiden Gießen 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben mit 1 L frische SOB Medien in jedem.
   2. Legen Sie die beimpften Medien auf einen Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH.
5. Wachsen Sie die Bakterien auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH bis OD₆₀₀ 0,9 – 1,0 erreicht.
6. Fügen Sie 1 mL 1 M Isopropyl β-D-1 Thiogalactopyranoside (IPTG) mit einer Pipette P1000 Proteinexpression induzieren.
7. Lassen Sie die Medien auf den Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH-Raum über Nacht.
8. Entfernen Sie Medien aus der Shaker am folgenden Morgen und Zentrifuge mit 1000 mL-Flaschen bei 20.621 × g für 1 h bei 4 ° C um die Zellen zu ernten.
9. Verwerfen Sie den überstand und sammeln Sie die Zelle Pellet.
   1. Gießen Sie den überstand in eine Flasche mit ca. 5 mL Bleichen, um Bakterien abzutöten. Das ist Verschwendung.
   2. Einem Spatel zu kratzen die Zelle Pellet aus der Zentrifuge Flaschenboden und das Pellet in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.

3. Reinigung des Qβ

1. Aufschwemmen der Zelle Pellet mit ~ 20 – 30 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
2. Stellen Sie sicher die Wiederfreisetzung hat keine Klumpen, und lösen Sie die Zellen mit einem Microfluidizer Prozessor laut Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie die Zellen mindestens zweimal, um den Ertrag der Partikel zu erhöhen.
3. Zentrifugieren der lysate in 250 mL Zentrifuge Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.
4. Entsorgen Sie das Pellet und Messen Sie das Volumen der Überstand in mL. Multiplizieren Sie diesen Wert durch 0.265 und der Überstand fügen Sie diesen Betrag von g Ammoniumsulfat hinzu.
5. Rühren Sie bei 4 ° C für mindestens 1 h auf einem Teller rühren bei 200 u/min das Protein ausgefällt.
6. Zentrifugieren Sie in 250 mL Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.
7. Überstand verwerfen und erneut das Pellet mit etwa 10 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
8. Gleiche Volumina von 1:1 Chloroform/n-Butanol am rohen Probe und fügen Sie Mischung durch Vortexen für ein paar Sekunden hinzu.
9. Für 30 Minuten bei 4 ° c in 38 mL Röhrchen mit 20.621 × g zentrifugieren
10. Die obere wässrige Schicht mit einer Pasteurpipette zu erholen. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das Gel wie Schicht zu nehmen, der zwischen die wässrige und organische Schicht gebildet hat.
11. Tauen Sie sechs 5 – 40 % vorgefertigte Saccharose Steigungen und laden Sie ca. 2 mL des Extrakts auf jede.
12. Ultrazentrifugen 99.582 x g für 16 h bei 4 ° C mit kostenlosen Verlangsamung.
13. Licht emittierende Dioden (LED) Licht unter jedes Rohr und ein blaues Band sollte sichtbar. Diese Partikel mit einer langen Nadel Spritze zu erholen.
14. Ultrapellet die Partikel bei 370.541 x g 2,5 h bei 4 ° C.
15. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der transparenten Pellets gereinigten Partikel mit 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,00).

(4) Quantifizierung und Bestätigung des Produkts

1. Verwenden Sie Bradford-Test, um Produkt-¹³zu quantifizieren.
2. Laufen zu reduzieren und nicht-reduzierende Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die Produkt-¹⁴zu bestätigen.
   Hinweis: Verringerung der SDS-PAGE wird verwendet, um das Molekulargewicht des Hüllprotein bestätigen; nicht-reduzierende SDS-PAGE ist der höhere Auftragsstruktur bestätigen.

(5) Konjugation DB Verbindungen auf Qβ

1. Reduzieren Sie Disulfides auf Qβ.
   1. Lösen Sie 0,0020 g des tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) in 1 mL Reinstwasser eine 100 X-Stammlösung zu machen.
      Hinweis: Bereiten Sie frische DÄMMUND vor der Reduktion.
   2. Fügen Sie 200 µL des Qβ (5 mg/mL) zu einem Microcentrifuge Schlauch.
   3. Folgen Sie durch Zugabe von 20 µL der Stammlösung der 100 X TCEP.
   4. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.
2. Neu Brücke reduzierte Disulfid mit Dibromomaleimide Polyethylenglykol (DB-PEG).
   1. 0,0017 g Dibromomaleimide-Polyethylenglykol (DB-PEG) in 100 µL DMF auflösen.
   2. 680 µL 10 mM Natriumphosphat Lösung (pH 5,00) hinzufügen.
   3. Fügen Sie Qβ in die DB-PEG-Lösung reduziert und beobachten Sie den Mischprozess unter 365 nm UV-Licht zu. Die helle gelbe Fluoreszenz kann sofort mit einer 365 nm handheld UV-Lampe beim Mischen visualisiert werden.
   4. Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) auf ein Drehspieß fortfahren.
3. Das Reaktionsgemisch durch zentrifugale Filter zu reinigen (COMW = 10 kDa) dreimal mit 1 X PBS 3.283 x g für 20 min bei 4 ° C.
4. Überwachen Sie die Konjugation von nicht-Verringerung der SDS-PAGE und native Agarose-Gelelektrophorese.
   Hinweis: Untersuchten als intakt Partikel in native Agarosegel, und trennt sie je nach ihrer Ladung, Größe und Form.

Ergebnisse

Die Dibromomaleimide-Derivate können durch die Kondensationsreaktion zwischen Dibromomaleimide-Anhydrid und primäre Amine¹⁵synthetisiert werden. Alternativ wurde eine milde synthetische Methode¹⁶ mit N-Methoxycarbonyl aktiviert 3,4-Dibromomaleimide hier ausgenutzt durch die Reaktion mit Methoxypolyethylene Glykol (PEG) Rendite DB-PEG (Abbildung 1). NMR wurde verwendet, um die zusammengesetzte Struktur (

Diskussion

Im Vergleich zu kleineren Proteinreinigung, ist ein einzigartiger Schritt bei der Reinigung von Bakteriophagen Qβ der Saccharose gradient Zentrifugation. Nach dem Chloroform/n-Butanol Extraktionsschritt wird Qβ weiter gereinigt mit 5-40 % Saccharose Steigungen. Bei der Zentrifugation werden Partikel anhand ihrer Größe getrennt. Größere Partikel Reisen in die höhere Dichte-Region, während kleinere Partikel in der niedrigeren Dichte Region bleiben. Qβ reist in das untere Drittel des Farbverlaufs und verweilt dort,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, Poweder	Research Products International	T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder	Research Products International	Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate	P212121	CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System	Fisher Scientific	4474524
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	P288-500
Sucrose	Fisher Scientific	S25590B
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor	Fisher Scientific	096-041053
Ammonium Sulfate	P212121	KW-0066-5KG
Chloroform	Alfa Aesar	32614-M6
1-Butanol	Fisher Scientific	A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum	Beckman Coulter	342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,	Beckman Coulter	337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Fisher Scientific	PI23200
TRIS Hydrochloride	Research Products International	T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine	Alfa Aesar	J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polythylene Glycol	Alfa Aesar	41561-22
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Labnet Revolver Adjustable Rotator	Thomas Scientific	1190P25
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap	Thermo Scientific	010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer	Thermo Scientific	3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC	Thermo Scientific	3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim	Pyrex	4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	Millipore Sigma	UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor	Microfluidics	M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate	Beckman Coulter	41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL	PolyLab	80005
533LS-E Series Steam Sterilizers	Getinge	533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid	LabSource	D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker	VWR Scientifc Products	14005-830
Tetra Handcast systems	Bio-Rad	1658000FC
Polypropylene, 250 mL	Beckman Coulter	41121703
Spectrofluorometer NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	3300
Long Needle	Hamilton	7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock	Fisher Scientific	14-841-46
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl	Bio-Rad	456-1084