Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

Resumo

O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.

Resumo

Descrito aqui é um protocolo PCR-baseado para genótipo o embrião do estágio do gástrula do vectensis cnidários cnidários do nematostella sem sacrificar a vida do animal. Após a fertilização in vitro e de-jellying, zigítos são autorizados a desenvolver por 24 h à temperatura ambiente para chegar ao estágio inicial-a meados de gastrula. Os embriões do gástrula são coloc então em uma cama do gel do agarose em um prato de Petri que contem o seawater. o microscópio de dissecação, uma agulha de tungstênio é usada para separar cirurgicamente um fragmento de tecido aboral de cada embrião. Os embriões pós-cirúrgicos são então autorizados a curar e continuar o desenvolvimento. O DNA de Genomic é extraído do fragmento isolado do tecido e usado como um molde para o PCR locus-específico. O genótipo pode ser determinado com base no tamanho dos produtos de PCR ou presença/ausência de produtos de PCR alelo-específicos. Os embriões pós-cirúrgicos são então ordenados de acordo com o genótipo. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4 – 5 h. Este método pode ser usado para identificar mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de embriões e permite análises de fenótipos durante o desenvolvimento.

Introdução

Os cnidarians representam um grupo diverso de animais que incluem Medusa, corais, e Anemones de mar. São diploblastos, compostos por ectoderma e endoderma que são separados por uma matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria é um grupo de irmãs a especiosos Bilateria, a que os modelos animais tradicionais tais como a Drosophila e o Mus pertencem¹. Além disso, pensa-se que a divergência Cnidaria-Bilateria ocorreu no período pré-cambriano². Como tal, estudos comparativos de cnidários e bilaterianos são essenciais para obter insights sobre a biologia de seu ancestral comum mais recente. Recentemente, a genômica comparativa revelou que os cnidários e os bilaterianos compartilham muitos genes de kit de ferramentas de desenvolvimento, como notch e bhlh, implicando que seu ancestral comum já tinha esses genes³. Entretanto, o papel destes genes desenvolventes do Toolkit no último antepassado comum de Cnidaria e de Bilateria é comparàvel menos bem compreendido. Para abordar este problema, é crítico estudar como estes genes profundamente conservados funcionam em cnidarians.

Um dos modelos genéticos cnidários emergentes é o cnidários nematostella vectensis. Seu genoma foi seqüenciado³, e uma variedade de ferramentas genéticas, incluindo o knockdown do gene morpholino-negociado, o transgenesis meganuclease-negociado, e as knockins e os Knockouts do gene de Crispr-Cas9-negociados, estão agora disponíveis para o uso neste animal. Além disso, o desenvolvimento de Nematostella é relativamente bem compreendido. Durante a embriogênese, a gastrulação ocorre pela invaginação⁴, e o embrião se desenvolve em uma larva de Planula de natação livre. A Planula posteriormente se transforma em um pólipo séptil com uma boca e tentáculos circunorais. O pólipo cresce e atinge a maturidade sexual.

A mutagenese segmentada por crispr-Cas9 é agora rotineiramente utilizada para estudar a função gênica em nematostella vectensis^{5,6, 7,}8,9. Para gerar mutantes Knockout em Nematostella, um coquetel contendo RNAs de guia único Locus-específicos e a proteína de endonuclease Cas9 é injetado pela primeira vez em ovos não fertilizados ou fertilizados para produzir animais fundadores da F0 que tipicamente mostram mosaicism. Os animais F0 são subsequentemente levantados para a maturidade sexual e cruzados uns com os outros para produzir uma população de F1, um subconjunto do que pode ser mutantes Knockout⁶. Alternativamente, os animais de F0 sexualmente maduros podem ser cruzados com animais do tipo selvagem para gerar animais heterozigotos F1, e os heterozygotes F1 que carregam um alelo de nocaute no locus de interesse podem então ser cruzados uns com os outros para produzir descendentes de F2, um quarto dos quais são esperados para ser mutantes Knockout⁵. Ambas as abordagens requerem um método para identificar mutantes de nocaute de uma população geneticamente heterogênea. Os tentáculos de pólipo podem ser usados para extrair o DNA genómico para a genotipagem^6,7. No entanto, nos casos em que a função de desenvolvimento do gene de interesse está sendo investigada e os embriões mutantes não atingem o estágio pólipo (isto é, devido à letalidade larval associada à mutação), os mutantes Knockout precisam ser identificados precocemente na ontogenia. É descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo animais individuais no estágio do gástrula sem sacrificar o animal, que permite a identificação de mutantes do Knockout de uma população genetically heterogênea dos embriões. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4-5 h.

Protocolo

1. indução de desova, fertilização in vitro e de-jellying

1. Manter Nematostella vectensis em água do mar com uma salinidade de 12 partes por mil (ppt) na escuridão a 16 ° c, alimentando Artemia diariamente.
2. No dia antes da indução de desova, coloque os animais em uma incubadora de temperatura e luz controlada. Programe a incubadora para que os animais sejam expostos a 8 h de luz a 25 ° c. Opcional: alimente uma pequena peça (< 1 mm³) de ostra para animais individuais antes de colocá-los na incubadora para melhorar a desova.
3. Deixe os animais na incubadora por 1 h a 16 ° c.
4. Retire os animais da incubadora e deixe-os em um de bancada com luz à temperatura ambiente (RT) para permitir a desova. A desova geralmente ocorre dentro dos próximos 1,5 – 2 h.
5. Se machos e fêmeas estiverem em recipientes separados, coloque os pacotes de ovos do recipiente fêmea em um recipiente masculino contendo espermatozóides usando uma pipeta de transferência cuja ponta é cortada para ampliar a abertura para que os ovos não sejam danificados pelo estresse mecânico durante Transferência. Permitir que os ovos sejam fertilizados, deixando-os no recipiente macho durante pelo menos 15 min.
6. De-Jelly os pacotes de ovos em água do mar contendo 3% de cisteína (pH 7,4) em uma placa de Petri ou em um tubo de 15 mL. Agitar suavemente em uma coqueteleira por 12 min.
7. Use uma pipeta plástica para romper aglomerados e continuar a agitar por outro 2-3 min até completamente de-jellied.
8. Remover cisteína, substituindo a mídia com água do mar fresco por pelo menos 5x.
9. Mantenha os ovos fertilizados em um prato de Petri de vidro a 16 ° c ou RT.

2. remoção cirúrgica de um tecido aboral de um embrião de gástrula

1. Prepare um tampão de extração de DNA consistindo de 10 mM de Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL de proteinase K. Use 20 mL do tampão de extração por embrião. Misture bem por vortexing e alíquota o buffer em tubos de PCR.
2. Dissolver 1% de agarose na água do mar e despeje-o em uma placa de Petri para cobrir o fundo. Esfrie em um de bancada para fazer uma cama do gel. Despeje a água do mar fresca para cobrir a cama de gel no prato de Petri.
3. Transfira os embriões da borne-fecundação de 24 h (HPF) (cedo-à fase meados de-gastrula) no prato de Petri que contem uma cama do gel do agarose.
4. Inserir uma agulha de tungstênio em um suporte de agulha e esterilizar por mergulhar a ponta da agulha em álcool (70% ou superior) e colocando-o em chamas para queimar o álcool.
5. um microscópio de dissecação (em 20x à ampliação 40x), use a agulha do tungstênio para fazer uma depressão na cama do agarose removendo uma parte de agarose de superfície sobre o tamanho de um embrião a ser manipulado, e coloc o embrião na depressão com seu lateral lado virado para baixo, a fim de restringir o movimento do embrião para a microcirurgia.
6. Use a agulha de tungstênio para extirpar cirurgicamente um pedaço de tecido aboral localizado oposto à abertura blastoporal oral. Um aboral um terço a um quarto do tecido embrionário ao longo do eixo oral-aboral é geralmente suficiente.
7. Use uma pipeta P20 para transferir o tecido aboral isolado (em < 2 mL) para um tubo de PCR contendo 20 mL de tampão de extração de DNA.
8. Transfira o embrião da borne-cirurgia em um poço que contem pelo menos 500 mL do seawater fresco em uma placa 24 ou 96-well.
9. Repita os passos 2.4 – 2.8 para o número de embriões, conforme necessário.
10. Coloque a placa de poço contendo embriões pós-cirurgia em uma incubadora a 16 ° c ou RT até que a genotipagem seja concluída.

3. extração do ADN de Genomic e PCR genotipagem

1. Gire momentaneamente para baixo os tubos do PCR que contêm o amortecedor da extração do ADN e os tecidos embrionário isolados usando um mini-centrifugador (por exemplo. em 2.680 x g para 10 s).
2. Para extrair o ADN genomic dos únicos embriões, incubar os tubos do PCR em 55 ° c para 3 h. Vortex para 30 s cada 30 minutos para assegurar o rompimento de aglomerações da pilha e para realçar o lysis da pilha.
3. Incubar os tubos do PCR em 95 ° c por 5 minutos para inativar o proteinase K.
4. Mantenha os extratos de gDNA a 4 ° c ou no gelo e prossiga imediatamente para a PCR.
   Nota: o protocolo pode ser pausado aqui colocando extratos de gDNA em um freezer de-20 ° c.
5. Configurar uma reação de PCR usando gDNA extraído como um modelo para amplificar o locus genómico de interesse.
   1. Se os alelos diferentes no locus do interesse diferem no tamanho de modo que a diferença do tamanho possa ser detectada pela electroforese do gel do agarose, projete um único jogo dos primers para amplificar o locus inteiro.
   2. Alternativamente, use os primers alelo-específicos que geram produtos do PCR somente na presença do alelo específico; por exemplo, projetando o primer que se liga a uma região contendo mutações de inserção/deleção.
   3. Use uma mistura típica da reação do PCR de 20 mL como segue: 5 mL de extratos de gDNA, 8 mL da água nuclease-livre, 4 mL do amortecedor do PCR, 0,2 mL de dNTPs de 10mM, 0,6 mL de DMSO, 1 mL da primeira demão para diante de 10 milímetros, 1 mL da primeira demão reversa de 10 milímetros e 0,2 mL de DNA polimerase (ver tabela de materiais).
      Nota: os primers múltiplos podem ser usados em uma reação do PCR. Por exemplo, uma primeira demão para diante universal e dois primers reversos alelo-específicos podem ser combinados, contanto que os dois primers reversos forem projetados gerar produtos do PCR de tamanhos distintos de modo que a presença/ausência dos dois alelos possa ser inequivocamente determinada por electroforese em gel (ver secção de resultados representativos).
6. Execute a electroforese do gel do agarose para determinar o tamanho e a presença/ausência de produtos do PCR. Ajuste a condição da electroforese do gel do agarose (por exemplo, porcentagem do gel do agarose, V/cm, e duração) dependendo do tamanho esperado de produtos do PCR.
7. Use os resultados do PCR a respeito do tamanho e da presença/ausência de produtos do PCR para atribuir um genótipo a cada embrião da borne-cirurgia. Por exemplo, se os alelos diferentes são esperados gerar produtos do PCR de tamanhos diferentes, use a informação do tamanho para atribuir o genótipo para cada embrião. Se forem utilizados primers alelo-específicos, os dados sobre a presença/ausência de produtos de PCR devem ser utilizados para atribuir um genótipo a cada embrião.
8. Ordenar embriões de acordo com o genótipo.

Resultados

O genoma de Nematostella tem um único Locus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo GLWamide. Três alelos do mutante do Knockout neste Locus (GLW-^a, GLW^-b, e GLW^-c) foram relatados previamente⁵. Quatro machos heterozygous que carreg um selvagem-tipo alelo (+) e alelo do Knockout GLW^-cno locus do glwamide (genótipo: +/GLW^-c) foram cruzados com u...

Discussão

Descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo um único embrião do Anemone de mar sem sacrificar o animal. Depois de desova e de-jellying, os ovos fertilizados são autorizados a desenvolver-se em gastrulae. A região aboral de cada embrião do gástrula é removida cirùrgica, e o tecido aboral isolado é usado para a extração genomic subseqüente do ADN, quando os embriões restantes da borne-cirurgia curarem e continuarem o desenvolvimento. Os extratos de gDNA são usados então para um ensaio do PCR para d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’