Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

Resumo

Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.

Resumo

A ascensão recente em partículas vírus-like (VLP) em biomédica e pesquisa de materiais pode ser atribuída à sua facilidade de biossíntese, tamanho discreto, programação genética e biodegradabilidade. Enquanto eles são altamente favoráveis para reações de bioconjugation para a adição de ligantes sintéticos em sua superfície, o intervalo em metodologias de bioconjugation sobre estes capsids nascidos aquosas é relativamente limitado. Para facilitar a direção da pesquisa de biomateriais funcionais, devem considerar-se reações de bioconjugation não-tradicionais. A reação descrita neste protocolo usa dibromomaleimides para introduzir a nova funcionalidade no solvente dissulfeto expostas de um VIP com base em Qβ do bacteriófago. Além disso, o produto final é fluorescente, que tem a vantagem de gerar uma sonda controlável em vitro , usando um conjunto de filtro disponíveis comercialmente.

Introdução

Usar capsids virais nanométricas emergiu como um campo excitante, que visa alargar o âmbito de aplicações em pesquisa biomédica^1,2,3. Recombinantes expressas partículas vírus-like (VLP) são estruturalmente derivadas de vírus, mas falta-lhes o material genético viral original tornando-os não-infecciosa nanopartículas proteicas. Como as características de superfície são geneticamente programadas e cada capsídeo é expressa forma idêntica aos antes e depois dela, é possível saber a localização e o número de cadeias de lado reativo dos aminoácidos com precisão atomística. Em muitos casos, ambas as superfícies exteriores e interiores possuem muitos tipos de solvente expostas aminoácidos, que podem ser viável acrescidos através de reações de bioconjugation - reações que formam ligações covalentes entre uma biomolécula e sintético molécula de^4,5.

Reações de Bioconjugation ajudam biomoléculas de interesse têm as mais diversas funcionalidades de uma forma relativamente simples. Moléculas de interesse, tais como drogas terapêuticas⁶, etiquetas fluorescentes⁷ e polímeros^8,9 podem ser pre-sintetizadas e caracterizadas antes de que estão ligados na superfície de VIPs. Um VIP particularmente comum em biomedicina e pesquisa de biomateriais foi o VIP com base em Qβ do bacteriófago, que, como recombinantes expressas, são 28 nm icosahedral capsídeo viral¹⁰. Os locais mais comuns de reação em Qβ são lisinas por uma larga margem, embora nós comunicaram recentemente a conjugação bem sucedida¹¹ de compostos dibromomaleimide para os dissulfetos reduzidos que revestem os poros da Qβ através de uma reação de Haddleton-Baker. A reação procede com bom rendimento e, igualmente importante, sem perder a estabilidade térmica das partículas. Ao mesmo tempo, esta reação gera fluorescência induzida por conjugação, que pode ser usada para rastrear a absorção destas partículas em células. Neste trabalho, demonstramos a conjugação de polietileno glicol (PEG) sobre a superfície da Qβ através da reação de Haddleton-Baker, que resulta em um fluoróforo amarelo brilhante. Estas partículas podem ser rastreadas então como eles estão tomados por células. O protocolo aqui ajudará pesquisadores gerar novo peguilado fluorescente nanopartículas proteicas baseadas em Qβ, apesar de seus princípios são aplicáveis a um dos muitos outros VIPs contendo solventes dissulfetos expostos.

Protocolo

1. preparação

1. Fazer o ágar-ágar lisogenia caldo (LB) e despeje placas¹².
2. Transforme o BL21(DE3) com um plasmídeo pET28 que contém a sequência de proteínas de revestimento wtQβ.
   1. Descongele células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) em um banho de gelo. Colocar 50 μL de células em um tubo de microcentrifugadora.
   2. Adicionar 2 μL do plasmídeo em um tubo e agite suavemente o tubo. Então incube no gelo por 30 min.
   3. Calor-choque as células para 45 s num banho de água que é exatamente a 42 ° c. Coloque o tubo de volta no banho de gelo imediatamente após calor-choque e incubar durante 5 min.
   4. Adicione 950 μL de LB mídia que não contenha qualquer antibiótico.
   5. Agite a cultura a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
   6. Placa 100 μL da cultura em placas de ágar LB (com canamicina) e incube a placa durante a noite a 37 ° C. Selecione colônias brancas quando necessário.
3. Faça mídia Super ideal caldo (SOB).
   1. Autoclave dois 2 L confusos Erlenmeyers num ciclo superdry.
   2. Em um ambiente asséptico, pesar e adicionar 20,0 g de triptona, extrato de 5,0 g de levedura, 2,469 g de sulfato de magnésio anidro, 0,584 g de cloreto de sódio e 0,186 g de cloreto de potássio para cada balão.
   3. Trazer o volume de 1 L com água ultrapura em cada balão e autoclave ao ciclo de líquido.
   4. Uma vez que a mídia SOB alcançou a temperatura após a autoclavagem, adicionar 1 mL de canamicina (100mg/mL) para cada litro de mídia e armazenar a 4 ° C.
4. Fazer o tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
   1. Fazer 1 M potássio monobásico solução dissolvendo-se 68,045 g de potássio monobásico em 500 mL de água ultrapura.
   2. Fazer 1 M potássio dibásico solução dissolvendo 87,09 g de potássio dibásico em 500 mL de água ultrapura.
   3. Adicione 38,5 mL de solução de potássio monobásico e 61,5 mL de potássio dibásico para uma garrafa de 1 L.
   4. Ajustar o pH a 7.00, se necessário e trazer para um volume de 1 L.
5. Faça 5 – 40% gradientes de sacarose em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
   1. Em tubos de centrífuga de 50 mL, prepare soluções com sacarose 5 – 40% (aumentando em incrementos de 5%) dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
   2. Depósito 3,3 mL da solução de sacarose 5% na parte inferior de um tubo de fundo redondo de policarbonato 38 mL utilizando uma seringa de agulha longa e repita isto para cinco outros tubos.
   3. Depositar cuidadosamente 3,3 mL da solução de sacarose 10% na parte inferior do tubo e Retire cuidadosamente a agulha como para não incomodar o gradiente. Repita para os outros cinco tubos.
       
6. Continue a depositar camadas 3,3 mL das soluções de sacarose, aumento de 15% para 40% em cada tubo, enquanto sendo cuidadoso para não perturbar o gradiente.
7. Quando completo, cobrir os topos dos gradientes com papel alumínio e armazene a-80 ° C.

2. a expressão de Qβ

1. Limpe a área com água sanitária de 1:1 (etanol) banco.
2. Faça dois fermentos de 3 mL em um ambiente asséptico adicionando única colônias de Escherichia coli BL21(DE3) em 3 mL de mídia SOB um ambiente asséptico.
3. Cresce num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% de umidade relativa (rH) durante a noite.
4. Inocule a cultura em mídia SOB:
   1. Tire o agitador ambos os fermentos de 3 mL e, em um ambiente asséptico, despeje cada cultura starter em um dos dois 2L perplexo Erlenmeyers com 1 L de mídia de soluço fresca em cada um.
   2. Coloque a mídia inoculada num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH.
5. Cresce a bactéria num agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH até OD₆₀₀ atinge 0,9 – 1.0.
6. Adicione 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) usando uma pipeta P1000 para induzir a expressão da proteína.
7. Deixe a mídia no agitador a 250 rpm em um quarto de 37 ° C e 0% rH durante a noite.
8. Remova mídia de agitador da manhã seguinte e centrífuga usando garrafas de 1000ml a 20.621 × g por 1 h a 4 ° C para colher as células.
9. Desprezar o sobrenadante e coletar o centrifugado.
   1. Despeje o sobrenadante para um balão com cerca de 5 mL de água sanitária para matar as bactérias. Isso é lixo.
   2. Use uma espátula para raspar o centrifugado do fundo da garrafa centrífuga e colocar a pelota em um tubo de centrífuga de 50 mL.

3. purificação de Qβ

1. Ressuspender as células com ~ 20 a 30 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
2. Verifique se a ressuspensão tem sem pedaços e lisar as células usando um processador de microfluidizer de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de materiais). Lise as células pelo menos duas vezes para aumentar o rendimento das partículas.
3. Centrifugue o lisado em garrafas de 250 mL centrífuga a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
4. Descartar a pelota e medir o volume de sobrenadante em mL. Multiplique esse valor por 0,265 e adicionar essa quantidade de g de sulfato de amônio para o sobrenadante.
5. Misture a 4 ° C, durante pelo menos 1 h em um prato misture a 200 rpm para precipitar-se a proteína.
6. Centrifugue em frascos de 250 mL a 20.621 x g, durante 1 h a 4 ° C.
7. Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com cerca de 10 mL de tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).
8. Adicione volumes iguais de clorofórmio/n-butanol de 1:1 para a amostra bruta e mistura num Vortex durante alguns segundos.
9. Centrifugue em tubos de 38 mL a 20.621 × g por 30 minutos a 4 ° C.
10. Recupere a camada aquosa superior utilizando uma pipeta Pasteur. Seja cauteloso para não tomar qualquer do gel como camada que se formou entre a camada aquosa e orgânica.
11. Descongelar o seis gradientes de sacarose pré-fabricados de 5-40% e carregar cerca de 2 mL do extrato para cada um.
12. Se a 99.582 x g, durante 16 h a 4 ° C, com desaceleração livre.
13. Brilha uma luz emitindo luz de diodo (LED) em cada tubo e uma faixa azul deve tornar-se visível. Recupere essas partículas com uma seringa de agulha longa.
14. Ultrapellet as partículas a 370.541 x g, durante 2,5 h a 4 ° C.
15. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o transparente de partículas purificadas com tampão de fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,00).

4. quantificação e confirmação do produto

1. Use o ensaio de Bradford para quantificar o produto¹³.
2. Reduzindo a execução e não de redução de sódio Dodecil sulfato de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar o produto¹⁴.
   Nota: Reduzir SDS-PAGE é usado para confirmar o peso molecular da proteína do revestimento; não-reduzir SDS-PAGE é para confirmar a estrutura de ordem superior.

5. conjugação DB compostos em Qβ

1. Reduza a dissulfetos na Qβ.
   1. Dissolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) (TCEP) de fosfina em 1 mL de água ultrapura, tornar-se uma solução estoque de 100 x.
      Nota: Prepare TCEP fresco antes da redução.
   2. Adicione 200 µ l de Qβ (5 mg/mL) em um tubo de microcentrifugadora.
   3. Siga pela adição de 20 µ l de solução-mãe de 100 x TCEP.
   4. Incube a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Re-ponte dissulfeto reduzido usando dibromomaleimide polietileno glicol (PEG-DB).
   1. Dissolva 0,0017 g de dibromomaleimide-polietileno glicol (PEG-DB) em 100 µ l de DMF.
   2. Adicione 680 µ l de solução de fosfato de sódio de 10 mM (pH 5,00).
   3. Adicionar reduzida Qβ na solução de DB-PEG e observar o processo de mistura sob uma lâmpada de UV 365 nm. A fluorescência amarela brilhante pode ser visualizada imediatamente com um 365 nm portátil UV lâmpada em cima da mistura.
   4. Deixe a reação prosseguir durante a noite em temperatura ambiente (RT) em um espeto.
3. Purificar a mistura de reação pelo filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) três vezes usando 1X PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
4. Monitore a conjugação, não reduzindo SDS-PAGE e eletroforese em gel de agarose nativo.
   Nota: VIPs executar como partículas intactas em gel de agarose nativo, e eles são separados com base em sua carga, tamanho e forma.

Resultados

Os derivados do dibromomaleimide podem ser sintetizados através da reação de condensação entre anidrido dibromomaleimide e aminas primárias¹⁵. Como alternativa, um método sintético suave¹⁶ usando N-metoxicarbonil ativado 3,4-dibromomaleimide aqui foi explorada por reagir com methoxypolyethylene glicol (PEG) de rendimento DB-PEG (Figura 1). NMR foi usado para identificar a estrutura de compostos (

Discussão

Comparado a purificação de proteínas menor, um único passo na purificação do bacteriófago Qβ é a centrifugação gradiente de sacarose. Após a etapa de extração de clorofórmio/n-butanol, Qβ ainda mais purified usando gradientes de sacarose 5-40%. Durante a centrifugação, as partículas são separadas com base em seus tamanhos. Partículas maiores viajam à região de densidade mais elevada, enquanto que partículas menores fica na região da baixa densidade. Qβ viaja para o terço inferior do gradiente e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth (Miller)	EMD Millipore	1.10285.0500
Tryptone, Poweder	Research Products International	T60060-1000.0
Yeast Extract, Poweder	Research Products International	Y20020-1000.0
Anhydrous magnesium sulfate	P212121	CI-06808-1KG
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Scientific	S271-10
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System	Fisher Scientific	4474524
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-1
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	P288-500
Sucrose	Fisher Scientific	S25590B
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818500
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor	Fisher Scientific	096-041053
Ammonium Sulfate	P212121	KW-0066-5KG
Chloroform	Alfa Aesar	32614-M6
1-Butanol	Fisher Scientific	A399-4
SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum	Beckman Coulter	342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set
Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,	Beckman Coulter	337922
Coomassie (Bradford) Protein Assay	Fisher Scientific	PI23200
TRIS Hydrochloride	Research Products International	T60050-1000.0
Tetramethylethylenediamine	Alfa Aesar	J63734-AC
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma Aldrich	C4706-2G
2 3-Dibromomaleimide 97%	Sigma Aldrich	553603-5G
Polythylene Glycol	Alfa Aesar	41561-22
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	AC424375000
Acrylamide/bis-Acrylamide	P212121	RP-A11310-500.0
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Aldrich	L3771-100G
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-100
FV3000 confocal laser scanning microscope	Olympus	FV3000
Labnet Revolver Adjustable Rotator	Thomas Scientific	1190P25
1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap	Thermo Scientific	010-1459
Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer	Thermo Scientific	3141-0250
Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC	Thermo Scientific	3117-0380
2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim	Pyrex	4980-2L
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	Millipore Sigma	UFC801024
M-110P Microfluidizer Materials Processor	Microfluidics	M-110P
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes	Thermo Scientific	3117-0380PK
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate	Beckman Coulter	41121703
Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL	PolyLab	80005
533LS-E Series Steam Sterilizers	Getinge	533LS-E
TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid	LabSource	D36-313-CS
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-959-53A
Microcentifuge Tube: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129
VWR Os-500 Orbital Shaker	VWR Scientifc Products	14005-830
Tetra Handcast systems	Bio-Rad	1658000FC
Polypropylene, 250 mL	Beckman Coulter	41121703
Spectrofluorometer NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	3300
Long Needle	Hamilton	7693
Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock	Fisher Scientific	14-841-46
P1000 Pipetman	Gilson	F123602
P200 Pipetman	Gilson	F123601
P100 Pipetman	Gilson	F123615
P20 Pipetman	Gilson	F123600
P10 Pipetman	Gilson	F144802
Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance	Intelligent Weighting Technology	IWT_PM100
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube	Fisher Scientific	14-432-22
4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl	Bio-Rad	456-1084