Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.

Zusammenfassung

Cochlea-Innenhaarzellen (IHCs) übertragen akustische Signale über Bandsynapsen an Spiralganglionneuronen (SGNs). Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass Haarzellsynapsen die ersten Ziele bei sensorineuralem Hörverlust (SNHL) sein können. Solche Studien haben das Konzept der Cochlea "Synaptopathie" vorgeschlagen, die sich auf Veränderungen der Bandsynapse Zahl, Struktur oder Funktion, die in abnormale synaptische Übertragung zwischen IHCs und SGNs führen bezieht. Während Cochlea-Synaptopathie irreversibel ist, wirkt sie sich nicht auf die Hörschwelle aus. In lärminduzierten Versuchsmodellen wird eine eingeschränkte Schädigung von IHC-Synapsen in ausgewählten Frequenzregionen eingesetzt, um die Umweltfaktoren zu identifizieren, die speziell Synaptopathie verursachen, sowie die physiologischen Folgen der Störung dieses Innenohrs. bahn. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Morphologie und Funktion der Cochlea-Synaptik bei erwachsenen Mäusen vor. In diesem Protokoll wird die Cochlea-Lokalisierung bestimmter Frequenzregionen mittels Ortsfrequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten durchgeführt, woraufhin die morphologischen Eigenschaften von Bandsynapsen mittels synaptischer Immunostaining. Der Funktionelle Status von Bandsynapsen wird dann auf der Grundlage der Amplituden der auditiven Brainstem Response (ABR) Welle I bestimmt. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieser Ansatz genutzt werden kann, um unser Verständnis der Pathogenese und Mechanismen der synaptischen Dysfunktion in der Cochlea zu vertiefen, die bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen können.

Einleitung

Frequenzen im Bereich von ca. 20bis220.000 Hz können vom Menschen als akustische Reize wahrgenommen werden. Das menschliche Gehör ist normalerweise am empfindlichsten in der Nähe von 1.000 Hz, wobei der durchschnittliche Schalldruckpegel bei jungen Erwachsenen bei 20 Pa liegt (d. h. 0 Dezibel Schalldruckpegel [dB SPL]). Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist der Hörverlust auf bestimmte Frequenzen beschränkt. Beispielsweise kann in den frühen Stadien des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) eine "Notch" (d. h. eine Höhe des Hörschwellenwerts) im Audiogramm bei 4 kHz¹beobachtet werden. Entlang der Cochlea-Partition des Säugetiers erzeugen ihre Abstufungen von Steifigkeit und Masse eine exponentielle Frequenzkarte mit hochfrequenter Schallerkennung an der Basis der Cochlea und Niederfrequenz-Detektion an der Spitze². Tatsächlich gibt es entlang der Basilarmembran eine Cochlea-Ortsfrequenzkarte, die zu der so genannten tonotopischen Organisation^2,3führt. Jeder angegebene Platz auf der Basilarmembran hat die höchste Empfindlichkeit gegenüber nur einer bestimmten Schallfrequenz, die in der Regel als charakteristische Frequenz^3,4bezeichnet wird, obwohl auch Reaktionen auf andere Frequenzen beobachtet werden können.

Bis heute wurden verschiedene Mausmodelle verwendet, um die normale Funktion, pathologische Prozesse und die therapeutische Wirksamkeit im Hörsystem zu untersuchen. Die genaue Kenntnis physiologischer Parameter in der Mauscochlea ist Voraussetzung für solche Studien zum Hörverlust. Die Maus-Cochlea ist anatomisch in apikale, mittlere und basale Drehungen unterteilt, die unterschiedlichen Frequenzbereichen entsprechen. Durch die Kennzeichnung von auditiven Nervenaffeen am Cochlea-Kern zur Analyse der entsprechenden peripheren Innervationsstellen in der Cochlea gelang es Müller et al. die Erstellung der Cochlea-Ortsfrequenzkarte in der normalen Maus in vivo⁵. Im Intervall von 7,2–61,8 kHz, was Positionen zwischen 90% und 10% der gesamten Länge der Basilarmembran entspricht, kann die Maus-Cochlea-Ortfrequenzkarte durch eine einfache lineare Regressionsfunktion beschrieben werden, was auf eine Beziehung zwischen normalisierter Abstand von der Cochlea-Basis und dem Logarithmus der Charakteristischen Frequenz⁵. Bei Labormäusen kann die Ortsfrequenzkarte verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen Hörschwellen innerhalb bestimmter Frequenzbereiche und Cochleogrammen zu untersuchen, die die Anzahl fehlender Haarzellen in relativen Regionen entlang der Basilarmembran⁶zeigen. Wichtig ist, dass die Ortsfrequenzkarte ein Positionierungssystem für die Untersuchung minimaler struktureller Schäden bietet, wie z. B. Schäden an den Bandsynapsen von Haarzellen an bestimmten Cochlea-Frequenzorten bei Mäusen mit peripherem Hörtrauma^{7 ,8}.

In der Säugetier-Cochlea bestehen Bandsynapsen aus einem präsynaptischen Band, einer elektronendichten Projektion, die einen Halo von freilos reifen synaptischen Vesikeln, die Glutamat im IHC enthalten, und einer postsynaptischen Dichte am Nerventerminal des SGN mit Glutamatrezeptoren⁹. Bei der Cochlea-Schalltransduktion führt die Ablenkung des Haarzellbündels zu einer IHC-Depolarisation, die zu einer Glutamatfreisetzung von IHCs auf die postsynaptischen affetischen Klemmen führt und so den Gehörweg aktiviert. Die Aktivierung dieses Weges führt zur Umwandlung schallinduzierter mechanischer Signale in einen Ratencode in der SGN¹⁰. Tatsächlich ist die IHC-Bandsynapse hochspezialisiert für unermüdliche Schallübertragung mit Raten von Hunderten von Hertz mit hoher zeitlicher Präzision und ist von entscheidender Bedeutung für präsynaptische Mechanismen der Klangcodierung. Frühere Studien haben gezeigt, dass Bandsynapsen stark in Größe und Anzahl in verschiedenen Frequenzregionen in der erwachsenen Maus Cochlea^11,12, wahrscheinlich reflektieren strukturelle Anpassung an die besondere Klangkodierung für Überlebensbedürfnisse. In jüngster Zeit haben experimentelle Tierstudien gezeigt, dass die Cochlea-Synaptopathie zu mehreren Formen von Hörstörungen beiträgt, einschließlich lärmbedingter Hörverluste, altersbedingter Hörverlust und erblichem Hörverlust^{13, 14}. So wurden Methoden zur Identifizierung korrelierter Veränderungen der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in bestimmten Frequenzregionen zunehmend in Studien zur auditiven Entwicklung und Der Inneren Ohrenkrankheit eingesetzt, indem Modelle verwendet wurden, die über experimentelle Manipulation von genetischen oder Umweltvariablen^15,16,17.

Im aktuellen Bericht stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in einem bestimmten Frequenzbereich der Basilarmembran bei erwachsenen Mäusen vor. Die Cochlea-Frequenzlokalisierung wird mit einer bestimmten Orts-Frequenz-Karte in Kombination mit einem Cochleogramm durchgeführt. Die normalen morphologischen Eigenschaften von Cochlea-Band-Synapsen werden mittels präsynaptischer und postsynaptischer Immunostainierung bewertet. Der Funktionszustand von Cochlea-Band-Synapsen wird anhand der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt. Bei geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll verwendet werden, um physiologische oder pathologische Bedingungen in anderen Tiermodellen, einschließlich Ratten, Meerschweinchen und Keimen, zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NRC/ILAR Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8. Auflage) durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Capital Medical University, Peking, China, genehmigt.

1. Tierauswahl

1. Für alle Experimente verwenden Sie erwachsene C57BL/6J männliche Mäuse (8 Wochen alt) als Tiermodell.
   HINWEIS: C57BL/6J-Mäuse, die eine Spleißvariante des Cdh23 tragen, zeigen eine beschleunigte Seneszenz im Hörsystem, die sich als 40%iger Verlust von Bandsynapsen an der Basaldrehung der Cochlea und einen Verlust von 10% in der mittleren Drehung um 6 Monate widerspiegelt, gefolgt von einem Zunahme dieses Verlustes in der gesamtenCochlea mit 18^Jahren,19. Daher raten wir zur Vorsicht bei der Verwendung von C57BL/6J Mäusen, die älter als 6 Monate für die auditive Forschung sind. Andere Stämme von Mäusen können je nach spezifischen experimentellen Zielen verwendet werden.
2. Untersuchen Sie die Mäuse mit einem professionellen diagnostischen Taschentooskop, um Äußere oder Mittelohrpathologien vor Höruntersuchungen auszuschließen. Mögliche Anzeichen können Flüssigkeit oder Eiter im äußeren Gehörgang, Rötung und Schwellung im lokalen Gewebe und tympanische Membranperforation sein.
   HINWEIS: Obwohl dies selten anzutreffen ist, sollten Mäuse mit Außen- oder Mittelohrerkrankungen ausgeschlossen werden, sobald sie identifiziert wurden.

2. Anhörungsprüfung

1. Anästhesisieren Von Mäusen mit einer intraperitonealen Injektion eines Gemischs aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg) und Xylazinhydrochlorid (10 mg/kg). Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie über schmerzhafte Reize (z.B. Zehen-Pinch-Reflex).
   HINWEIS: Wenn der Zehen-Pinch-Reflex vollständig fehlt, hat das Tier eine ausreichende Tiefe der Anästhesie für auditive Tests erreicht. Wenn mehr Zeit für bilaterale ABR-Aufnahmen benötigt wird, verabreichen Sie eine niedrigere Dosierung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosierung) von Anästhetika, um die ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. Achten Sie darauf, eine Anästhesie-Überdosierung zu vermeiden, da dies bei Mäusen zum Tod führen kann.
2. Halten Sie die Körpertemperatur des anästhesierten Tieres bei 37,5 °C mit einem thermoregulierenden Heizkissen. Legen Sie das anästhesierte Tier in einen elektrisch und akustisch abgeschirmten Raum, um Störungen während des gesamten Hörtestes zu vermeiden.
   HINWEIS: Halten Sie die physiologische Temperatur während des gesamten Eingriffs aufrecht, bis das Tier vollständig wach ist, um den Tod durch Unterkühlung nach der Anästhesie zu verhindern.
3. Subdermalen Nadelelektroden (20 mm, 28 G) am Scheitelpunkt des Schädels (Aufnahmeelektrode), im ipsilateralen Ohrspeicheldrüsenbereich unterhalb der Pinna des gemessenen Ohrs (Referenzelektrode) und im kontralateralen Ohrspeicheldrüsenbereich (Bodenelektrode) mit einer Tiefe von 3 mm unter der Haut des Mauskopfes, bzw.²⁰.
4. Verwenden Sie einen geschlossenen Lautsprecher, um eine akustische Stimulation über ein 2 cm großes Kunststoffrohr mit einer kegelförmigen Spitze durchzuführen. Die Spitze in den äußeren Gehörgang²¹einbauen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die elektrische Impedanz in den Aufnahme- und Referenzelektroden weniger als 3 kOhm (normalerweise 1 kOhm) beträgt. Wenn die Impedanz hoch ist, ändern Sie die Einfügestelle der Elektrode, reinigen Sie die Elektrode mit Alkohol oder ersetzen Sie die Elektrode, um Veränderungen in der ABR-Wellenamplitude zu vermeiden.
5. Erzeugen Sie für ABR-Aufnahmen Tonpips (3 ms Dauer, 1 ms Anstiegs-/Fallzeiten, mit einer Geschwindigkeit von 21,1/s, Frequenz: 4–48 kHz) und präsentieren Sie sie bei abnehmenden SPLs von 90 bis 10 dB in 5-u201210 dB SPL-Schritten²⁰. Während dieses Schritts werden die Antworten verstärkt (10.000 Mal), gefiltert (0,1–3 kHz) und gemittelt (1.024 Proben/Stimuluslevel).
   HINWEIS: ABRs werden für jede Stimulusstufe in 10 dB-Schritten gesammelt, mit zusätzlichen 5 dB-Schritten in der Nähe des Schwellenwerts.
6. Bestimmen Sie bei jeder Frequenz den ABR-Schwellenwert, der sich auf die minimale SPL bezieht, was zu einer zuverlässigen ABR-Aufzeichnung mit einer oder mehreren unterscheidbaren Wellen führt, die durch visuelle Inspektion eindeutig identifiziert werden können (Abbildung 1).
   HINWEIS: In der Regel ist es notwendig, den Prozess für niedrige SPLs um den Schwellenwert herum zu wiederholen, um die Konsistenz der Wellenformen zu gewährleisten. Die Ansprechschwelle ist die niedrigste Stimulusstufe, bei der die Wellenform beobachtet werden kann, wenn eine Abnahme von 5 dB zum Verschwinden der Wellenform führen würde.

3. Cochlea-Gewebeverarbeitung

1. Nach abR-Aufnahme, einschläfern die anästhesierten Mäuse durch Zervixdislokation, enthaupten sie, entblößen die Bulla von der ventralen Seite, und öffnen Sie mit scharfen Scheren, um Zugang zur Cochlea zu erhalten.
2. Entfernen Sie mit einer feinen Zange die zeitlichen Knochen, trennen Sie die Schlagmittelarterie, entfernen Sie die Bänder aus dem ovalen Fenster und brechen Sie die runde Fenstermembran. Machen Sie ein kleines Loch an der Spitze der Cochlea, indem Sie die Spitze einer Nadel (13 mm, 27 G) sanft drehen.
3. Fixieren Sie die isolierten Knochen mit 4% (wt/vol) Paraformaldehyd in 0,1 M phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4) über Nacht bei 4 °C. Mit einer feingekippten Pipette sanft fixieren durch die perilymphatischen Räume durch die Auftragen auf die ovalen oder runden Fenster (als Einlass) und die Öffnung an der Spitze (als Auslass).
   HINWEIS: Einige Proteine benötigen eine kurze Fixierungsdauer, um die Zerstörung ihrer Epitope für die Immunkennzeichnung zu vermeiden. In solchen Fällen, inkubieren Knochen in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur (RT) für 2 h, abhängig von den Anweisungen des Herstellers für Immunhistochemie. Die Fixierung kann auch über Herzperfusion durchgeführt werden, um das Cochlea-Blut zu entfernen, um Hintergrundgeräusche aufgrund unspezifischer Färbung in späteren Stadien zu vermeiden, insbesondere in Mausmodellen der Cochlea-Synaptopathie.
4. Spülen Sie die Knochen dreimal für 5 min mit 0,1 M kaltem PBS, um Restparaformaldehyd zu entfernen. Entkalkung der Knochen mit 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) entweder bei RT für 4 h oder bei 4 °C für 24 h durch sanftes Schütteln in einem horizontalen Shaker bei 20 Umdrehungen pro Minute. EDTA kann auf halbem Weg aktualisiert werden.
   HINWEIS: Die Entkalkungszeiten unterliegen der Konzentration von EDTA und den Vorlieben der Nutzer. Entkalktes Gewebe sollte ein gewisses Maß an Zähigkeit beibehalten, was die Manipulation der Isolierung von Cochlea-Vollteilen in späteren Schritten erleichtert. Temporale Knochen können in 10% EDTA mit Rotation entkalkt werden, so dass Forscher das Labor nach ABR-Tests und Fixierungsexperimenten verlassen können. Die Entkalkungszeit ist flexibel im Bereich von 20 bis 30 h bei 4 °C.
5. Übertragen Sie einen entkalkten Temporalknochen von EDTA auf 0,1 M PBS. Verwenden Sie #3, #5 Dumont Zange und die 27 G Nadel, um die apikalen, mittleren und basalen Cochlea-Regionen nacheinander zu sezieren und dann die Cochlea aus dem Knochen unter einem Stereo-Sektionsmikroskop zu sezieren (wie zuvor beschrieben²²). Machen Sie eine Reihe von kleinen Schnitten entlang des Spiralbandes mit einer Rasierklinge, und entfernen Sie die tektoriale Membran und Reissners Membran (Abbildung 2).
   HINWEIS: Solange die sezierte Cochlea intakt ist, kann dieser Prozess entsprechend dem üblichen Protokoll des einzelnen Bedieners modifiziert werden.
6. Weitere sezieren sie das verbleibende auditive Epithel einschließlich des spiralförmigen Limbus in einzelne Cochlea-Drehungen (Apex, Mitte und Basis mit Hakenbereich) für Vollmontagepräparate.
7. Messen Sie unter einem 40-fachen Ölobjektiv eines Lichtmikroskops die Basilarmembranlänge mit einer Skala von 250 m im Okular, die entlang der Stereocilia der IHCs eingestellt werden kann.
8. Berechnen Sie die Länge jeder Cochlea-Drehung, indem Sie alle Segmentlängen (250 m pro Segment) hinzufügen, und erhalten Sie gleichzeitig die Gesamtlänge der Basilarmembran, indem Sie die Längen jedes Zuges summieren.
9. Konvertieren Sie die Gesamtlänge der Basilarmembran einschließlich der Hakenregion in einen Prozentsatz basierend auf dem Abstand von der Cochlea-Spitze (0% bezieht sich auf die Cochlea-Spitze, 100% auf die Cochlea-Basis).
10. Konvertieren Sie diesen Abstand in die Cochlea-Kennfrequenz mit einer logarithmischen Funktion (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 x log(f), mit einer Neigung von 1,25 mm/Oktave der Frequenz, wobei d der normalisierte Abstand vom Cochlea-Apex in Prozent ist, f ist Frequenz in kHz), wie zuvor beschrieben^5,6. So kann ein Frequenzbereich in einem entsprechenden Bereich der Basilarmembran an jeder Cochlea-Drehung erfasst werden.

4. Immunfluoreszenz Färbung

1. Nach der Zerlegung jede Cochlea-Drehung in ein separates 2,5 ml Zentrifugenrohr legen und Cochlea-Drehungen in 10% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 für 1 h bei RT auf einem Rotator inkubieren.
2. Entfernen Sie die oben genannte Blockier-/Permeabilisierungslösung aus jedem Rohr mit einer 200-L-Pipettenspitze unter einem Seziermikroskop und inkubieren Sie die Proben mit primär in 5% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 über Nacht bei 4 °C auf einem Rotator verdünnten Primärantikörpern.
   HINWEIS: Für die Immunolabeling von Cochlea-Synaptikbändern verwenden Sie die präsynaptische Markermaus Anti-Carboxyl-Terminal-Bindungsprotein 2 IgG1 (CtBP2, Kennzeichnung der B-Domäne des RIBEYE Gerüstproteins, 1:400) und den postsynaptischen Marker-Maus-Antiglutamatrezeptor 2 IgG2a (GluR2, Beschriftung einer Untereinheit des AMPA-Rezeptors, 1:200)²³.
3. Spülen Sie dreimal für 5 min mit 0,1 M kaltem PBS, um die verbleibenden primären Antikörper zu entfernen und die Proben mit sekundären Antikörpern zu bebrüten, die in 5% Ziegenserum/PBS/0,1% Triton X-100 bei RT für 2-u20123 h in Dunkelheit auf einem Rotator verdünnt werden.
   HINWEIS: Bereiten Sie geeignete sekundäre Antikörpermischungen mit Ziegenanti-Maus Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) und Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 4.2 verwendet. Um die Etikettiereffizienz für synaptische Bänder zu verbessern, empfehlen wir die Auswahl spezifischer sekundärer Antikörper. Einige Labore erweitern die Inkubation mit sekundären Antikörpern, um die GluR2-Immunkennzeichnung zu erhöhen²⁴.
4. Spülen Sie dreimal für 5 min mit 0,1 M PBS, um sekundäre Restantikörper zu entfernen und die Proben von 2,5 ml Zentrifugenrohren auf 35-mm-Platten mit 0,1 M PBS zu übertragen.
5. Legen Sie einen Tropfen Desonstfolge mit 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) auf das Dia und übertragen Sie die Proben von PBS auf das Montagemedium. Legen Sie eine Kante eines Deckelslips auf die Rutsche und lassen Sie sie los, damit der Deckelrutsch sanft fällt.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Haarzellen nach oben zeigen und während des Eingriffs keine Faltung oder Verdrehung von Cochlea-Proben erfolgt, montieren Sie Cochlea-Proben unter einem Stereo-Dissektionsmikroskop.
6. Legen Sie die Dias über Nacht bei 4 °C in eine Diabox, um die Dias trocknen zu lassen und dann unter einem laserkonfokalen Mikroskop abzubilden.

5. Morphologische Bewertung von Cochlea-Band-Synapsen

1. Bilddiaglyse mit einem konfokalen Mikroskop mit drei Lasern – einer 405 nm UV-Diode, einem 488 nm Argonlaser und einem 561 nm Dioden-gepumpten Festkörperlaser (DPSS) zur Anregung von DAPI (Erregungsspektrum 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (Erregungsspektrum 496–549 nm) und Alexa Fluor 568 (Erregungsspektrum 573–631 nm).
2. Erwerben Sie konfokale Z-Stacks über eine Entfernung von 8 m von jeder Cochlea-Drehung mit einer 63-fachhochauflösenden Öl-Tauchlinse.
   HINWEIS: Nach der Definition sollten alle Parameter für die Digitalisierung von Photomikroskopen gespeichert und gleichmäßig auf alle Folien angewendet werden.
3. Legen Sie für die Anzahl der synaptischen Punktzeichen die Z-Stacks (0,3 m Schrittgröße) so fest, dass sie die gesamte Länge der IHCs überspannen, um sicherzustellen, dass alle synaptischen Punktzeichen abgebildet werden können.
4. Führen Sie die Bilder, die Punktzeichen enthalten, in einem Z-Stack zusammen, um die Z-Achsen-Projektion zu erhalten, und importieren Sie sie in die Bildverarbeitungssoftware.
5. Teilen Sie die synaptischen Gesamtanzahl in jedem Z-Stack in bestimmten Frequenzbereichen durch die Anzahl der IHCs (gleich der DAPI-Kernmanuellanzahl), um die Anzahl der synaptischen Punktzeichen für jeden IHC zu berechnen. In jedem bestimmten Frequenzbereich durchschnittlich alle synaptischen Punktzeichen in drei Bildern verschiedener mikroskopischer Felder, die 9–11 IHCs enthalten.
   1. Beschreiben Sie die Interessenregion (ROIs), einschließlich der basolateralen Regionen jedes IHC, indem Sie die Freihandauswahl-Schaltfläche verwenden. Verwenden Sie die Messfunktion für die automatische Quantifizierung von Punktzeichen und die Wasserscheidefunktion, um zwischen eng angrenzenden Stellen zu unterscheiden.
   2. Führen Sie nach jeder automatisierten Zählung visuelle Inspektionen mit manuellen Korrekturen durch, um die Pünktlichkeitszählung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Experimentatoren sollten geblendet bleiben, ob die Rutsche von der Spitze, der Mitte oder der Basaldrehung der Cochlea stammt.
6. Bewerten Sie die synaptische Struktur und Verteilung visuell, um einzelne IHCs mit dem Bleistiftwerkzeug (M) manuell von ihren Nachbarn zu isolieren, um die zytoskelettale Architektur und die synaptische Lokalisierung besser zu visualisieren.
7. Um die Gegenüberstellung von präsynaptischen Bändern (CtBP2) und postsynaptischen Rezeptor-Patches (GluR2) zu untersuchen, extrahieren Sie den Voxel-Raum um band durch das Rechteckige Marquee-Tool und isolieren Sie einzelne Band von Crop. Durch Klicken auf Bild > Bildgröße,erwerben Sie ein Thumbnail-Array dieser Miniaturprojektionen, die dann verwendet werden können, um gepaarte Synapsen (erscheint als eng nebeneinander ierte Paare von CtBP2-positive und GluR2-positive Punktias) im Vergleich zu verwaisten Bänder (fehlende postsynaptische Glutamatrezeptor-Pflaster) (Abbildung 3).
   HINWEIS: Normale Cochlea-Synapsen erscheinen als kombinierte Immunlabelierung des präsynaptischen Bandes innerhalb der Haarzelle (Anti-CtBP2) und des postsynaptischen Glutamatrezeptor-Patches am Hörnerv -Terminal (Anti-GluR2)²⁵. Einige Labore verwenden konfokale Projektionen in Verbindung mit 3D-Modellierung, um synaptische Patchgröße oder Volumen^26,27zu quantifizieren. Vor dem signifikanten Verlust von Band synapsen, Bänder mit Änderungen in der Größe oder ohne gepaarte Glutamat-Rezeptor-Patches sind wahrscheinlich Anzeichen für synaptische Dysfunktion^27,28.

6. Funktionelle Bewertung von Cochlea-Band Synapsen

1. Sammeln Sie alle ABR-Wellen für jeden Frequenzreiz, der bei einer SPL von 90 dB für die Analyse suprathresholdr ABR-Welle-I-Amplituden dargestellt wird.
   HINWEIS: Neurophysiologische und morphologische Studien haben gezeigt, dass niedrige spontane, hochschwellige Fasern besonders anfällig für Alterung und Lärmexposition sind^29,30. Obwohl der einfache Verlust von Bandsynapsen die ABR-Schwellenwerte nicht beeinflussen kann, führt er häufig zu signifikanten Reduktionen der ABR-Welle-I-Amplituden, da diese Afferents einschließlich niedriger spontaner, hochschwelliger Fasern und hoher spontaner niedrigschwellige Fasern tragen stark zu den summierten Aktivitäten der Cochlea-Nervenfasern^28,29,31bei. Hier wird eine suprathreshold Intensität von 90 dB SPL ausgewählt.
2. Bestimmen Sie die Amplitude von Peak-to-Peak I mithilfe eines Offline-Analyseprogramms (Abbildung 4). Jede Welle I im ABR-Test besteht aus einer beginnenden positiven (p) Verformung und der anschließenden negativen (n) Verformung. ABR-Welle I Amplitude ist definiert als die Spannungsdifferenz zwischen Ip (der positive Spitze der Welle I) und In (der negative Peak der Welle I)²⁹.
   HINWEIS: Unter pathologischen Bedingungen kann die Cochlea-Synaptopathie auf der Grundlage der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt werden, die die summierten Beginnreaktionen von SGNs widerspiegeln, die durch den Klang evoziert werden. Jedoch, Cochlea-Empfindlichkeit, die nicht durch OHC Dysfunktion beeinträchtigt wird, ist eine Voraussetzung für diese Methode.

Ergebnisse

ABR-Hörtests wurden an 10 C57BL/6J-Mäusen (8 Wochen alt) unter Anästhesie durchgeführt. ABRs wurden mit Tonburstreizen bei 4, 8, 16, 32 und 48 kHz ausgelöst. Die Hörschwelle jedes Tieres wurde visuell durch die Unterscheidung von mindestens einer klaren Wellenform im ABR festgestellt. Alle Mäuse wiesen ABR-Schwellenwerte als Reaktion auf Tonausbrüche auf, die je nach Frequenz des Stimulus zwischen 25 und 70 dB SPL lagen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hörschwelle mit 16 kHz am niedrigsten war (

Diskussion

Da die Cochlea-Synaptopathie erstmals bei erwachsenen Mäusen mit einer temporären Schwellenverschiebung (TTS) charakterisiert wurde, die durch 8-u201216 kHz Oktavbandrauschen bei 100 dB SPL für 2 h³¹induziert wurde, haben Forscher die Auswirkungen der Synaptopathie in verschiedenen Säugetiere, einschließlich Affen und Menschen^32,33. Neben der Lärmexposition wurden mehrere andere Erkrankungen mit cochlea-Synaptopathie in Verbindung ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine hydrochloride	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10 mg/kg
TDT physiology apparatus	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
Electric Pad	Pet Fun	11072931136
Dumont forceps 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0203-3-PO
Dumont forceps 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0209-5-PO
Stereo dissection microscope	Nikon Corp., Tokyo, Japan	SMZ1270
Goat serum	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	MAB397	mouse
Purified Mouse Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	mouse
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21131	goat
Mounting medium containing DAPI	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS SP8 II
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China	HS-OT10
Needle electrode	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China	1029	20 mm, 28 G
Closed-field speaker	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	CF1