Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Zusammenfassung

Hier, zwei mittleren Durchsatz-Assays für die Bewertung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliche Spermien werden beschrieben. Diese Tests können verwendet werden, um schnell und einfach große Mengen von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma.

Zusammenfassung

Ca^{2 +}-Signalisierung ist für normale Spermien Zellfunktion und männliche Fruchtbarkeit. Ebenso ist die Akrosom Reaktion entscheidend für die Fähigkeit einer menschlichen Samenzelle, die Zona Pellucida zu durchdringen und das Ei zu befruchten. Es ist daher von großem Interesse für die Verbindungen (z. B. Umweltchemikalien oder Medikamenten-Kandidaten) für ihre Wirkung auf Ca^{2 +}test-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma entweder, die potenziellen negativen Auswirkungen auf menschliche Samenzelle Funktion zu untersuchen oder eine mögliche Rolle als Verhütungsmittel zu untersuchen. Hier werden zwei Medium-Durchsatz-Assays beschrieben: (1) ein Fluoreszenz-basierten Test zur Bewertung der Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Spermien und (2) ein Bild durchflusszytometrischen Assay für die Bewertung von Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Diese Tests können verwendet werden, um eine große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Bildschirm-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma. Darüber hinaus können die Assays verwendet werden hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven der einzelnen Verbindungen zu generieren, um festzustellen mögliche Additivität/Synergismus für zwei oder mehr Verbindungen und der pharmakologischen Wirkmechanismus durch wettbewerbsfähige Hemmung zu studieren Experimente mit CatSper-Inhibitoren.

Einleitung

Die beiden Assays, die hier beschriebenen soll Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma wie für mehrere Verbindungen in mehreren Publikationen Einsatz dieser assays^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-Signalisierung und Akrosom Reaktion sind entscheidend für normalen menschlichen Samenzelle Funktion und Fruchtbarkeit des Mannes.

Das übergeordnete Ziel einer menschlichen Samenzelle ist das Ei zu befruchten. Um erfolgreich und natürlich das Ei zu befruchten zu können, müssen die Funktionen der Samenzelle fest während der Fahrt die Samenzelle durch die weiblichen Fortpflanzungsorgane^8,9geregelt werden. Viele der Samenzelle Funktionen unterliegen über die intrazelluläre Ca^{2 +}-Konzentration [Ca^{2 +}]_ich (z. B. Sperma Motilität, Chemotaxis und Akrosom Reaktion)¹⁰. Auch ist ein Reifungsprozess, der Rechtsfähigkeit, die die Samenzellen zur Befruchtung der Eizelle macht, genannt teilweise geregelt [Ca^{2 +}]_ich¹⁰. Ca^{2 +}-Extrudieren Ca^{2 +}-ATPase-Pumpen-¹¹ erhalten ein ca. 20.000 Fach Ca^{2 +}-gradient über die menschlichen Samenzelle Membran mit einer ruhenden [Ca^{2 +}]_ich von 50-100 nM. Wenn Ca^{2 +} erlaubt ist, die Zellmembran zu überqueren (z. B. durch die Öffnung des Ca^{2 +}-Kanäle), ein großer Zustrom von Ca^{2 +} auftritt, was zu einer Höhe von [Ca^{2 +}]_ich. Trägt jedoch auch die Samenzelle intrazellulären Ca^{2 +}-Läden, die Ca^{2 +} freisetzen können und daher auch geben [Ca^{2 +}]_ich¹²Höhe steigen. Interessanterweise alle Kanal-vermittelten Ca^{2 +}-Zustrom in menschliche Samenzellen bisher festgestellt wurde, über CatSper (KatzeIonischen Kanal der SpeRm), auftreten, die nur in Spermien¹¹zum Ausdruck kommt. In menschliche Samenzellen CatSper wird aktiviert durch die endogenen Liganden Progesteron und Prostaglandine durch unterschiedliche Ligand verbindliche Sites^13,14,15, führt zu einer raschen Ca^{2 +}-Zustrom in die Samenzelle. Zwei Quellen in der Nähe von dem Ei bieten hohes Maß an diesen endogenen Liganden. Eine ist die Follikelflüssigkeit, die hohe Konzentrationen von Progesteron¹⁶enthält. Die Follikelflüssigkeit wird aus Reifen Follikeln zusammen mit dem Ei beim Eisprung und vermischt sich mit der Flüssigkeit innerhalb der Eileiter¹⁷freigegeben. Die wichtigste Quelle ist die Cumulus-Zellen, die die Eizelle umgeben und lassen hohe Progesteron und Prostaglandine. Die Progesteron-induzierte Ca^{2 +}-Zustrom in die Samenzellen zu vermitteln Chemotaxis gegenüber Ei^9,18, Steuern Spermien-Motilität^19,20 und stimulieren die Akrosom nachweislich Reaktion²¹. Auslösung von diesen einzelnen [Ca^{2 +}]_ich-regulierten Sperma-Funktionen in der richtigen Reihenfolge und zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend für die Befruchtung der Eizelle⁸. Im Einklang mit dieser, eine suboptimale Progesteron-induzierte Ca^{2 +}-Zustrom zugeordnet werden reduziert männliche Fruchtbarkeit^{22,23,24,25,26 gefunden wurde ,27,28,29} und funktionale CatSper ist unabdingbar für männliche Ergiebigkeit^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Da die Spermien die Eizelle erreichen, eine Abfolge von Ereignissen erfolgen für die Befruchtung auftreten: (1) die Samenzellen müssen dringen in die umliegenden Cumulus Zellschicht, 2) an die Zona Pellucida binden, (3) den acrosomal Inhalt, die sogenannte Akrosom Reaktion exocytose ³⁷, 4) dringen in die Zona Pellucida und 5) verschmelzen mit der Eihülle Befruchtung³⁸abgeschlossen. Um durch diese Schritte zu gehen und das Ei zu befruchten, müssen die Samenzelle zuerst Rechtsfähigkeit¹¹, unterziehen, die beginnt, wenn die Samenzellen verlassen die Samenflüssigkeit enthält "decapacitating" Faktoren³⁹ und in den Flüssigkeiten des Weibchens schwimmen Fortpflanzungsorgane mit hohen Niveaus von Bikarbonat und Albumin³⁷. Rechtsfähigkeit rendert die Spermien in der Lage, Überaktivierung, eine Form der Motilität mit eine kräftige Tracht Prügel der Geissel und Akrosom Reaktion³⁷zu unterziehen. Überaktivierung Motilität ist erforderlich für die Penetration der Zona Pellucida⁴⁰, und das Akrosom enthält verschiedene hydrolytische Enzyme, die diese Durchdringung Prozess⁴¹Hilfe. Darüber hinaus macht Akrosom Reaktion der Samenzellen in der Lage, der Verschmelzung mit dem Ei, indem man bestimmte Membranproteine auf der Sperma-Oberfläche für Sperma-Ei Fusion⁴²notwendig. Folglich die Fähigkeit Überaktivierung und Akrosom Reaktion zu unterziehen sind sowohl für erfolgreiche Befruchtung der Eizelle^40,42erforderlich. Im Gegensatz zu dem, was für Maus Samenzellen^43,44,45gesehen hat kann nur menschliche Samenzellen, die Akrosom intakt sind an die Zona Pellucida⁴⁶binden. Wenn die menschliche Samenzellen an die Zona Pellucida gebunden sind haben sie unterziehen die Akrosom Reaktion, die Zona Pellucida⁴¹ einzudringen und um bestimmte Membranproteine freizulegen, die für die Verschmelzung mit dem Ei³⁸benötigt werden. Das Timing der Akrosom Reaktion in menschliches Sperma ist somit entscheidend zur Befruchtung auftreten.

Wie oben beschrieben, Ca^{2 +}-Signalisierung ist wichtig für normale Spermien Zelle Funktion⁸, und es daher von großem Interesse ist in der Lage sein eine Bildschirm große Anzahl von Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Samenzellen. Ebenso wie nur menschliche Samenzellen, die Akrosom Reaktion auf den richtigen Zeitpunkt und Ort unterzogen werden können die Zona Pellucida zu durchdringen und die Eier^{46,47 befruchten}, ist es auch von großem Interesse, Verbindungen für ihre Fähigkeit, testen zu können beeinträchtigen Sie die Akrosom Reaktion in menschliche Spermien. Zu diesem Zweck werden zwei Medium Throughput Screening-Tests beschrieben: (1) ein Test für Wirkungen auf Ca^{2 +}-Signalisierung in menschliche Samenzellen und (2) ein Test für die Fähigkeit, Akrosom Reaktion in menschliche Samenzellen zu induzieren.

1-Assay ist ein Medium-Durchsatz Ca^{2 +}-Assay-Signalisierung. Diese Fluoreszenz Platte Leser-basierte Technik überwacht Änderungen in Fluoreszenz als Funktion der Zeit gleichzeitig in mehreren Brunnen. Die Ca^{2 +}-sensible Fluoreszenzfarbstoff, Fluo-4 hat einen K-_d für Ca^{2 +}≈ 335 nM und Zelle-permeationsfähigen in AM (Acetoxymethyl) Ester Form ist. Mit Fluo-4, ist es möglich, Änderungen in [Ca^{2 +}]_i im Laufe der Zeit und nach der Zugabe von Verbindungen des Interesses zu den Samenzellen zu messen. Der Test wurde von im Labor von Timo Strünker 2011¹³ entwickelt und ist seitdem in mehreren Studien zu Bildschirm Verbindungen für Auswirkungen auf Ca^{2 +}benutzt worden-Signalisierung in menschliches Sperma^{1,2,3, 4,5}. Auch hat eine ähnliche Methode verwendet wurde, mehrere Drogen Kandidaten⁴⁸auf den Bildschirm. Dieser Test eignet sich darüber hinaus auch für die Beurteilung des pharmakologischen Modus der Aktion^1,2,3,4,5, Dosis-Wirkungs-Kurven^{1, 2,3,4,5}, wettbewerbsfähige Hemmung^1,2, Additivität^1,2und Synergismus³ Verbindungen des Interesses.

Test 2 ist ein Medium-Durchsatz Akrosom Reaktion Assay. Dieses Bild Cytometer-basierten Methode misst die Menge an lebensfähigen Akrosom reagierte Samenzellen in einer Probe, mit drei fluoreszierende Farbstoffe: Propidium Jodid (PI), FITC gekoppelten Lektin Pisum Sativum (FITC-PSA) und Hoechst 33342. Der Test wurde von einer ähnlichen Flow Cytometry-basierte Methode von Zoppino Et Al.⁴⁹ geändert und wurde in mehreren Studien^6,7verwendet. Für die Ca^{2 +}-Signalisierung Assay, Akrosom Reaktion Assays könnte auch verwendet werden, um die Dosis-Wirkungs-Kurven, Hemmung, Additivität und Synergismus der Verbindungen des Interesses zu beurteilen.

Protokoll

Die Sammlung und Analyse von menschlichen Samenproben in den Protokollen folgt den Richtlinien der Forschung-Ethik-Kommission der dänischen Hauptstadt Region. Alle Spermaproben haben freiwillige Spender nach Einwilligung eingeholt. Nach der Geburt wurden die Proben vollständig anonymisiert. Für ihre Unannehmlichkeiten erhielt jeder Spender eine Gebühr von 500 DKK (ca. $75 US-Dollar) pro Probe. Die Proben wurden am Tag der Lieferung analysiert und dann sofort nach den Laborversuchen zerstört.

Hinweis: Die mittleren Durchsatz Ca^{2 +}-Signalisierung Assay wird in Schritte 4 und 5 und der mittleren Durchsatz Akrosom Reaktion Assay in Schritte 6 und 7 beschrieben. Das Protokoll zum menschlichen tubal Fluid (HTF⁺) Medium vorbereiten wird in Schritt 1 beschrieben und die Reinigung der Spermien für die Assays wird in Schritte 2 und 3 beschrieben.

1. Vorbereitung des menschlichen Tubal Fluid (HTF⁺) Medium

Hinweis: Einsatz volumetrische Fläschchen von entsprechender Größe, eine 1 L Zylinder, ein Magnetrührer, Salze, wie in Tabelle 1 aufgeführten messen und Tabelle 2, gereinigtes Wasser, 0,2 µm Porengröße Filter und 50 mL-Kunststoff-Rohre.

1. Bereiten Sie Stammlösungen der Salze im Trinkwasser (Tabelle 1).
   1. Fügen Sie die Menge des Salzes in einer volumetrischen Kolben der entsprechenden Größe in Tabelle 1 aufgeführten, ein bisschen weiter unten die gewünschte Lautstärke gereinigtes Wasser hinzu, und mischen Sie gut mit einem Magnetrührer.
   2. Wenn Salz vollständig aufgelöst hat, entfernen Sie Magnet und füllen mit gereinigtem Wasser auf die gewünschte Endvolumen.
2. Stammlösung auf eine Flasche übertragen und bis zur Verwendung aufbewahren.
   Hinweis: Stammlösungen gehalten und über längere Zeiträume hinweg wiederverwendet werden können: Glukose und HEPES bei-20 ° C und die anderen Stammlösungen bei Raumtemperatur (RT).
3. Bereiten Sie 1 L des HTF⁺ Medium von Stammlösungen (Tabelle 2).
   1. Sicherstellen Sie, dass alle Stammlösungen sind vollständig aufgelöst und vor Gebrauch gut gemischt.
   2. Fügen Sie die Menge der Stammlösung und Salz in eine 1 L Messzylinder Tabelle 2 aufgeführt und 900 mL fügen Sie gereinigtes Wasser hinzu.
   3. Mischen Sie nun mit einem Magnetrührer und justieren Sie pH bis 7,35 mit NaOH-Lösung.
   4. 1.000 mL gereinigtes Wasser hinzufügen und den Magneten zu entfernen.
4. Sterile Filtrat HTF⁺ Medium durch einen 0,2 µm Pore Filter, aliquoten HTF⁺ Medium, 50 mL-Kunststoff-Rohre und Store bei 4 ° C bis zur Verwendung.
5. Kurz vor der Durchführung eines Experiments, fügen Sie 165 µL Na-Pyruvat 50 mL Aliquot, eine Endkonzentration von Na-Pyruvat von 0,33 mM bekommen hinzu.
   Hinweis: Menschlichen tubal Fluid Medium erhalten Sie ebenfalls von verschiedenen kommerziellen Anbietern. Bei der Verwendung von 4 mM HCO₃^– Medium können Proben mit geschlossenen Deckeln in einem Inkubator ohne zusätzliche CO₂ in der Luft ohne große Abweichungen des pH-Wertes inkubiert werden. Wenn eine CO₂ -Inkubator verfügbar ist, kann die entsprechende Menge an CO₂ berechnet unter Verwendung der Henderson-Hasselbalch-Gleichung und verwendet. Wenn das 25 mM HCO₃^– Medium verwenden, sollten Proben inkubiert werden mit offenen Deckel in einem CO₂ Inkubator mit Luft mit einer entsprechenden Menge an CO₂ (je nach atmosphärischen Druck, in der Regel zwischen 5 bis 10 %) um ein Abdriften des pH-Wertes zu vermeiden. Die genaue Höhe der CO₂ kann unter Verwendung der Henderson-Hasselbalch-Gleichung berechnet werden.

2. Reinigung der bewegliche Spermien über mit direktem Poolzugang (Abbildung 1)

Hinweis: Verwenden Sie einen sauberen breiten Mund Kunststoffbehälter für die Samenprobe, Inkubator, 50 mL-Kunststoff-Rohre, ein Rack für die Platzierung der 50 mL-Kunststoff-Rohre in einem 45°-Winkel, HTF⁺ Medium (vorbereitet in Schritt 1 oder erhalten von gewerblichen Anbieter), eine Zentrifuge und humanem serum Albumin (HSA).

1. Erhalten Sie eine frisch gespendeten menschlichen Samenprobe durch Masturbation produziert und ejakuliert in einen breiten Mund sauber Kunststoffbehälter. Verwenden Sie nur Samenproben, die durch die WHO Labor Handbuch zur Prüfung und Bearbeitung von menschlichen Samen festgelegten Parameter erfüllen.
2. Inkubation der Probe bei 37 ° C für 15-30 min erlauben es zu verflüssigen.
3. 50 mL HTF⁺ Medium mit 4 mM erwärmen Sie HCO₃^– auf 37 ° c
4. Platz reinigen 50 mL-Kunststoff-Rohre in einem Rack in einem 45°-Winkel (um die Fläche zwischen den Flüssigkeiten zu erhöhen). Verwenden Sie 1 Tube pro mL von rohen Samen.
5. Fügen Sie 4 mL des Mediums vorgeheizten HTF⁺ für jedes der Rohre.
6. Pipette vorsichtig 1 mL der verflüssigten Samenprobe am unteren Rand jedes Röhrchen mit 4 mL vorgewärmten HTF⁺. Freisetzung von Luftblasen zu vermeiden.
7. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 1 h.
8. Schonend abzusaugen Sie und übertragen Sie so viel von der oberen Anteil (HTF⁺ mit bewegliche Spermien) wie möglich zu einem neuen 15 mL Kunststoff-Schlauch, unter Berücksichtigung, dass nichts aus der unteren Anteil (Semen mit unbewegten und tote Zellen) enthalten ist. Im Allgemeinen ist es sicher, 3,5 mL des oberen Anteils zu übertragen, ohne zu stören den unteren Anteil. Zur Vermeidung von Saug Turbulenzen der äußersten 1-2 mm von der Pipettenspitze in einem 45°-Winkel eine größere Öffnung zu erhalten abgeschnitten.
9. Füllen Sie die 15 mL Kunststoffröhre mit HTF⁺ zu waschen Zellen und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 10 min bei RT
10. Sanft abzusaugen und entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Samenzelle Pellet in 2 mL HTF⁺.
11. 20 µL der Spermien Aufhängung an zwei kleine Kunststoff-Rohre für die Beurteilung der Samenzellenkonzentration übertragen (siehe Schritt 3).
12. Füllen Sie die 15 mL Kunststoffröhre mit HTF⁺ zu waschen Zellen und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 700 X g für 10 min bei RT
13. Sanft abzusaugen und Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Samenzelle Pellet bis 10 x 10⁶ Zellen/mL (bezogen auf die Zellkonzentration bewertet im Schritt 2.11).
    1. Für Experimente mit UN-Hubraum Samenzellen (Routine Ca^{2 +}-Assay-Signalisierung)
       1. Aufschwemmen Sie Zellen in HTF⁺ mit 4 mM HCO₃^–.
       2. Fügen Sie 30 µL des menschlichen Serum Albumin (HSA) (100 mg/mL) pro mL HTF⁺ um eine Endkonzentration von 3 mg/mL zu erhalten.
       3. Deckel schließen und ≥1 h bei 37 ° c inkubieren
    2. Für Experimente mit capacitated Samenzellen (Akrosom Reaktion Assay)
       1. Aufschwemmen Sie Zellen in HTF⁺ mit 25 mM HCO₃^–.
       2. Fügen Sie 30 µL der HSA (100 mg/mL) pro mL HTF⁺ um eine Endkonzentration von 3 mg/mL zu erhalten.
       3. Deckel lose befestigen und inkubieren ≥3 Stunden bei 37 ° C mit der entsprechenden Menge an CO₂ (siehe Schritt 1, in der Regel zwischen 5 bis 10 % CO₂).

(3) Zählung der Spermien

Hinweis: Samenzellen können entweder manuell⁵⁰ oder mit einem Bild Cytometer⁵¹, gezählt werden, wie hier beschrieben. Verwenden Sie ein Bild Cytometer, ein Vortexer, S100 Puffer, ein SP1-Kassette, mit direktem Poolzugang gereinigt Samenzellen (vorbereitet in Schritt 2).

1. Verdünnen Sie eine 20 µL aliquoten bis zu einem Faktor von 10, 20, 30, 50 oder 90 in S100-Puffer mit einem Rundboden 2 mL Schlauch entsprechend der erwarteten Konzentration (ausgewertet durch manuelle Inspektion des Geschosses im Schritt 2.10). Verwenden die Verdünnung, die am nächsten zur Konzentration erwartet (d. h. wenn eine Konzentration von 15 x 10⁶ Spermien pro mL nach direktem Poolzugang erwartet wird dann die 20 µL Spermaprobe mit 380 µL S100 Puffer [Verdünnungsfaktor 20] verdünnen).
2. Mischung gut für 10 s mit einem Vortex-Mixer bei maximalen 700 u/min, die SP1-Kassette in der Probe eintauchen und drücken Sie den weißen Kolben vollständig hinunter Aspirat ein Aliquot der Probe in die Kassette.
3. Öffnen Sie das Bild Cytometer, legen Sie die Kassette in das Fach und Assay Graf von PI gebeizt menschliche Samenzellen Assay gemäß der angewandten Verdünnungsfaktor (gewählt im Schritt 3.1) ausgeführt.
4. Wiederholen Sie Schritt 3.1-3.3 mit anderen 20 µL Probe, mit einem Verdünnungsfaktor am nächsten an die gemessene Konzentration von der ersten 20 µL Probe erhalten.
5. Berechnen Sie Mittelwert Samenzelle Konzentration aus den zwei Messungen.
6. Multiplizieren bedeutet Sperma Zellkonzentration mit dem ursprünglichen Volumen, die Anzahl der insgesamt Samenzelle zu erhalten (in Schritt 2, ist das ursprüngliche Volume 2 mL).

4. Messung von Veränderungen in der freien intrazellulären Ca^{2 +}-Konzentration ([Ca^{2 +}]_Ich) mit Ca^{2 +}- Fluorimetry (Abbildung 2)

Hinweis: Benutzen Sie einen Fluoreszenz Platte Reader, 384 Multi-well-Platten, Fluo-4 Uhr, gereinigte Spermien mit direktem Poolzugang (aus Schritt 2), Verbindungen des Interesses auch positive und negative Kontrollen, sowie eine automatische Repeater-Pipette, ein 12-Kanal-Pipette.

1. Bereiten Sie eine 2 mM Fluo-4 AM Lager durch Zugabe von 22,7 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) zu einem Fläschchen von 50 µg Fluo-4 Uhr und das Rohr gut mischen.
2. Ein neues Reagenzglas eine aliquote 700 µL mit direktem Poolzugang wiederhergestellten Sperma Suspension (Hubraum oder un-Hubraum als skizziert in Schritt 2) hinzufügen. 700 µL Spermaprobe ist der Betrag benötigt, um eine Reihe von 24 Vertiefungen in der 384-Microwell-Platte (zum Testen 3 Kontrollen und 9 Verbindungen in Dubletten) zu analysieren.
3. Fügen Sie 3,5 µL Fluo-4 AM-Stammlösung, die 700 µL Sperma Federung, eine Endkonzentration von 10 µM zu erhalten bin Fluo-4.
4. Inkubieren Sie Probe für 45 min bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden.
5. Zentrifugieren Sie Probe bei 700 X g für 10 min, aspirieren Sie und entsorgen Sie des Überstands um überschüssige Fluo-4 zu entfernen.
6. Aufschwemmen Sie gefärbten Pellet in HTF⁺ , 5 x 10⁶ Zellen/mL (d. h., verwenden Sie 2 x das Volumen der Zellsuspension in Schritt 4.2 ausgeführten)
7. Bereiten Sie Verdünnungen von Verbindungen und Kontrollen (kann während der Inkubation und Zentrifugation im Schritt 4.4 und 4.5, bzw. erfolgen).
   1. Verdünnen Sie Verbindungen, sowie eine Negativkontrolle (Puffer mit Fahrzeug) und eine Positivkontrolle (Progesteron) in HTF⁺. Verbindungen und die Steuerelemente, 3 x die gewünschte Endkonzentration zu verdünnen, da sie verdünnt 1:3 sind, wenn sie die Spermien im Schritt 4.16 hinzugefügt werden.
   2. Legen Sie die Rohre mit Verdünnungen in einem Rack mit einem Abstand zwischen den Rohren entsprechend dem Abstand zwischen die Pipettenspitzen der 12-Kanal-Pipette in Schritt 4.16 verwendet.
8. Verwenden Sie eine automatische Repeater-Pipette (24 Stufen von 50 µL).
   1. Mix Fluo-4 gebeizt Spermaprobe sanft durch den gesamten Betrag einmal rauf und runter pipettieren.
   2. Die 24 Vertiefungen einer Zeile in der 384-Microwell-Platte Aliquote von 50 µL hinzufügen.
9. Die Microwell Platte in einem Fluoreszenz-Platte-Reader bei 30 ° C und schließen Sie die Schublade.
10. Wählen Sie das entsprechende Protokoll für Fluo-4. Begeistern, Fluoreszenz bei 480 nm und Rekord Emission bei 520 nm. Verwenden Sie die schnellstmögliche Zyklus-Zeit mit der Einstellung.
    Hinweis: Verwenden Sie nach Möglichkeit mindestens 10 Blitze pro gut und unten Optik.
11. Wählen Sie einen Brunnen in der Zeile, und passen Sie zu gewinnen, um einen Zielwert von 20 %.
12. Starten Sie die Messung.
13. Kontrolle der Grundlinie während der ersten 5 Zyklen.
    1. Wenn das fluoreszierende Auslesen ist erhöhen bzw. verringern im Laufe der Zeit, stoppen Sie das Experiment zu, passen Sie den Gewinn und starten Sie das Experiment erneut.
    2. Weicht die Grundlinie viel zwischen einzelnen Wells in einer Reihe, entweder Pipettieren im Schritt 4.8 wurde ungenau oder die Probe war nicht gut genug vor Pipettieren gemischt. Entsorgen Sie das Experiment.
    3. Wenn das fluoreszierende Auslesen vergleichbar zwischen den Brunnen in der Reihe und während der ersten 5 Zyklen stetig ist, weiter mit dem nächsten Schritt fort.
14. Nach 10 Zyklen (verwendet für Baseline) pause das Experiment.
15. Werfen Sie die Schublade mit der Microwell-Platte.
16. Mit einem 12-Kanal-Pipette (2 Stufen von 25 µL), schnell 25 µL der vorbereiteten Lösungen von Verbindungen und die Steuerelemente (aus Schritt 4,7), die 12 auch Duplikate (24 Vertiefungen) einer Zeile hinzufügen. Lösungen werden verdünnt 1:3, da die Brunnen bereits 50 µL gefärbten Spermaprobe enthalten.
17. Fortsetzen Sie die Messung so schnell wie möglich (Schublade schliesst automatisch) zu vermeiden, keine fluoreszierenden Signale induziert durch die zusätzlichen Verbindungen fehlen und Kontrollen. Änderungen in Fluoreszenz (ΔF) nach die Zugabe von Verbindungen und Steuerelemente jetzt aufgenommen wird.
18. Führen Sie das Experiment bis fluoreszierende Signale aus der positiv-Kontrolle und die Verbindungen des Interesses aufgenommen wurden.
19. Beenden Sie den Test, und exportieren Sie die rohen Fluoreszenz-Daten, um es wie in Schritt 5 zu analysieren.
    Hinweis: In der Regel Fluo-4 Uhr wird als die Ca^{2 +}-sensiblen Fluorophor in die Probe, aber andere Ca^{2 +}-sensible Fluorophore könnte auch verwendet werden, wenn Erregung und Emissionsspektren mit Filter in der Fluoreszenz Platte Leser passen. Abhängig von der Wahl der Fluorophor stellen Sie sicher, dass die Gain-Level auf einem "sicheren" Niveau ist wo die induzierte Fluoreszenz Gipfel innerhalb des Messbereichs des Instruments sind. Dies kann durch Zugabe von Ionomycin zu einem einzigen Brunnen an einem bestimmten Gain-Einstellung getestet werden. Wenn dies ein Fluoreszenzsignal oberhalb der Schwelle induziert, den Gewinn zu senken und versuchen Sie es erneut. Einige Pluronic F-127 verwenden, um das Laden der Fluo-4^1,13helfen, aber es hat sich herausgestellt, dass dies nicht notwendig². Die maximale Anzahl der Zeilen, die simultan gemessen hängt von zwei Faktoren ab. (1) die Zykluszeit des Instruments: Wenn die Zykluszeit zu lang ist, vielleicht induzierte Gipfel [Ca^{2 +}]_ich verpasst. Messen Sie maximal zwei Zeilen gleichzeitig an die Zykluszeit gering zu halten; (2) die Geschwindigkeit des in Schritt 4.16 pipettieren: mit der 12-Kanal-Pipette, es ist möglich, schnell 12 unterschiedliche Lösungen der 12 doppelten Brunnen (24 Vertiefungen) von 1 oder 2 Zeilen (z. B. eine Zeile vorher inkubiert mit Fahrzeug und eine Zeile vorher inkubiert mit Inhibitor) hinzufügen , ohne dabei die induzierte Ca^{2 +} Gipfel. Jedoch empfiehlt es nicht versuchen zwei Zeilen für die gleichzeitige Messung 24 verschiedene Lösungen hinzu, wie Pipettieren Tipps werden zwischen den zwei aufeinander folgenden Pipettieren Schritten ersetzt werden, wobei induzierte Ca^{2 +} Spitzen entgehen lassen könnte.

5. Analyse der Daten von Ca^{2 +}- fluorimetry

1. Öffnen Sie die rohen Fluoreszenz-Daten abgerufen und in Schritt 4 exportiert.
2. Berechnen Sie den Mittelwert aus doppelten Brunnen. Wenn große Unterschiede zwischen Duplikate vorhanden, verwerfen Sie Daten aus den spezifischen Brunnen.
3. Definieren Sie Grundlinie als die 10 ersten Zyklen.
4. Berechnen Sie ΔF/F₀ (%) als der prozentuale Veränderung der Fluoreszenz (ΔF) im Laufe der Zeit nach Zugabe von Verbindungen und Kontrollen in Bezug auf die mittlere basale Fluoreszenz (F₀) in den 10 ersten Zyklen (Baseline).
5. Wenn die Daten für die Generierung von Dosis-Wirkungs-Kurven verwenden, ziehen Sie zum Auslesen der Negativkontrolle aus den anderen Vertiefungen Pipettieren Artefakte zu entfernen.

(6) Bewertung von Akrosom Reaktion

Hinweis: Verwenden Sie ein Bild Cytometer, Inkubator, fluoreszierende Farbstoffe: PI, FITC-PSA und Hoechst 33342, Verbindungen von Interesse, sowie positive und negative Kontrollen, eine Ruhigstellung Lösung mit 0,6 M Nahco3₃ und 0,37 % (V/V) Formaldehyd in destilliertem Wasser, ein A2-Rutsche und Hubraum mit direktem Poolzugang gereinigte Spermien (vorbereitet in Schritt 2).

1. Vorbereiten einer Färbelösung mit PI (5 µg/mL), FITC-PSA (50 µg/mL) und Hoechst 33342 (100 µg/mL) in HTF⁺, mischen Sie es gut mit einem Vortex-Mixer und bis zum Gebrauch vor Licht schützen.
2. Erarbeiten Sie Lösungen von Verbindungen und Kontrollen bei 10 x die gewünschte Endkonzentration sind verdünnte 01:10 in Schritt 6.5. Beinhalten immer eine Negative (Fahrzeug)-Steuerung und zwei Positivkontrollen: Progesteron 10 µM Endkonzentration und Ionomycin 2 µM Endkonzentration.
3. Kunststoff-Rohre übermitteln Sie Aliquote von 240 µL Hubraum Spermien (vorbereitet in Schritt 2).
4. Fügen Sie 30 µL Färbelösung zu jedem Röhrchen. Endkonzentration von Flecken werden: 0,5 µg/mL PI, 5 µg/mL PSA-FITC und 10 µg/mL Hoechst 33342.
5. Jedes Rohr 30 µL Lösungen mit Steuerelementen oder Verbindungen hinzufügen (01:10 Verdünnung).
6. Mischen Sie von oben und unten ein paar Mal oder milde vortexen Pipettieren der Proben vorsichtig. Vermeiden Sie durch mechanische Belastung übermäßige mischen.
7. Bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
8. Bereiten Sie neue Kunststoff-Rohre mit 100 µL einer Immobilisierung Lösung mit 0,6 M Nahco3₃ und 0,37 % (V/V) Formaldehyd in destilliertem Wasser, einer pro Reagenzglas vor.
9. Nach der Inkubation Mischen der Proben gut durch pipettieren und ein Rohr mit 100 µL der Immobilisierung Lösung 50 µL der Probe hinzufügen.
10. Vor dem Laden die Industrie-und Handelskammern eine A2-Folie, mischen Sie die Probe gut durch pipettieren. Füllen Sie die Kammern sorgfältig mit ca. 30 µL ohne Luftblasen zu erstellen.
    Hinweis: Während der Inkubation, die bewegliche Spermien tendenziell zu aggregieren. Zelle Klumpen können die Messungen stören, (obwohl sie ausgeschlossen sind). Daher ist es sehr wichtig, eine gute Durchmischung von Pipettieren nach der Inkubation. Ebenso können Luftblasen in den Kammern die Messungen stören. Deshalb füllen Sie langsam die Kammer und ändern Sie den Winkel der Pipette, wenn Kanten der Flüssigkeit zu treffen und eine Luftblase zu schaffen.
11. Legen Sie die geladene Folie auf das Tablett mit dem Bild Cytometer und schließen Sie das Fach.
12. Wählen Sie das FlexiCyte-Protokoll und ausführst.
    1. Wählen Sie die folgenden Einstellungen für das FlexiCyte-Protokoll: Anzahl der analytischen Kanäle: 2; Kanal Maskierung: UV (LED365), dies ist der Kanal für Bild Segmentierung; Kanal 1: Blau (LED475), Belichtungszeit 3.000 ms Emission Filter 560/35; Kanal 2: Grün (LED530), Belichtungszeit 500 ms Emission Filter 675/75; Minimale Anzahl der analysierten Zellen: 5000; Aggregierte Zellen ausschließen: Ja.
13. Wiederholen Sie Schritt 6,9-6.12 bis alle Proben gemessen wurden.

7. Analyse der Daten vom Image Cytometry

1. Offene Daten aus Schritt 6.
2. Erstellen Sie die zwei folgenden Plots, die Messungen zu bewerten.
   1. Erstellen Sie ein Streudiagramm von Hoechst 33342 Intensität vs. Hoechst 33342 Bereich auf Biexponential Skalen. Dieses Grundstück kann zur Tor, Hoechst 33342 positive Objekte, die entweder zu klein oder zu groß, um menschliche Samenzellen werden.
   2. Erstellen Sie ein Punktdiagramm FITC-PSA Intensität und PI Intensität auf Biexponential Skalen. Dieses Diagramm kann verwendet werden zu beurteilen die Höhe der Akrosom reagierte Samenzellen durch Verwendung von ein Quadrant-Tor, das die vier Gruppen auf dem Grundstück (Abbildung 3) trennt: 1) ein PI positiv und positiv FITC-PSA-Gruppe: Akrosom reagierte lebensschwache Samenzellen; (2) ein PI-Negative und positive FITC-PSA-Gruppe: Akrosom reagierte lebensfähigen Samenzellen; (3) ein PI positiv und PSA-FITC negative Gruppe: Akrosom intakt lebensschwache Samenzellen; und 4) eine PI-negativ und PSA-FITC negative Gruppe: Akrosom intakt lebensfähigen Samenzellen.

Ergebnisse

Vertreter ergibt sich aus einem Experiment testen die Wirkung von 4 Verbindungen (A, B, C und D) zusammen mit einer positiven (Progesteron) und negativ (Puffer) Kontrolle auf [Ca^{2 +}]_i in menschlichem Samen mit der Medium-Durchsatz Ca^{2 +}-Signalisierung Assay sehen in Abbildung 4a. In Abbildung 4 bzeigt eine Dosis-Antwort-Kurve von Progesteron die Spitze ΔF/F₀ (%) abgeleitet wurde, Daten...

Diskussion

Die mittleren Durchsatz Ca^{2 +} Signalisierung Assay basiert auf Messungen der Fluoreszenz von einzelnen Mikrovertiefungen enthält etwa 250.000 Samenzellen. Das aufgenommene Signal wird von allen einzelnen Samenzellen in den Brunnen gemittelt. Der Test bietet somit, dass keine räumlichen Informationen, wo speziell in der Samenzelle [Ca^{2 +}]_ich geändert wird, wie groß ein Anteil der Spermien, die eine Änderung der [Ca^{2 +}]_i findet, oder wie heterogen ist die Antwort ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer