Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung

Zusammenfassung

Es wird eine Methode beschrieben, um Organoide unter Verwendung von patientenabgeleiteter Xenografts (PDX) für das In-vitro-Screening herzustellen, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. PDX-Tumoren wurden mechanisch oder enzymatisch in kleine Stücke geerntet / verarbeitet, gefolgt von der Clevers-Methode, um Tumororganoide zu züchten, die passageiert, kryokonserviert und gegen das ursprüngliche PDX charakterisiert wurden.

Zusammenfassung

Patientenabgeleite Tumor-Xenografts (PDXs) gelten als die prädiktivsten präklinischen Modelle, von denen weitgehend angenommen wird, dass sie von Krebsstammzellen (CSC) für die konventionelle Krebsmedikamentenbewertung angetrieben werden. Eine große Bibliothek von PDXs spiegelt die Vielfalt der Patientenpopulationen wider und ermöglicht so populationsbasierte präklinische Studien ("Phase II-like mouse clinical trials"); PDX haben jedoch praktische Einschränkungen durch geringen Durchsatz, hohe Kosten und lange Lebensdauer. Tumororganoide, die auch patientenabgeleitete CSC-gesteuerte Modelle sind, können als in vitro-Äquivalent von PDX betrachtet werden und überwinden bestimmte PDX-Einschränkungen für den Umgang mit großen Bibliotheken von Organoiden oder Verbindungen. Diese Studie beschreibt eine Methode zur Herstellung von PDX-abgeleiteten Organoiden (PDXO), die zu gepaarten Modellen für die In-vitro- und In-vivo-Pharmakologieforschung führen. Subkutan transplantierte PDX-CR2110-Tumoren wurden von tumortragenden Mäusen gesammelt, als die Tumoren 200-800 mm 3 erreichten, gemäß^einemzugelassenen Autopsieverfahren, gefolgt von der Entfernung der benachbarten Nicht-Tumorgewebe und der Dissoziation in kleine Tumorfragmente. Die kleinen Tumorfragmente wurden gewaschen und durch ein 100 μm Zellsieb geleitet, um die Trümmer zu entfernen. Zellcluster wurden gesammelt und in einer BME-Lösung (Basement Membrane Extract) suspendiert und in einer 6-Well-Platte als fester Tröpfchen mit umgebenden flüssigen Medien für das Wachstum in_einem CO 2-Inkubator plattiert. Das Organoidwachstum wurde zweimal wöchentlich unter Lichtmikroskopie überwacht und fotografisch aufgezeichnet, gefolgt von einem Flüssigenmittelwechsel 2 oder 3 mal pro Woche. Die gezüchteten Organoide wurden (7 Tage später) im Verhältnis 1:2 weiter durchgelassen, indem die in BME eingebetteten Organoide durch mechanische Scherung gestört wurden, unterstützt durch Zugabe von Trypsin und die Zugabe von 10 μM Y-27632. Organoide wurden in Kryoröhrchen zur Langzeitlagerung kryokonserviert, nachdem sie durch Zentrifugation aus BME freigestellt und zur weiteren Charakterisierung ebenfalls beprobt wurden (z. B. DNA-, RNA- und FFPE-Block).

Einleitung

Krebserkrankungen sind eine Ansammlung verschiedener genetischer und immunologischer Erkrankungen. Die erfolgreiche Entwicklung wirksamer Behandlungen hängt in hohem Maße von experimentellen Modellen ab, die klinische Ergebnisse effektiv vorhersagen. Große Bibliotheken von gut charakterisierten, vom Patienten abgeleiteten Xenografts (PDX) werden aufgrund ihrer Fähigkeit, tumorbehaftete Merkmale, Heterogenität und Ansprechen des Patienten zu rekapitulieren, seit langem als das translationale In-vivo-System der Wahl angesehen, um Chemo- und/oder zielgerichtete Therapien zu testen^2,3. PDXs werden im Allgemeinen als Krebsstammzellerkrankungen betrachtet, die im Gegensatz zu von Zelllinien abgeleiteten Xenografts genetische Stabilität^{aufweisen 2}. In den letzten Jahrzehnten wurden weltweit große Sammlungen von PDXs erstellt, die heute zum Arbeitspferd der Krebsmedikamentenentwicklung werden. Obwohl weit verbreitet und mit großem translationalem Wert, sind diese Tiermodelle an sich kostspielig, zeitaufwendig und mit geringem Durchsatz und daher für ein großflächiges Screening unzureichend. PDX sind auch für immunonkologische (IO) Tests aufgrund einer immungeschwächten Natur unerwünscht⁴. Es ist daher unpraktisch, die Vorteile der verfügbaren großen Bibliothek von PDXs voll auszuschöpfen.

Jüngste Entdeckungen, die vom Labor⁵von Hans Clevers entwickelt wurden, haben zur Etablierung von In-vitro-Kulturen von Organoiden geführt, die aus adulten Stammzellen in den meisten menschlichen Organen epithelialen Ursprungs erzeugt werden⁵. Diese Protokolle wurden weiter verfeinert, um das Wachstum von Organoiden aus angenommenen CSCs in menschlichen Karzinomen verschiedener Indikationen zu ermöglichen^6,7. Diese von Patienten abgeleiteten Organoide (PDOs) sind genomisch stabil^8,9 und haben sich als sehr prädiktiv für die klinischen Behandlungsergebnisse^10,11,12erwiesen. Darüber hinaus ermöglicht die In-vitro-Natur von PDOs ein Hochdurchsatz-Screening (HTS)¹³, was potenziell einen Vorteil gegenüber In-vivo-Modellen bietet und große Organoidbibliotheken als Ersatz für die Patientenpopulation nutzt. PDOs sind bereit, eine wichtige Entdeckungs- und Übersetzungsplattform zu werden, die die vielen oben beschriebenen Einschränkungen von PDXs überwindet.

Sowohl PDO als auch PDX sind patientenbasierte und CSC-gesteuerte Modelle, die in der Lage sind, Therapeutika entweder im Rahmen einer personalisierten Behandlung oder eines klinischen Studienformats zu bewerten. Bestehende große Bibliotheken von PDXs, wie die proprietäre Sammlung von >3000 PDXs¹⁴,^15,16^,17, eignen sich daher für die schnelle Generierung von Bibliotheken von Tumororganoiden (PDX-abgeleitete Organoide oder PDXO), was zu einer abgestimmten Bibliothek von gepaarten PDX- und PDXO-Modellen führt. Dieser Bericht beschreibt das Verfahren zur Erstellung und Charakterisierung von Darmkrebs PDXO-CR2110 in Bezug auf sein elterliches PDX-CR2110 Modell¹⁶.

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Protokoll

Alle Protokolle und Änderungen oder Verfahren, die die Pflege und Verwendung von Tieren betreffen, wurden vor der Durchführung der Studien vom Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt. Die Pflege und Verwendung von Tieren wurde in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien der AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) durchgeführt, wie im Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council (2011) berichtet. Alle Tierversuche wurden unter sterilen Bedingungen in SPF-Einrichtungen (spezifisch pathogenfrei) durchgeführt und in strikter Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren verschiedener Regierungsinstitutionen (z. B. The National Institutes of Health) durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Ausschuss für die Ethik der Tierversuche an der Einrichtung (z. B. institutioneller IACUC-Ausschuss) genehmigt.

1. Vorbereitung auf die Tumortransplantation

1. Tierhaltung
   1. Haus Balb/c Nacktmäuse (n=5) in einzelnen belüfteten Käfigen, bei 20-26 °C, 30-70% Luftfeuchtigkeit und einem Beleuchtungszyklus von 12-h hell/12-h dunkel, mit wöchentlich gewechselter Maiskolbeneinstreu und Bestrahlung sterilisiertes Trockengranulatfutter plus steriles Trinkwasser ad libitum.
2. Präparation von Spendertumorfragmenten
   1. Überwachen Sie tumortragende Spendermäuse genau auf Körpergewicht (BW, über Waage) und Tumorvolumen (TV, durch Messschiebermessung).
   2. Wenn der Fernseher 800-1000 mm³erreicht, euthanasieren Sie die tumortragenden Tiere in einer biogefährlichen Haube.
      1. Legen Sie Mäuse in eine Euthanasiekammer mit einem Deckel, der CO_2-Gas in die Kammer abgibt. Entladen Sie Gas in die Kammer mit einer Durchflussrate, die schnelle Bewusstlosigkeit mit minimaler Belastung für das Tier erzeugt. Der optimale Durchfluss für CO_{2 liegt} bei etwa 2-2,5 Lpm.
      2. Stellen Sie die Euthanasie sicher, indem Sie beobachten, dass die Tiere das Bewusstsein nicht wiedererlangen.
      3. Nach dem offensichtlichen klinischen Tod den Gasfluss für >1 Min aufrechterhalten, um die Möglichkeit zu minimieren, dass sich ein Tier erholen kann.
   3. Sterilisieren Sie die Haut um den Tumor mit Jodophorabstrichen. Sammeln Sie Tumore, indem Sie benachbarte Nicht-Tumorgewebe entfernen und in eine Petrischale mit 20 ml PBS legen, die vor der Euthanasie vorgekühlt (4 °C) ist.
   4. Waschen Sie die Tumoren mit PBS in einer anderen Petrischale, um Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von halbieren und zusätzliche Haut, Blutgefäße, Verkalkungen und / oder Nekrose entfernen.
   5. Legen Sie nur intakte Tumorstücke in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit 20 ml PBS, bevor Sie es zur Transplantation in einen separaten Tierraum transportieren.

2. Subkutanes Tumorwachstum

1. Subkutane Impfung von Tumorstücken in immungeschwächte Mäuse
   1. Schneiden Sie den PDX-Tumor mit einem Skalpell in 2 mm große Stücke und legen Sie sie zur subkutanen (SC) Implantation in Trokare.
   2. Betäubung der Empfängertiere mit 5% Isofluran (gehalten durch einen Nasenkegel bei 1%). Die Tiere entspannen sich, verlieren ihren Aufrichtreflex und werden schließlich unbeweglich, bis sie nicht mehr auf Schmerzen reagieren. Fixieren Sie die betäubten Mäuse auf einem Experimentierbrett in der richtigen seitenseitigen Position und sterilisieren Sie mit Iodophorabstrichen, insbesondere die Bereiche, die den Ort der Tumorimpfung umgeben.
   3. Auf der linken Flankenhaut nur kranial zur Hüfte, machen Sie einen 0,5 cm Schnitt mit einem Skalpell und schaffen Sie einen Tunnel unter der Haut in Richtung vordere Stirn, 2-3 cm, mit stumpfer Zette.
   4. Übertragen Sie aseptisch einen Würfel Tumorfragment pro Impfstelle aus dem Medium und legen Sie tief in den subkutanen Tunnel. Bestätigen Sie visuell die Position des Fragments vor dem Schließen der Wunde mit Wundclips.
   5. Überwachen Sie die tumorimplantierten Mäuse (5), bis sie bei Bewusstsein sind, um das sternale Liegerad aufrechtzuerhalten, und bringen Sie sie erst nach ihrer vollständigen Genesung von der Anästhesie in ihren Käfig zurück.
2. Tumortragende Mäuse-Gesundheitsüberwachung
   1. Überprüfen Sie den Wasser- und Nahrungsverbrauch täglich und erfassen Sie wöchentlich das Körpergewicht.
   2. Überprüfen Sie die Mäuse während der Routineüberwachung. Erfassen Sie alle Auswirkungen auf Mobilität, Atmung, Pflege und allgemeines Aussehen, Nahrungs- und Wasserverbrauch, BW-Gewinn / -Verlust, Aszites usw.
   3. Messen Sie TV zweimal wöchentlich mit Bremssätteln und drücken Sie in mm³ per: TV = 0,5 a × b², wobei a und b die Länge bzw. Breite des Tumors sind.
   4. Opfere Tiere, um Proben zu sammeln, wenn eines der folgenden Anzeichen auftritt: BW-Verlust >20%; eingeschränkte Mobilität (nicht in der Lage zu essen oder zu trinken); nicht in der Lage, sich normal zu bewegen, aufgrund von signifikantem Aszites oder vergrößertem Bauch; Anstrengung in der Atmung; Tod.

3. Nekropsie und Tumorernte

1. Wenn das Tumorvolumen 200-800 mm³erreicht hat, euthanasieren Sie Mäuse gemäß den zugelassenen Protokollen (siehe Schritt 1.2.2).
2. Sammeln Sie Tumorgewebe, indem Sie benachbarte Nicht-Tumorgewebe entfernen, gefolgt von einem 50-ml-Kunststoffröhrchen mit AD+++ (auf Eis) vor der Dissoziation.

4. Vorbereitung für PDX-abgeleitete Organoidkultur

HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden in einer Biosicherheitswerkbank gemäß den Standardrichtlinien für Gewebekulturen durchgeführt. Bewahren Sie vorgewärmte Bestände von 96-, 24- und 6-Well-Platten vor Gebrauch in einem 37 °C-Inkubator auf.

1. Reagenzpräparate
   1. Bereiten Sie die Lösung des Basalmembranextrakts (BME) vor (Wachstumsfaktor reduziert, Phenolrot-frei). Bewahren Sie 10 ml BME über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank auf. Nach dem Auftauen die BME-Flasche schwenken, um die Dispersion zu gewährleisten.
   2. Bereiten Sie Basismedien / Waschpuffer AD++ vor. 5 ml 200 mM L-Glutamin, 1 M HEPES und Pen/Strep werden zu Advanced DMEM/F12-Medien hinzugefügt, indem Sie mit einer 5-ml-Pipette pipettieren.
   3. Herstellung des organoiden Darmmediums wie von Sato et al.¹⁸ beschrieben durch Ergänzung der Basismedien mit N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml), Nicotinamid (10 mM), SD202190 (10 nM), R-Spondin (500 ng/ml), L-Glutamin (2 mM), HEPES (10 μM), Penicillin-Streptomycin (1x) und Y-27623 (10 μM)¹⁹.
   4. AD+++Verdauungsmedium vorbereiten: 10 ml 1x organoide Kulturmedien mit 500 μL Kollagenase Typ II (20 mg/ml) und 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM).
2. Tumordissoziation²⁰
   1. Übertragen Sie den Tumor in einem 50 ml Kunststoffschlauch in eine 10 cm große Petrischale. Machen Sie ein makroskopisches Foto neben einem Lineal und zeichnen Sie eine Beschreibung seiner Bedingungen auf (z. B. Größe, Fettgewebe, Vaskularisation, Nekrose usw.).
   2. Entfernen Sie überschüssiges AD+++ durch Aspiration und schneiden Sie das Tumorgewebe mit einer Schere in kleine Stücke, gefolgt von der Übertragung von 1-2 Stücken in ein 2 ml Mikroröhrchen zum Einfrieren auf Trockeneis. Für die genomische Profilierung bei -80 °C lagern. Die restlichen Stücke mit einer Schere in feinere Stücke schneiden, bevor sie mit AD+++ in ein 50-ml-Kunststoffrohr überführen werden.
   3. Hackfleisch 2-3 mal mit 35 ml AD+ waschen, gefolgt von zugabe von 10 ml Verdauungsmedium (siehe Schritt 4.1.4) und Platzierung auf einem Orbitalschüttler bei 4 x g für 1 h bei 37 °C.
   4. Homogenisieren Sie das verdaute Gewebe durch Pipettieren nach oben und unten mit einer sterilen 5-ml-Kunststoffpipette, gefolgt von der Zugabe von 20 ml AD+++ und der Filtration durch 100 μm Zellsieb.
   5. Waschen Sie den Durchlauf zweimal mit AD+++ (spinnen Sie bei 450 x g für 5 min), gefolgt von einer Resuspension in BME (fügen Sie 4x Volumen BME zum Pellet zur Suspension hinzu) und halten Sie es auf Eis¹⁹.
3. Herstellung der Organoidkultur
   1. Fügen Sie die BME-Zellsuspension in mehreren Tropfen zu insgesamt 200 μL pro Vertiefung in die 6-Well-Platte ein.
   2. Die Platte wird in einen 37 °C Inkubator überführen. Nach 30 min erstarren die Geltropfen.
   3. Fügen Sie 2 ml organoide Medien zu jeder Vertiefung hinzu, wobei die repräsentativen Tropfen durch mikroskopische Fotografie aufgezeichnet werden, bevor sie in einen Inkubator überführt werden (37 °C und 5% CO₂).
   4. Halten Sie die Organoidkulturen mit Mediumswechsel alle 3-4 Tage und Passage im Verhältnis 1: 2 alle 7 Tage oder abhängig von ihrem Wachstum und ihrer Dichte.

5. Histopathologie und Next Generation Sequencing (NGS) Analyse

1. Histopathologie
   1. Sammeln Sie Organoide aus dem Brunnen mit dem vorhandenen Medium mit einer P1000-Pipette, gefolgt von Zentrifugation (Spin bei 450 x g für 5 min), Waschen mit PBS und Fixieren in 10% Formalin für 1 h.
   2. Legen Sie die fixierten Organoide in 100% Gelatine am Boden des konischen Röhrchens von 50 ml, gefolgt von einer routinemäßigen Gewebeverarbeitung und Einbettung.
   3. Führen Sie hämatoxylin-eosin (H & E) -Färbung mit Standardprotokollen auf 4 mm Paraffinabschnitten durch.
2. RNAseq- und Whole-Exom-Sequenzierung
   1. Sammeln Sie Organoide aus dem Brunnen mit dem vorhandenen Kulturmedium mit einer P1000-Pipette, gefolgt von der Zentrifugation mit einer Mikrozentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (12.000 x g)für 5 min bei 4 °C.
   2. Sammeln Sie das Pellet, indem Sie den mittleren Überstand entfernen, um sicherzustellen, dass kein sichtbares BME vorhanden ist, gefolgt von einem Schnappgefrieren in einem Mikroröhrchen (Trockeneis) und dann in einen -80 ° C-Gefrierschrank überführen.
   3. Extrahieren Sie RNA oder DNA mit einem Standardverfahren von Herstellern und führen Sie NGS-Analysen sowohl für RNAseq als auch für die Gesamtetomsequenzierung (WES) durch.

6. IC₅₀ Assay²⁰

1. Organoid-Aussaat in 384-Well-Platte für IC_50-Assay
   1. Dissoziieren Sie Organoide in BME-Tropfen aus jeder Vertiefung (Verdauung von BME), indem Sie 20 μL 100x Dispaselösung zu jeder Vertiefung (6-Well-Platte) hinzufügen, die 2 ml organoides Medium enthielt, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 37 ° C.
   2. Pipette verdaute Organoide aus allen Vertiefungen durch einen 70 μm-Filter in ein 50-ml-Kunststoffröhrchen, um die Organoide zu sammeln.
   3. Zählen Sie die Organoide unter Mikroskopie zur Bestimmung der Organoidkonzentration. Suspendieren Sie die Organoide mit Kulturmedium, bevor Sie BME hinzufügen, um eine Endkonzentration von 5% (v / v) auf Eis zu erreichen.
   4. Fügen Sie 50 μL der Organoidsuspension in jede 384-Well-Platte mit dem Flüssigkeitsspender hinzu, gemäß der Plattenkarte mit einer Aussaatdichte von 200 CR2110 PDXOs pro Vertiefung in entsprechendem Organoidkulturmedium.
2. Cisplatin und Irinotecan Behandlung
   1. Verwenden Sie Cisplatin (mit der höchsten Konzentration von 100 μM) und "Irinotecan" (mit der höchsten Konzentration von 10 μM). Fügen Sie SN-38 (ein Metabolit von Irinotecan, im Gegensatz zu Irinotecan, das normalerweise für In-vivo-Studien verwendet wird) zu jeder Vertiefung gemäß dem Verdünnungsschema des Arzneimittels für 9 Dosen in serieller Verdünnung durch digitales Dispener hinzu.
   2. Erstellen Sie die Platemap mit dem Software-Tool für digitale Spender. Fügen Sie ein Negativkontrollfahrzeug mit 100% Lebensfähigkeit und postiver Kontrolle von 5 μM Starurosporin ein, das 0% Lebensfähigkeit zeigte.
   3. Legen Sie die mit Medikamenten behandelten 384-Well-Platten wieder in einen 37 °C-Inkubator.
3. Bestimmung der Lebensfähigkeit von Organoidzellen nach medikamentöser Behandlung
   1. Bestimmen Sie am Ende der 5 Tage der medikamentösen Behandlung die Lebensfähigkeit der Organoidzellen mit lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsreagenzien gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Verfahren. Fügen Sie mit dem flüssigen Dispener in jede Vertiefung ein lumineszierendes Reagenz hinzu und mischen Sie es für 5 minuten auf einem Plattenschüttler, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   2. Zeichnen Sie das Lumineszenzsignal auf einem Lumineszenz-Multi-Well-Plattenleser auf.
   3. Berechnen Sie die normalisierten Viabilitäten jeder Vertiefung unter Verwendung der Rohwerte des Plattenlesers und erstellen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve und IC_50-Werte durch nichtlineare Kurvenanpassung.

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Ergebnisse

Morphologie von PDXOs, typisch für Organoide unter Lichtmikrokopie und konsistent mit elterlicher PDX pro H & E-Färbung
Unter Lichtmikroskopie zeigt PDXO-CR2110 eine typische zystische Morphologie (Abbildung 1A), wie zuvor für patientenabgeleitete Organoide (PDO) beschrieben, die die Ähnlichkeit zwischen PDXO und PDO unter den gleichen Kulturbedingungen unterstützen.

Die histopathologische Untersuchung durch H&E-Färbung zeigt, dass die Ge...

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Diskussion

Die vorläufigen Daten für PDX-/PDXO-CR2110 in diesem Bericht unterstützen die biologische Äquivalenz zwischen PDX und seinem Derivat PDXO in Bezug auf Genomik, Histopathologie und Pharmakologie, da beide Modelle die Krankheitsformen darstellen, die vom ursprünglichen CSC des Patienten abgeleitet wurden. Beide Modelle sind patientenbasierte Krankheitsmodelle, die potenziell das klinische Ansprechen der Patienten¹⁰,^11,12...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634028	Base medium
DMEM	Hyclone	SH30243.01	Washing medium
Collagenese type II	Invitrogen	17101015	Digest tumor
Matrigel	Corning	356231	Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac	Sigma	A9165	Organoid culture medium
A83-01	Tocris	2939	Organoid culture medium
B27	Life Technologies	17504044	Organoid culture medium
EGF	Peprotech	AF-100-15	Organoid culture medium
Noggin	Peprotech	120-10C	Organoid culture medium
Nicotinamide	Sigma	N0636	Organoid culture medium
SB202190	Sigma	S7076	Organoid culture medium
Gastrin	Sigma	G9145	Organoid culture medium
Rspondin	Peprotech	120-38-1000	Organoid culture medium
L-glutamine	Life Technologies	35050038	Organoid culture medium
Hepes	Life Technologies	15630056	Organoid culture medium
penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140122	Organoid culture medium
Y-27632	Abmole	M1817	Organoid culture medium
Dispase	Life Technologies	17105041	Screening assay
CellTiter-Glo 3D	Promega	G9683	Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser	Thermo Fisher	Multidrop combi	Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener	Tecan	D300e	Compound addition
Envision Plate reader	Perkin Elmer	2104	Luminescence reading
Balb/c nude mice	Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit	Qiagen	74104	tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA purification kit
Histogel	Thermo Fisher	HG-4000-012	Organoid embedding