Genotypisierung von Sea Anemone während der frühen Entwicklung

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Meeresanemone Nematostella vectensis während der Gastrulation zu genotypisieren, ohne den Embryo zu opfern.

Zusammenfassung

Beschrieben ist hier ein PCR-basiertes Protokoll, um den Gastorula-Stadium-Embryo des anthozoischen cnidären Nematostella vectensis zu genotypisieren, ohne das Leben des Tieres zu opfern. Nach In-vitro-Fertilisation und Enthaarung dürfen sich Zygoten für 24 h bei Raumtemperatur entwickeln, um das Früh- bis Mittelgastrulastadium zu erreichen. Die Gastorula-Embryonen werden dann auf einem Agarose-Gelbett in einer Petrischale mit Meerwasser platziert. Unter dem Sezieren des Mikroskops wird eine Wolframnadel verwendet, um ein Aboralgewebefragment von jedem Embryo operativ zu trennen. Embryonen nach der Operation dürfen dann heilen und weiterentwickelt werden. Genomische DNA wird aus dem isolierten Gewebefragment extrahiert und als Vorlage für die ortsspezifische PCR verwendet. Der Genotyp kann anhand der Größe von PCR-Produkten oder des Vorhandenseins/Fehlens von allelespezifischen PCR-Produkten bestimmt werden. Nachderinwerden von Embryonen wird dann nach dem Genotyp sortiert. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gescreenen Embryonen ab, erfordert aber minimal 4–5 h. Diese Methode kann verwendet werden, um Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen zu identifizieren und ermöglicht Analysen von Phänotypen während der Entwicklung.

Einleitung

Die Cnidarians repräsentieren eine vielfältige Gruppe von Tieren, die Quallen, Korallen und Seeanemonen umfassen. Es handelt sich um Diploblasten, die aus Ektoderm und Endoderm bestehen und durch eine extrazelluläre Matrix (Mesoglea) getrennt sind. Cnidaria ist eine Schwestergruppe zur Speziiose Bilateria, zu der traditionelle Tiermodelle wie Drosophila und Mus gehören¹. Zusätzlich wird angenommen, dass die Divergenz Cnidaria-Bilateria in der vorkambrischen Periode²aufgetreten ist. Als solche sind vergleichende Studien an Cnidarians und Bilaterianern unerlässlich, um Einblicke in die Biologie ihres jüngsten gemeinsamen Vorfahren zu gewinnen. Kürzlich hat die vergleichende Genomik gezeigt, dass Cnidarians und Bilaterianer viele Entwicklungs-Toolkit-Gene wie Kerb und bHLH teilen, was impliziert, dass ihr gemeinsamer Vorfahrbereitsen diese Gene hatte³. Die Rolle dieser Entwicklungs-Toolkit-Gene im letzten gemeinsamen Vorfahren von Cnidaria und Bilateria ist jedoch vergleichsweise weniger gut verstanden. Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig zu untersuchen, wie diese tief konservierten Gene bei Cnidarians funktionieren.

Eines der aufkommenden cnidarian genetischen Modelle ist die anthozoanE Nematostella vectensis. Sein Genom wurde³sequenziert, und eine Vielzahl von genetischen Werkzeugen, einschließlich Morpholino-vermittelter Genknockdown, Meganuklease-vermittelte Transgenese und CRISPR-Cas9-vermittelte Genknockins und Knockouts, sind jetzt für den Einsatz in diesem Tier verfügbar. Darüber hinaus ist die Nematostella-Entwicklung relativ gut verstanden. Während der Embryogenese tritt die Gastrulation durch Invagination⁴auf und der Embryo entwickelt sich zu einer freischwimmenden Planulalarve. Die Planula verwandelt sich anschließend in einen sessilen Polypen mit Mund und umlaufenden Tentakeln. Der Polypen wächst dann und erreicht die Geschlechtsreife.

CRISPR-Cas9-vermittelte gezielte Mutagenese wird jetzt routinemäßig verwendet, um die Genfunktion in Nematostella vectensis^5,6,7,8,9zu untersuchen. Zur Erzeugung von Knockout-Mutanten in Nematostellawird ein Cocktail mit lokusspezifischen Ein-Guide-RNAs und dem Endonuklease-Cas9-Protein zunächst in unbefruchtete oder befruchtete Eier injiziert, um F0-Gründertiere zu produzieren, die typischerweise Mosaik. F0-Tiere werden anschließend zur Geschlechtsreife erhoben und miteinander gekreuzt, um eine F1-Population zu erzeugen, von denen eine Teilmenge Knockout-Mutanten⁶sein kann. Alternativ können geschlechtsreife F0-Tiere mit Wildtieren gekreuzt werden, um F1-Heterozygoten zu erzeugen, und F1-Heterozygoten, die ein Knockout-Allel im Ort des Interesses tragen, können dann miteinander gekreuzt werden, um F2-Nachkommen zu produzieren, ein Viertel von denen erwartet werden, knockout mutants⁵sein. Beide Ansätze erfordern eine Methode zur Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population. Polyp Tentakel können verwendet werden, um genomische DNA für genotypisieren^6,7zu extrahieren. In Fällen, in denen die Entwicklungsfunktion des Gens untersucht wird und mutierte Embryonen das Polypenstadium nicht erreichen (d. h. aufgrund der mit der Mutation verbundenen Larventoalität), müssen Knockout-Mutanten früh in der Ontogenidentifizierten identifiziert werden. Hier wird ein PCR-basiertes Protokoll beschrieben, um einzelne Tiere im Gastrulastadium zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern, was die Identifizierung von Knockout-Mutanten aus einer genetisch heterogenen Population von Embryonen ermöglicht. Die Dauer des gesamten Genotypisierungsprozesses hängt von der Anzahl der zu gesiebenden Embryonen ab, erfordert aber minimal 4-5 h.

Protokoll

1. Induktion von Laichen, In-vitro-Fertilisation und Entgeleeung

1. Halten Sie Nematostella vectensis im Meerwasser mit einem Salzgehalt von 12 Teilen pro Tausend (ppt) in der Dunkelheit bei 16 °C, Fütterung Artemia täglich.
2. Am Tag vor der Laichinduktion die Tiere in einen temperatur- und lichtgesteuerten Inkubator geben. Programmieren Sie den Inkubator so, dass die Tiere bei 25 °C 8 h Licht ausgesetzt sind. Optional: Füttern Sie einzelne Tiere einkleines Stück Austern (<1 mm 3), bevor Sie sie in den Brutkasten legen, um das Laichen zu verbessern.
3. Lassen Sie die Tiere im Brutkasten für 1 h bei 16 °C.
4. Entfernen Sie die Tiere aus dem Brutkasten und lassen Sie sie auf einer Tischplatte mit Licht bei Raumtemperatur (RT), um das Laichen zu ermöglichen. Das Laichen erfolgt in der Regel innerhalb der nächsten 1,5-2 h.
5. Wenn Männchen und Weibchen in getrennten Behältern sind, legen Sie Eipakete aus dem weiblichen Behälter in einen Sperma-haltigen männlichen Behälter, indem Sie eine Transferpipette verwenden, deren Spitze geschnitten wird, um die Öffnung zu vergrößern, damit die Eier nicht durch mechanische Beanspruchung während der verlegen. Lassen Sie die Befruchtung der Eier zu, indem Sie sie mindestens 15 min im männlichen Behälter lassen.
6. Entgelee die Ei-Pakete in Meerwasser mit 3% Cystein (pH 7.4) auf einer Petrischale oder in einem 15 ml Rohr. Rühren Sie 12 min lang sanft auf einem Shaker.
7. Verwenden Sie eine Kunststoffpipette, um Klumpen aufzubrechen und weiter für weitere 2-3 min zu agitieren, bis sie vollständig entgelt werden.
8. Entfernen Sie Cystein, indem Sie die Medien durch frisches Meerwasser für mindestens 5x ersetzen.
9. Bewahren Sie die befruchteten Eier auf einer glasigen Petrischale bei 16 °C oder RT auf.

2. Chirurgische Entfernung eines Aboralgewebes aus einem Gastorula-Embryo

1. Bereiten Sie einen DNA-Extraktionspuffer vor, der aus 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 und 1 mg/mL-Proteinase K besteht. Verwenden Sie 20 ml des Extraktionspuffers pro Embryo. Mischen Sie gut durch Wirbeln und aliquot den Puffer in PCR-Röhren.
2. 1% Agarose im Meerwasser auflösen und in eine Petrischale gießen, um den Boden zu bedecken. Kühlen Sie auf einer Tischplatte, um ein Gelbett zu machen. Gießen Sie frisches Meerwasser, um das Gelbett in der Petrischale zu bedecken.
3. 24 h Embryon nach der Befruchtung (hpf) (Früh- bis Mittelgastrulastadium) in die Petrischale mit einem Agarose-Gelbett übertragen.
4. Legen Sie eine Wolframnadel in einen Nadelhalter und sterilisieren, indem Sie die Nadelspitze in Alkohol (70% oder höher) tauchen und in Flammen setzen, um den Alkohol abzubrennen.
5. Verwenden Sie unter einem Sezierendes Mikroskop (bei 20x bis 40x Vergrößerung) die Wolframnadel, um eine Depression auf dem Agarosebett zu machen, indem Sie ein Stück Oberflächenagarose von der Größe eines zu manipulierenden Embryos entfernen, und legen Sie den Embryo mit seiner seitlichen nach unten gerichtet, um die Bewegung des Embryos für die Mikrochirurgie einzuschränken.
6. Verwenden Sie die Wolframnadel, um ein Stück Aboralgewebe gegenüber der oralen blastoporalen Öffnung chirurgisch zu verbrauchen. Ein aborales Drittel bis ein Viertel des embryonalen Gewebes entlang der oral-aboralen Achse ist in der Regel ausreichend.
7. Verwenden Sie eine P20-Pipette, um das isolierte Abbruchgewebe (in <2 ml) in ein PCR-Rohr mit 20 ml DNA-Extraktionspuffer zu übertragen.
8. Übertragen Sie den embryonalen Embryo nach der Operation in einen Brunnen, der mindestens 500 ml Süßwasser in einer 24- oder 96-Well-Platte enthält.
9. Wiederholen Sie die Schritte 2.4–2.8 für die Anzahl der Embryonen nach Bedarf.
10. Legen Sie die Brunnenplatte mit post-surgery embryos in einem Inkubator bei 16 °C oder RT, bis die Genotypisierung abgeschlossen ist.

3. Genomische DNA-Extraktion und Genotypisierung PCR

1. Drehen Sie die PCR-Röhren, die den DNA-Extraktionspuffer und isolierte embryonale Gewebe enthalten, kurz mit einer Minizentrifuge (z.B. bei 2.680 x g für 10 s) herunter.
2. Um genomische DNA aus einzelnen Embryonen zu extrahieren, inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 55 °C für 3 h. Wirbel für 30 s alle 30 min, um das Aufbrechen von Zellklumpen zu gewährleisten und die Zelllyse zu verbessern.
3. Inkubieren Sie die PCR-Röhren bei 95 °C für 5 min, um die Proteinase K zu inaktivieren.
4. GDNA-Extrakte bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren und sofort zur PCR übergehen.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden, indem gDNA-Extrakte in einem -20 °C-Gefrierschrank platziert werden.
5. Richten Sie eine PCR-Reaktion mit extrahierter gDNA als Vorlage ein, um den genomischen Ort von Interesse zu verstärken.
   1. Wenn sich verschiedene Allele am Ort des Interesses in der Größe unterscheiden, so dass der Größenunterschied durch Agarose-Gel-Elektrophorese erkannt werden kann, entwerfen Sie einen einzigen Satz von Primern, um den gesamten Ort zu verstärken.
   2. Alternativ können Sie allelespezifische Primer verwenden, die PCR-Produkte nur in Gegenwart des spezifischen Alleels erzeugen; z. B. durch Entwerfen des Primers, der an einen Bereich bindet, der Einfüge-/Löschmutationen enthält.
   3. Verwenden Sie einen typischen 20 ml PCR-Reaktionsmix wie folgt: 5 ml gDNA-Extrakte, 8 ml nukleasefreies Wasser, 4 ml PCR-Puffer, 0,2 ml 10mM dNTPs, 0,6 ml DMSO, 1 ml 10 ml Vorwärtsgrundierung, 1 ml 10 ml Reverse Primer und 0,2 ml DNA-Polymerase (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Mehrere Primer können in einer PCR-Reaktion verwendet werden. So können beispielsweise ein universeller Vorwärtsprimer und zwei allelespezifische Reverse Primer kombiniert werden, sofern die beiden Reverse Primer so konzipiert sind, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, so dass das Vorhandensein/Fehlen der beiden Allele eindeutig sein kann. Gelelektrophorese bestimmt (siehe Abschnitt repräsentative Ergebnisse).
6. Führen Sie agarose GelElektrophorese, um die Größe und Präsenz / Abwesenheit von PCR-Produkten zu bestimmen. Passen Sie den Zustand der Agarose-Gel-Elektrophorese (z. B. Agarose-Gel-Prozentsatz, V/cm und Dauer) in Abhängigkeit von der erwarteten Größe der PCR-Produkte an.
7. Verwenden Sie die Ergebnisse von PCR in Bezug auf die Größe und Anwesenheit/Abwesenheit von PCR-Produkten, um jedem embryonalen Embryo nach der Operation einen Genotyp zuzuweisen. Wenn z. B. von verschiedenen Allelen erwartet wird, dass pcR-Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt werden, verwenden Sie die Größeninformationen, um den Genotyp für jeden Embryo zuzuweisen. Wenn allelespezifische Primer verwendet werden, sollten die Daten über das Vorhandensein/Fehlen von PCR-Produkten verwendet werden, um jedem Embryo einen Genotyp zuzuweisen.
8. Sortieren Sie Embryonen nach Genotyp.

Ergebnisse

Das Nematostella-Genom hat einen einzigen Ort, der ein Vorläuferprotein für das Neuropeptid GLWamid kodiert. Drei Knockout-Mutant-Allele an diesem Ort (glw^-a, glw^-bund glw^-c) wurden bereits 5 gemeldet. Vier heterozygote Männchen, die ein Wild-Typ-Allel (+) und Knockout-Allel-Glw ^-cam GLWamide-Lokus (Genotyp: +/glw^-c)trugen, wurden mit einem heterozygoten Weibchen ...

Diskussion

Beschrieben hier ein PCR-basiertes Protokoll, um einen einzelnen Seeanemonen-Embryo zu genotypisieren, ohne das Tier zu opfern. Nach dem Laichen und Entgelten dürfen sich die befruchteten Eier zu Gastrulae entwickeln. Die aborale Region jedes Gastorula-Embryos wird operativ entfernt, und das isolierte Aboralgewebe wird für die nachfolgende genomische DNA-Extraktion verwendet, während die verbleibenden postoperativen Embryonen heilen und die Entwicklung fortsetzen. Die gDNA-Extrakte werden dann für einen PCR-Test verw...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’