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Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Résumé

Les cellules ciliées intérieures cochléaires (IHC) transmettent des signaux acoustiques aux neurones de ganglion en spirale (SGN) par des synapses de ruban. Plusieurs études expérimentales ont indiqué que les synapses de cellules capillaires peuvent être les cibles initiales dans la perte d'audition neuro-sensorielle (SNHL). Ces études ont proposé le concept de « synaptopathie » cochléaire, qui se réfère aux altérations du nombre, de la structure ou de la fonction de synapse de ruban qui ont comme conséquence la transmission synaptique anormale entre iHCs et SGNs. Bien que la synaptopathie cochléaire soit irréversible, elle n'affecte pas le seuil auditif. Dans les modèles expérimentaux induits par le bruit, des dommages limités aux synapses du CSI dans certaines régions de fréquence sont utilisés pour identifier les facteurs environnementaux qui causent spécifiquement la synaptopathie, ainsi que les conséquences physiologiques de déranger cette oreille interne. circuit. Ici, nous présentons un protocole pour analyser la morphologie synaptique cochléaire et fonctionner à une région de fréquence spécifique chez les souris adultes. Dans ce protocole, la localisation cochléaire des régions de fréquence spécifiques est effectuée à l'aide de cartes de fréquence synaptique en conjonction avec des données de cochléogramme, après quoi les caractéristiques morphologiques des synapses de ruban sont évaluées par l'intermédiaire synaptique Immunomarquage. L'état fonctionnel des synapses de ruban est alors déterminé basé sur les amplitudes de la réponse auditive de tronc cérébral (ABR) vague I. Le présent rapport démontre que cette approche peut être utilisée pour approfondir notre compréhension de la pathogénie et des mécanismes du dysfonctionnement synaptique dans la cochlée, qui peut aider au développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

Introduction

Les fréquences de l'ordre d'environ 20'u201220,000 Hz peuvent être perçues comme des stimuli auditifs par les humains. L'audition humaine est normalement plus sensible près de 1 000 Hz, où le niveau moyen de pression sonore est de 20 degrés Pa chez les jeunes adultes (c.-à-d. 0 décibels de niveau de pression sonore [dB SPL]). Dans certaines conditions pathologiques, la perte auditive est limitée à des fréquences spécifiques. Par exemple, dans les premiers stades de la perte auditive causée par le bruit (NIHL), une « encoche » (c.-à-d. l'élévation du seuil auditif) peut être observée dans l'audiogramme à 4 kHz1. Le long de la partition cochléaire des mammifères, ses gradations de rigidité et de masse produisent une carte de fréquence exponentielle, avec détection sonore à haute fréquence à la base de la cochlée et détection à basse fréquence au sommet2. En effet, il existe une carte cochléaire de la fréquence des lieux le long de la membrane basilaire, menant à ce qu'on appelle l'organisation tonotopic2,3. Chaque endroit donné sur la membrane basilaire a la plus grande sensibilité à une seule fréquence sonore particulière, qui est généralement appelée la fréquence caractéristique3,4, bien que des réponses à d'autres fréquences peuvent également être observées.

À ce jour, divers modèles de souris ont été utilisés pour étudier la fonction normale, les processus pathologiques et l'efficacité thérapeutique dans le système auditif. La connaissance précise des paramètres physiologiques dans la cochlée de souris est une condition préalable à de telles études de la perte auditive. La cochlée de souris est anatomiquement divisée en tours apaïques, moyens et basaux, qui correspondent à différentes régions de fréquence. En étiquetant les afferents de nerf auditif au noyau cochléaire pour analyser leurs emplacements périphériques correspondants d'innervation dans la cochlée,M. et autres ont réussi à établir la carte cochléaire de lieu-fréquence dans la souris normale in vivo 5. Dans l'intervalle de 7,2 à 61,8 kHz, ce qui correspond à des positions comprises entre 90 % et 10 % de la longueur complète de la membrane basilaire, la carte cochléaire de la fréquence cochléaire de la souris peut être décrite par une simple fonction de régression linéaire, suggérant une relation entre les distance normalisée de la base cochléaire et du logarithme de la fréquence caractéristique5. Chez les souris de laboratoire, la carte place-fréquence peut être utilisée pour explorer la relation entre les seuils auditifs dans des plages de fréquences spécifiques et les cochléogrammes montrant le nombre de cellules ciliées manquantes dans les régions relatives le long de la membrane basilaire6. Fait important, la carte place-fréquence fournit un système de positionnement pour l'étude des dommages structurels minimaux, tels que des dommages aux synapses de ruban des cellules de cheveux à des endroits spécifiques de fréquence cochléaire chez les souris avec le trauma auditif périphérique7 ,8.

Dans la cochlée des mammifères, les synapses de ruban sont composées d'un ruban présynaptique, d'une projection dense d'électrons qui attache un halo de vésicules synaptiques prêtes à libérer contenant du glutamate au sein du CSI, et d'une densité postsynaptique sur le terminal nerveux du SGN avec des récepteurs de glutamate9. Pendant la transduction cochléaire de bruit, la déviation du faisceau de cellules de cheveux a comme conséquence la dépolarisation d'IHC, qui mène à la libération de glutamate des IHCs sur les bornes afferents postsynaptic, activant de ce fait la voie auditive. L'activation de cette voie conduit à la transformation des signaux mécaniques induits par le son en un code de taux dans le SGN10. En effet, la synapse ruban IHC est hautement spécialisée pour la transmission sonore infatigable à des taux de centaines de Hertz avec une haute précision temporelle, et est d'une importance critique pour les mécanismes presynaptiques de codage sonore. Des études antérieures ont révélé que les synapses de ruban varient considérablement en taille et en nombre à différentes régions de fréquence dans la cochlée adulte de souris11,12, reflétant probablement l'adaptation structurale au codage sonore particulier pour besoins de survie. Récemment, des études expérimentales sur les animaux ont démontré que la synaptopathie cochléaire contribue à de multiples formes de déficiences auditives, y compris la perte auditive causée par le bruit, la perte auditive liée à l'âge et la perte auditive héréditaire13, 14. Ainsi, les méthodes d'identification des changements corrélés dans le nombre, la structure et la fonction synaptiques à des régions de fréquence spécifiques ont été de plus en plus employées dans les études du développement auditif et de la maladie de l'oreille interne, utilisant des modèles générés par l'intermédiaire manipulation expérimentale des variables génétiques ou environnementales15,16,17.

Dans le rapport actuel, nous présentons un protocole pour analyser le nombre synaptique, la structure, et la fonction à une région spécifique de fréquence de la membrane basilaire chez les souris adultes. La localisation de la fréquence cochléaire est effectuée à l'aide d'une carte de fréquence de lieu donnée en combinaison avec un cochléogramme. Les caractéristiques morphologiques normales des synapses de ruban cochléaire sont évaluées par immunostaining presynaptic et postsynaptic. L'état fonctionnel des synapses de ruban cochléaire est déterminé en fonction des amplitudes supraseuils de l'onde I de l'ABR. Avec des altérations mineures, ce protocole peut être utilisé pour examiner les conditions physiologiques ou pathologiques dans d'autres modèles animaux, y compris les rats, les cobayes et les gerbilles.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide du CNRC/ILAR pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire (8e édition). Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université médicale de la capitale, Beijing, Chine.

1. Sélection des animaux

  1. Pour toutes les expériences, utilisez des souris mâles adultes C57BL/6J (8 semaines) comme modèle animal.
    REMARQUE: Les souris c57BL/6J portant une variante d'épissage du Cdh23 présentent une sénescence accélérée dans le système auditif, reflétée comme une perte de 40% de synapses de ruban au tour basal de la cochlée et une perte de 10% au tour moyen par 6 mois d'âge, suivie d'une perte rapide augmentation de cette perte dans l'ensemble de la cochlée avec l'âgede 18,19. Ainsi, nous conseillons la prudence en utilisant des souris C57BL/6J de plus de 6 mois pour la recherche auditive. D'autres souches de souris peuvent être utilisées en fonction d'objectifs expérimentaux spécifiques.
  2. Inspectez les souris à l'aide d'un otoscope de poche diagnostique professionnel pour éliminer les pathologies de l'oreille externe ou moyenne avant les évaluations auditives. Les signes potentiels peuvent inclure le fluide ou le pus dans le canal auditif externe, la rougeur et l'enflure dans les tissus locaux, et la perforation de membrane tympanique.
    REMARQUE: Bien que cela soit rarement rencontré, une fois identifié, les souris atteintes de maladies de l'oreille externe ou moyenne devraient être exclues.

2. Évaluation auditive

  1. Anesthésiez les souris à l'aide d'une injection intrapéritonéale d'un mélange d'hydrochlorure de kétamine (100 mg/kg) et d'hydrochlorure de xylazine (10 mg/kg). Jugez la profondeur de l'anesthésie par des stimuli douloureux (p. ex., réflexe de pincement des orteils).
    REMARQUE: Lorsque le réflexe de pincement des orteils est complètement absent, l'animal a atteint une profondeur adéquate d'anesthésie pour les tests auditifs. Si plus de temps est nécessaire pour les enregistrements bilatéraux ABR, administrer une dose plus faible (un cinquième de la dose initiale) d'anesthésiques pour restaurer le plan anesthésique d'origine. Prenez soin d'éviter les surdosages anesthésiques, car cela peut conduire à la mort chez les souris.
  2. Maintenir la température corporelle de l'animal anesthésié à 37,5 oC à l'aide d'un coussin chauffant thermorégulateur. Placez l'animal anesthésié dans une pièce électriquement et acoustiquement protégée pour éviter les interférences tout au long de l'essai auditif.
    REMARQUE: Maintenir la température physiologique pendant toute la procédure jusqu'à ce que l'animal soit totalement éveillé, afin d'éviter la mort causée par l'hypothermie post-anesthésie.
  3. Placer les électrodes d'aiguille subdermiques (20 mm, 28 G) au sommet du crâne (électrode d'enregistrement), dans la région parotide ipsilatérale sous la pinna de l'oreille mesurée (électrode de référence), et dans la région parotide contralatérale (électrode souterraine), avec une profondeur de 3 mm sous la peau de la tête de souris, respectivement20.
  4. Utilisez un haut-parleur à champ fermé pour effectuer une stimulation acoustique via un tube en plastique de 2 cm avec une pointe en forme de cône. Ajuster la pointe dans le conduit auditif externe21.
    REMARQUE: Assurez-vous que l'impédance électrique dans les électrodes d'enregistrement et de référence est inférieure à 3 kOhm (habituellement 1 kOhm). Si l'impédance est élevée, modifiez le site d'insertion de l'électrode, nettoyez l'électrode par de l'alcool ou remplacez l'électrode pour éviter les altérations de l'amplitude des ondes ABR.
  5. Pour l'enregistrement ABR, générer des pépins de tonalité (durée de 3 ms, 1 ms de montée/temps de chute, à un taux de 21,1/s, fréquence : 4 à 48 kHz) et les présenter à des SPL décroissants de 90 à 10 dB en 5'u201210 dB SPL étapes20. Au cours de cette étape, les réponses sont amplifiées (10 000 fois), filtrées (0,1 à 3 kHz) et moyennes (1 024 échantillons/niveau de stimulation).
    REMARQUE: Les AAR sont collectés pour chaque niveau de stimulus en 10 étapes dB, avec 5 étapes dB supplémentaires près du seuil.
  6. À chaque fréquence, déterminez le seuil ABR, qui se réfère au SPL minimal résultant en un enregistrement ABR fiable avec une ou plusieurs ondes distinguables qui peuvent être clairement identifiés par l'inspection visuelle (figure 1).
    REMARQUE: Il est généralement nécessaire de répéter le processus pour les sPL faibles autour du seuil pour assurer la cohérence des formes d'onde. Le seuil de réponse est le niveau de stimulus le plus bas auquel la forme d'onde peut être observée, quand une diminution de 5 dB conduirait à la disparition de la forme d'onde.

3. Traitement des tissus cochléaires

  1. Après l'enregistrement ABR, euthanasiez les souris anesthésiées par dislocation cervicale, décapitez-les, exposez les taureaux du côté ventral, et ouvrez avec des ciseaux pointus pour accéder à la cochlée.
  2. À l'aide d'un fine forceps, retirez les os temporels, couper l'artère des stapes, retirer les rubans de la fenêtre ovale et rompre la membrane de la fenêtre ronde. Faire un petit trou au sommet de la cochlée en tournant doucement la pointe d'une aiguille (13 mm, 27 G).
  3. Fixez les os isolés avec 4 % (wt/vol) de paraformaldéhyde dans une saline tamponnée de 0,1 M de phosphate (PBS, pH 7,4) pendant la nuit à 4 oC. À l'aide d'une pipette à pointe fine, rincer doucement le fixatif à travers les espaces périlymphatiques par application aux fenêtres ovales ou rondes (comme une infusion) et l'ouverture à l'apex (comme une prise).
    REMARQUE: Certaines protéines nécessitent une courte durée de fixation pour éviter la destruction de leurs épitopes pour l'immunolabeling. Dans de tels cas, incuber les os dans 4% de paraformaldéhyde à température ambiante (RT) pendant 2 h, selon les instructions du fabricant pour l'immunohistochimie. La fixation peut également être effectuée par perfusion cardiaque pour enlever le sang cochléaire, en évitant le bruit de fond dû à la coloration non spécifique à des stades ultérieurs, en particulier dans les modèles de souris de la synaptopathie cochléaire.
  4. Rincer les os trois fois pendant 5 min avec 0,1 M de PBS froid pour enlever le paraformaldéhyde résiduel. Décalcifier les os avec 10% d'acide éthylènediaminetetratraacetic (EDTA) soit à RT pendant 4 h soit à 4 oC pour 24 h par secousses douces dans un shaker horizontal à 20 tr/min. EDTA peut être actualisé à mi-chemin.
    REMARQUE: Les temps de décalcification sont soumis à la concentration de l'EDTA et aux préférences des utilisateurs. Le tissu décalcifié devrait maintenir un certain degré de dureté, ce qui facilite la manipulation des montures entières cochlaires isolants à des étapes ultérieures. Les os temporels peuvent être décalcifiés en 10% EDTA avec rotation, permettant aux chercheurs de quitter le laboratoire après des tests ABR et des expériences de fixation. Le temps de décalcification est flexible dans la fourchette de 20 à 30 h à 4 oC.
  5. Transférer un os temporel décalcifié de l'EDTA à 0,1 M PBS. Utilisez #3, #5 les forceps Dumont et l'aiguille de 27 G pour disséquer les régions cochléaires apaniques, moyennes et basiques à tour de rôle, puis disséquer la cochlée hors de l'os sous un microscope stéréo de dissection (comme décrit précédemment22). Faire une série de petites coupures le long du ligament spiralé à l'aide d'une lame de rasoir, et enlever la membrane tectoriale et la membrane de Reissner (Figure 2).
    REMARQUE: Tant que la cochlée disséquée est intacte, ce processus peut être modifié selon le protocole habituel de l'opérateur individuel.
  6. Disséquer davantage l'épithélium auditif restant, y compris le limbus spiralé en virages cochléaires individuels (apex, milieu et base avec la région du crochet) pour les préparations de montage entier.
  7. Dans le cadre d'un objectif 40x huile d'un microscope léger, mesurer la longueur de la membrane basilaire avec une échelle de 250 m placé dans l'oculaire, qui peut être ajusté le long des stéréocilia des IHC.
  8. Calculez la longueur de chaque virage cochléaire en ajoutant toutes les longueurs de segment (250 m par segment), et obtenez en même temps la longueur totale de la membrane basilaire en résumant les longueurs de chaque tour.
  9. Convertir la longueur totale de la membrane basilaire, y compris la région du crochet, en un pourcentage basé sur la distance de l'apex cochléaire (0 % se réfère à l'apex cochléaire, 100 % à la base cochléaire).
  10. Convertir cette distance en fréquence caractéristique cochléaire à l'aide d'une fonction logarithmique (d(%) 1 - 156,5 - 82,5 ' log(f), avec une pente de 1,25 mm/octave de fréquence, où d est la distance normalisée de l'apex cochléaire en pour cent, f est la fréquence en kHz), comme décrit précédemment5,6. Ainsi, une portée de fréquence dans une zone correspondante de la membrane basilaire sur chaque tour cochléaire peut être acquise.

4. Staining immunofluorescence

  1. Après la dissection, placez chaque tour cochléaire dans un tube de centrifugeuse séparé de 2,5 ml et incubez les virages cochléaires dans 10 % de sérum de chèvre/PBS/0,1 % Triton X-100 pour 1 h à RT sur un rotateur.
  2. Retirez la solution de blocage/perméabilisation ci-dessus de chaque tube à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l sous un microscope de dissection et incubez les spécimens avec des anticorps primaires dilués dans un sérum de chèvre/PBS/0,1 % Triton X-100 pendant la nuit à 4 oC sur un rotateur.
    REMARQUE: Pour l'immunolabeling des rubans synaptiques cochléaires, utilisez le marqueur présynaptique souris anti-carboxyl-terminal protéine de liaison 2 IgG1 (CtBP2, étiquetant le domaine B de la protéine d'échafaudage RIBEYE, 1:400) et le récepteur anti-glutamate de marqueur postsynaptique de souris 2 IgG2a (GluR2, étiquetage d'une sous-unité du récepteur AMPA, 1:200)23.
  3. Rincer trois fois pendant 5 min avec 0,1 M PBS froid pour enlever les anticorps primaires résiduels et incuber les spécimens avec des anticorps secondaires dilués dans 5% de sérum de chèvre/PBS/0,1% Triton X-100 à RT pour 2'u20123 h dans l'obscurité sur un rotateur.
    REMARQUE : Préparer les mélanges d'anticorps secondaires appropriés à l'aide de la chèvre anti-souris Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) et de l'antisouris de chèvre Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), qui sont complémentaires aux anticorps primaires utilisés à l'étape 4.2. Pour améliorer l'efficacité de l'étiquetage des rubans synaptiques, nous vous recommandons de sélectionner des anticorps secondaires spécifiques. Certains laboratoires prolongent l'incubation avec des anticorps secondaires pour augmenter l'immunoétiquetage GluR224.
  4. Rincer trois fois pendant 5 min avec 0,1 M PBS pour enlever les anticorps secondaires résiduels et transférer les spécimens des tubes centrifugeurs de 2,5 ml à des plaques de 35 mm contenant 0,1 M de PBS.
  5. Placez une goutte de milieu de montage contenant 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) sur la diapositive et transférez les spécimens de PBS au milieu de montage. Placez un bord d'une glissière de couverture sur la glissière et relâchez pour laisser tomber doucement le borderon.
    REMARQUE: Pour s'assurer que les cellules ciliées font face vers le haut et qu'aucun pliage ou torsion des spécimens cochléaires ne se produit pendant la procédure, montez des spécimens cochléaires sous un microscope stéréo de dissection.
  6. Placez les diapositives dans une boîte à glissière à 4 oC pendant la nuit pour laisser sécher les diapositives, puis l'image sous un microscope focal laser.

5. Évaluation morphologique des synapses de ruban cochléaire

  1. Diapositives d'image à l'aide d'un microscope confocal avec trois lasers : une diode UV de 405 nm, un laser argon de 488 nm et un laser à état solide à diode de 561 nm (DPSS) pour exciter DAPI (Spectre d'excitation 409 à 464 nm), Alexa Fluor 488 (spectre d'excitation 496 à 549 nm) et Alexa Fluor 568 nm (Spectre d'excitation 573-631 nm), respectivement.
  2. Acquérir des z-stacks confocals sur une distance de 8 m à partir de chaque virage cochléaire à l'aide d'une lentille d'immersion à haute résolution de 63x.
    REMARQUE: Une fois définis, tous les paramètres de numérisation des photomicrographes doivent être enregistrés et appliqués uniformément sur toutes les diapositives.
  3. Pour les nombres de ponctumes synaptiques, définir les z-stacks (taille de l'étape de 0,3 m) pour couvrir toute la longueur des CSI, assurant ainsi que toutes les ponctuas synaptiques peuvent être représentées.
  4. Fusionner les images contenant puncta dans une z-pile pour obtenir la projection z-axe, et l'importation au logiciel de traitement d'image.
  5. Divisez les nombres totaux synaptiques dans chaque z-pile à des régions de fréquence spécifiques par le nombre de CSI (égal au compte manuel nucléaire DAPI) pour calculer le nombre de ponctuas synaptiques pour chaque IHC. À chaque région de fréquence spécifique, la moyenne de toutes les ponctuas synaptiques en trois images de différents champs microscopiques contenant des IHC 9-11.
    1. Décrivez la région d'intérêt (ROI) y compris les régions basolatérales de chaque CSI à l'aide du bouton de sélection à main levée. Utilisez la fonction de mesure pour la quantification automatique de la poncte, et la fonction de bassin versant pour distinguer entre les taches étroitement adjacentes.
    2. Après chaque comptage automatisé, effectuez des inspections visuelles avec des corrections manuelles pour assurer le comptage des ponctuas fiable.
      REMARQUE: Les expérimentateurs doivent rester aveuglés quant à savoir si la diapositive est de l'apex, milieu, ou tour basal de la cochlée.
  6. Évaluer visuellement la structure et la distribution synaptiques, afin d'isolermanuellement les CSI individuels de leurs voisins par l'outil crayon ( M ) afin de mieux visualiser l'architecture cytosquelettique et la localisation synaptique.
  7. Pour inspecter la juxtaposition des rubans présynaptiques (CtBP2) et des patchs récepteurs postsynaptiques (GluR2), extraire l'espace voxel autour du ruban par l'outil Rectangulaire Marquee et isoler le ruban individuel par Crop. En cliquant sur Image 'gt; Image Size, acquérir un tableau miniature de ces projections miniatures, qui peuvent ensuite être utilisés pour identifier les synapses appariées (apparu comme étroitement juxtaposé paires de CtBP2-positif et GluR2-positif puncta) par rapport à l'orphelin rubans (manquant de patchs récepteurs de glutamate postsynaptiques) (Figure 3).
    REMARQUE: Les synapses cochléaires normales apparaissent comme immunolabeling combiné du ruban presynaptique dans la cellule de cheveux (anti-CtBP2) et le patch de récepteur de glutamate postsynaptique sur le terminal auditif de nerf (anti-GluR2)25. Certains laboratoires utilisent des projections confocales en conjonction avec la modélisation 3D pour quantifier la taille du patch synaptique ou le volume26,27. Avant la perte significative des synapses de ruban, les rubans présentant des changements dans la taille ou sans corrections appariées de récepteur de glutamate sont probablement indicatifs du dysfonctionnement synaptique27,28.

6. Évaluation fonctionnelle des synapses de ruban cochléaire

  1. Recueillir toutes les ondes ABR pour chaque stimulus de fréquence présenté à un SPL de 90 dB pour l'analyse des amplitudes d'onde ABR supraseuil.
    REMARQUE: Des études neurophysiologiques et morphologiques ont démontré que les fibres à faible taux spontané et à seuil élevé sont particulièrement vulnérables au vieillissement et à l'exposition au bruit29,30. Bien que la simple perte de synapses de ruban ne puisse pas affecter les seuils aBR, elle entraîne généralement des réductions significatives des amplitudes d'onde DBR I, parce que ces afférents comprenant des fibres à faible taux spontané et à seuil élevé et à taux spontané élevé, les fibres de bas seuil contribuent fortement aux activités résumées des fibres de nerf cochléaire28,29,31. Une intensité supraseuil de 90 dB SPL est sélectionnée ici.
  2. Déterminer l'amplitude des ondes de pointe à pic à l'amplitude à l'aide d'un programme d'analyse hors ligne (figure 4). Chaque vague I dans le test ABR se compose d'une déviation positive de départ (p) et de la déviation négative (n) subséquente. ABR vague je amplitude est définie comme la différence de tension entre Ip (le pic positif de l'onde I) et Dans (le pic négatif de l'onde I)29.
    REMARQUE: Dans des conditions pathologiques, la synaptopathie cochléaire peut être déterminée en fonction des amplitudes supraseuils de l'onde I de l'ABR, qui reflètent les réponses d'initialité résumées des SGN évoquées par le son. Cependant, la sensibilité cochléaire qui n'est pas compromise en raison du dysfonctionnement d'OHC est une condition préalable à cette méthode.

Résultats

Des essais auditifs d'ABR ont été exécutés pour 10 souris de C57BL/6J (8 semaines d'âge) sous l'anesthésie. Les APR ont été obtenus à l'aide de stimuli de tonalité à 4, 8, 16, 32 et 48 kHz. Le seuil auditif de chaque animal a été détecté visuellement en distinguant au moins une forme d'onde claire dans l'ABR. Toutes les souris ont exhibé des seuils d'ABR en réponse aux éclats de tonalité, s'étendant entre 25 et 70 dB SPL selon la fréquence du stimulus. Nos résultats ont indiqué que le seuil d'audit...

Discussion

Depuis la synaptopathie cochléaire a d'abord été caractérisée chez les souris adultes avec un changement de seuil temporaire (TTS) induit par 8-u201216 kHz bruit de bande d'octave à 100 dB SPL pour 2 h31, les chercheurs ont de plus en plus étudié les effets de la synaptopathie dans divers mammifères, y compris les singes et les humains32,33. En plus de l'exposition au bruit, plusieurs autres affections ont été associées à la s...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); le projet de financement conjoint de la Fondation des sciences naturelles de Beijing et du Comité de l'éducation de Beijing (KZ201810025040); la Fondation des sciences naturelles de Beijing (7174291); et la China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine hydrochlorideGutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, ChinaH35020148100 mg/kg
Xylazine hydrochlorideSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAX-125110 mg/kg
TDT physiology apparatusTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
SigGen/BioSig softwareTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USAAuditory Physiology System III
Electric PadPet Fun11072931136
Dumont forceps 3#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0203-3-PO
Dumont forceps 5#Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada0209-5-PO
Stereo dissection microscopeNikon Corp., Tokyo, JapanSMZ1270
Goat serumZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4Millipore Corp., Billerica, MA, USAMAB397mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2BD Biosciences, Billerica, MA, USA612044mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21124goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibodyThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USAA21131goat
Mounting medium containing DAPIZSGB-BIO, Beijing,ChinaZLI-9557
Confocal fluorescent microscopyLeica Microsystems, Wetzlar, GermanyTCS SP8 II
Image Pro Plus softwareMedia Cybernetics, Bethesda, MD, USAversion 6.0
Professional diagnostic pocket otoscopeLude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,ChinaHS-OT10
Needle electrodeFriendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China102920 mm, 28 G
Closed-field speakerTucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USACF1

Références

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