Создание соответствующих пар моделей IN vivo/In vitro, полученных от пациента, органоидов PDX и PDX для исследований фармакологии рака

Резюме

Описан способ создания органоидов с использованием полученных от пациента ксенотрансплантатов (PDX) для скрининга in vitro, в результате чего получаются совпадают пары моделей in vivo /in vitro. Опухоли PDX собирали / перерабатывали на мелкие кусочки механически или ферментаматически, за которым следовал метод Клеверса для выращивания опухолевых органоидов, которые были проницаемы, криоконсервированы и охарактеризованы против оригинального PDX.

Аннотация

Полученные от пациента опухолевые ксенотрансплантаты (PDX) считаются наиболее прогностическими доклиническими моделями, которые, как полагают, в значительной степени основаны на раковых стволовых клетках (CSC) для обычной оценки лекарств от рака. Большая библиотека PDX отражает разнообразие популяций пациентов и, таким образом, позволяет проводить доклинические испытания на основе популяций («Фаза II-подобных клинических испытаний на мышах»); однако PDX имеют практические ограничения низкой пропускной способности, высоких затрат и длительности. Опухолевые органоиды, также производные от пациента моделями, управляемыми CSC, можно рассматривать как эквивалент PDX in vitro, преодолевая определенные ограничения PDX для работы с большими библиотеками органоидов или соединений. Это исследование описывает метод создания органоидов, полученных из PDX (PDXO), что приводит к парным моделям для фармакологических исследований in vitro и in vivo. Подкожно пересаженные опухоли PDX-CR2110 были собраны у опухоленосных мышей, когда опухоли достигали 200-800^мм3,согласно утвержденной процедуре вскрытия, с последующим удалением соседних неопухолевых тканей и диссоциацией на мелкие фрагменты опухоли. Небольшие фрагменты опухоли промывали и пропускали через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм для удаления обломков. Кластеры клеток собирали и суспендировали в растворе экстракта базальной мембраны (BME) и покрыли 6-скважинной пластиной в виде твердой капли с окружающей жидкой средой для роста в инкубаторе CO_2. Рост органоидов контролировали два раза в неделю под световой микроскопией и регистрировали фотографированием с последующим изменением жидкой среды 2 или 3 раза в неделю. Выращенные органоиды были дополнительно проходимы (через 7 дней) в соотношении 1:2 путем разрушения встроенных органоидов BME с помощью механической сдвига, чему способствовало добавление трипсина и добавление 10 мкМ Y-27632. Органоиды были криоконсервированы в криотрубках для длительного хранения после высвобождения из BME путем центрифугирования, а также отобраны (например, ДНК, РНК и блок FFPE) для дальнейшей характеристики.

Введение

Рак — это совокупность разнообразных генетических и иммунологических нарушений. Успешная разработка эффективных методов лечения в значительной степени зависит от экспериментальных моделей, которые эффективно предсказывают клинические результаты. Большие библиотеки хорошо охарактеризованных ксенотрансплантатов, полученных от пациента (PDX), уже давно рассматриваются как трансляционная система in vivo выбора для тестирования химио- и / или таргетной терапии из-за их способности резюмировать характеристики опухоли пациента, гетерогенность и реакцию пациента на лекарства^1,что позволяет клиническим испытаниям на мышах, подобным фазе^II,улучшить клинический успех^2,3. PDX обычно рассматриваются как заболевания раковых стволовых клеток, отличающиеся генетической стабильностью, в отличие от ксенотрансплантатов, полученных из клеточных линий^2. За последние несколько десятилетий во всем мире были созданы большие коллекции PDX, которые сегодня становятся рабочей лошадкой разработки лекарств от рака. Несмотря на широкое использование и большую трансляционную ценность, эти модели животных по своей сути являются дорогостоящими, трудоемкими и малопроизводительными, поэтому недостаточны для крупномасштабного скрининга. PDX также нежелательны для иммуноонкологического тестирования (IO) из-за иммуноскомпрометированной природы^4. Таким образом, нецелесообразно в полной мере использовать доступную большую библиотеку PDX.

Недавние открытия, впервые сделанные лабораторией Ганса Клеверса^5,привели к созданию in vitro культур органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток, в большинстве органов человека эпителиального происхождения^5. Эти протоколы были дополнительно доработаны, чтобы обеспечить рост органоидов из предполагаемых CSC при карциномах человека различных показаний^6,7. Эти органоиды, полученные от пациента (PPO), являются геномно-стабильными^8,9 и, как было показано, высоко прогнозируют результаты клинического^{лечения 10,11,12.} Кроме того, природа PPO in vitro обеспечивает высокопроизводительный скрининг (HTS)^13,тем самым потенциально предлагая преимущество перед моделями in vivo и используя большие библиотеки органоидов в качестве суррогата популяции пациентов. PPO готовы стать важной платформой для открытий и трансляции, преодолевая многие ограничения PDX, описанные выше.

Как PDO, так и PDX являются моделями, полученными от пациентов и управляемыми CSC, с возможностью оценки терапевтических средств в контексте либо персонализированного лечения, либо формата клинических испытаний. Существующие большие библиотеки PDX, такие как собственная коллекция >3000 PDXs^14,15,16,17,поэтому подходят для быстрой генерации библиотек опухолевых органоидов (PDX-производных органоидов или PDXO), что приводит к сопоставлению библиотеки парных моделей PDX и PDXO. В настоящем отчете описана процедура создания и характеристики колоректального рака PDXO-CR2110 по отношению к его родительской модели PDX-CR2110^16.

протокол

Все протоколы и поправки или процедуры, связанные с уходом за животными и их использованием, были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) до проведения исследований. Уход и использование животных проводились в соответствии с Международными руководящими принципами AAALAC (Ассоциация по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными), как сообщается в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, Национальный исследовательский совет (2011). Все экспериментальные процедуры на животных проводились в стерильных условиях в учреждениях SPF (без конкретных патогенов) и проводились в строгом соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию из различных государственных учреждений (например, Национальных институтов здравоохранения). Протоколы были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных в учреждении учреждения (например, институциональным комитетом IACUC).

1. Подготовка к трансплантации опухоли

1. Содержание животных
   1. Дом бальб/с обнаженных мышей (n=5) в отдельных вентилируемых клетках, при 20-26 °C, влажности 30-70% и цикле освещения 12-ч света/12-ч темноты, с еженедельной подстилкой из кукурузных початков и облучением стерилизованной сухой гранулированной пищи плюс стерильная питьевая вода ad libitum.
2. Подготовка фрагмента донорской опухоли
   1. Внимательно следите за опухолевыми донорскими мышами на наличие массы тела (BW, через весы) и объема опухоли (TV, путем измерения суппорта).
   2. Когда телевизор достигнет 800-1000^мм3,усыплите опухоленосных животных в капюшон биологической опасности.
      1. Поместите мышей в камеру эвтаназии с крышкой, которая доставляет газ CO₂ в камеру. Сброс газа в камеру со скоростью потока, которая производит быстрое бессознательное состояние с минимальным дистрессом для животного. Оптимальный расход для CO₂ составляет около 2-2,5 л/мин.
      2. Обеспечьте эвтаназию, наблюдая, что животные не восстанавливают сознание.
      3. После очевидной клинической смерти поддерживайте поток газа в течение >1 мин, чтобы свести к минимуму вероятность того, что животное может выздороветь.
   3. Стерилизуйте кожу вокруг опухоли с помощью йодофорных тампонов. Соберите опухоли, удалив соседние неопухолевые ткани и поместив в чашку Петри, содержащую 20 мл PBS, предварительно охлажденный (4 ° C) перед эвтаназией.
   4. Промыть опухоли pBS в другой чашке Петри, чтобы удалить компоненты крови, а затем разрезать пополам и удалить лишнюю кожу, кровеносные сосуды, кальцификацию и / или некроз.
   5. Поместите только неповрежденные кусочки опухоли в стерильную 50-мл центрифужную трубку с 20 мл PBS перед транспортировкой в отдельную комнату для трансплантации животных.

2. Рост подкожной опухоли

1. Подкожная инокуляция опухолевого куска мышам с ослабленным иммунитетом
   1. Разрежьте опухоль PDX на кусочки по 2 мм скальпелем и поместите каждую в троакары для подкожной (SC) имплантации.
   2. Обезболивать животных-реципиентов 5% изофлурана (поддерживается носовым конусом на уровне 1%). Животные расслабляются, теряя свой правый рефлекс и в конечном итоге становясь неподвижными, пока не реагируют на боль. Зафиксируйте обезболенные мыши на экспериментальной доске в правильном боковом положении и стерилизуйте йодофорными тампонами, особенно области, окружающие место прививки опухоли.
   3. На левом фланге кожи как раз черепно к бедру делают разрез 0,5 см скальпелем и создают туннель под кожей в сторону передних конечностей, 2-3 см, используя тупые щипцы.
   4. Асептически перенести один куб фрагмента опухоли на место прививки из среды и поместить глубоко внутрь подкожного туннеля. Визуально подтвердить положение фрагмента до закрытия раны раневыми клипсами.
   5. Следите за опухолью имплантированных мышей (5) до тех пор, пока они не пристанут в сознание, чтобы сохранить стернальное лежание, а затем верните их в свою клетку только после их полного восстановления после анестезии.
2. Мониторинг здоровья опухоленосных мышей
   1. Проверяйте потребление воды и пищи ежедневно и регистрируйте массу тела еженедельно.
   2. Проверьте мышей во время обычного мониторинга. Регистрировать любые эффекты на подвижность, дыхание, уход и общий внешний вид, потребление пищи и воды, увеличение / потерю BW, асцит и т. Д.
   3. Измеряют ТВ два раза в неделю с помощью суппортов и экспресс в мм³ пер: ТВ = 0,5 а × b², где a и b — длина и ширина опухоли соответственно.
   4. Жертвоприношение животных для сбора образцов при появлении любого из следующих признаков: потеря БО >20%; нарушение подвижности (неспособность есть или пить); неспособность нормально двигаться из-за значительного асцита или увеличения живота; усилие в дыхании; смерть.

3. Некропсия и сбор опухолей

1. Когда объем опухоли достигнет 200-800^мм3,усыплите мышей по утвержденным протоколам (см. шаг 1.2.2).
2. Соберите опухолевые ткани, удалив соседние неопухолевые ткани, а затем поместив ткань в пластиковую трубку объемом 50 мл с AD + ++ (на льду) перед диссоциацией.

4. Подготовка к органоидной культуре, полученной из PDX

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги были выполнены внутри шкафа биобезопасности в соответствии со стандартными рекомендациями по культуре тканей. Перед использованием храните предварительно нагретые запасы плит из 96, 24 и 6 скважин в инкубаторе с 37 °C.

1. Препараты реагентов
   1. Готовят раствор экстракта базальной мембраны (BME) (фактор роста снижен, фенол не содержит красного цвета). Хранить 10 мл BME в холодильнике с 4 °C на ночь. После размораживания закрутите бутылку BME, чтобы обеспечить диспергирование.
   2. Подготовьте базовый носитель/буфер мойки AD+++. Добавьте 5 мл 200 мМ L-глутамина, 1 М HEPES и Pen/Strep в жим Advanced DMEM/F12 путем пипетки 5 мл.
   3. Готовят органоидную среду толстой кишки, как описано Sato et al.^18, путем дополнения базовых сред N-Ac (1 мМ), A83-01 (500 нМ), B27 (1x), EGF (50 нг / мл), Ноггин (100 нг / мл), никотинамид (10 мМ), SD202190 (10 нМ), R-спондин (500 нг / мл), L-глутамин (2 мМ), HEPES (10 мкМ), пенициллин-стрептомицин (1x) и Y-27623 (10 мкМ)^19.
   4. Приготовьте AD+++Пищеварительную среду: 10 мл 1x органоидной культуральной среды с 500 мкл коллагеназы типа II (20 мг/мл) и 10 мкл RhoKI Y-27632 (10 мМ).
2. Диссоциация опухоли²⁰
   1. Перенесите опухоль в пластиковой трубке объемом 50 мл в чашку Петри 10 см. Сделайте макроскопическую фотографию рядом с линейкой и запишите описание ее состояния (например, размер, жировые ткани, васкуляризация, некроз и т. Д.).
   2. Удалите избыток AD+++ путем аспирации и разрежьте опухолевую ткань на мелкие кусочки ножницами с последующим переносом 1-2 кусочков в микротрубку объемом 2 мл для замораживания на сухом льду. Хранить при -80 °C для геномного профилирования. Измечить оставшиеся кусочки на более мелкие кусочки ножницами перед переносом в пластиковую трубку объемом 50 мл с помощью AD+++.
   3. Промыть измельченную ткань 2-3 раза по 35 мл AD+++, с последующим добавлением 10 мл среды для пищеварения (см. этап 4.1.4) и размещением на орбитальном шейкере при 4 х г в течение 1 ч при 37 °C.
   4. Гомогенизировать переваренные ткани путем пипетирования вверх и вниз с использованием 5 мл стерильной пластиковой пипетки с последующим добавлением 20 мл AD+++ и фильтрацией 100 мкм клеточным ситечком.
   5. Промыть проход дважды AD+++ (открутить при 450 х г в течение 5 мин), затем повторно суспендировать в БМЭ (добавить 4х объем БМЭ в гранулу для суспензии) и держать на^{льду 19.}
3. Приготовление органоидной культуры
   1. Добавьте суспензию ячейки BME в 6-скважинную пластину несколькими каплями в общей сложности до 200 мкл на скважину.
   2. Перенесите пластину в инкубатор при 37 °C. Через 30 мин гелевые капли затвердевает.
   3. Добавьте 2 мл органоидных сред в каждую скважину, при этом репрезентативные капли регистрируются микроскопической фотографией перед переносом в инкубатор (37 °C и 5% CO_2).
   4. Поддерживают органоидные культуры со средним изменением каждые 3-4 дня и прохождением в соотношении 1:2 каждые 7 дней или в зависимости от их роста и плотности.

5. Анализ гистопатологии и секвенирования следующего поколения (NGS)

1. Гистопатология
   1. Собирают органоиды из скважины с имеющейся средой с помощью пипетки Р1000 с последующим центрифугированием (отжим при 450 х г в течение 5 мин), промывкой ПБС и фиксацией в 10% формалине в течение 1 ч.
   2. Поместите неподвижные органоиды в 100% желатин на дно конической трубки 50 мл с последующей рутинной обработкой и встраиванием тканей.
   3. Выполняйте окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) с использованием стандартных протоколов на 4 мм парафиновых сечениях.
2. RNAseq и секвенирование всего экзома
   1. Собирают органоиды из скважины с существующей питательной средой с помощью пипетки P1000 с последующим центрифугированием с использованием микроцентрифуги на максимальной скорости (12 000 х г)в течение 5 мин при 4 °C.
   2. Соберите гранулу, удалив супернатант среды, чтобы убедиться, что не было видимого BME, с последующим замораживанием в микропробирке (сухом льду), а затем перенесите в морозильную камеру с температурой -80 °C.
   3. Извлеките РНК или ДНК с использованием стандартной процедуры от производителей и выполните анализ NGS как для RNAseq, так и для секвенирования всего экзома (WES).

6. Ic₅₀ анализ²⁰

1. Посев органоидов в 384-скважинную пластину для анализа IC₅₀
   1. Диссоциация органоидов в каплях BME из каждой скважины (переваривание BME) путем добавления 20 мкл 100-кратного диспазного раствора в каждую скважину (6-скважинную пластину), которая содержала 2 мл органоидной среды с последующим 10 мин инкубации при 37 °C.
   2. Пипетка переварила органоиды из всех скважин через фильтр 70 мкм в пластиковую трубку объемом 50 мл для сбора органоидов.
   3. Подсчитайте органоиды под микроскопией для определения концентрации органоидов. Приостановить органоиды, используя культуральную среду, перед добавлением BME для достижения конечной концентрации 5% (v/v) на льду.
   4. Добавьте 50 мкл органоидной суспензии в каждую 384-скважинную пластину с жидкостным дозатором, согласно карте пластин с плотностью посева 200 CR2110 PDXOs на скважину в соответствующей органоидной питательной среде.
2. Лечение цисплатином и иринотеканом
   1. Используют цисплатин (с наибольшей концентрацией 100 мкМ) и «иринотекан» (с самой высокой концентрацией 10 мкМ). Добавляют SN-38 (метаболит иринотекана, в отличие от иринотекана, который обычно используют для исследований in vivo) в каждую скважину по схеме разведения препарата на 9 доз, в серийном разведении цифровым диспенсером.
   2. Создайте карту пластин с помощью программного обеспечения цифрового дозатора. Включите автомобиль с отрицательным управлением со 100% жизнеспособностью и постивным контролем 5 мкМ старуроспорина, который показал 0% жизнеспособность.
   3. Поместите обработанные препаратом 384-скважинные пластины обратно в инкубатор с 37 °C.
3. Определение жизнеспособности органоидных клеток после медикаментозного лечения
   1. В конце 5 дней лечения препаратом определяют жизнеспособность органоидных клеток с помощью реагентов жизнеспособности люминесцентных клеток в соответствии с рекомендованной производителем процедурой. Добавьте люминесцентный реагент в каждую скважину с жидким диспенером и перемешайте в течение 5 минут на пластинчатом шейкере, после чего 30 минут инкубируйте при комнатной температуре в темноте.
   2. Запись люминесцентного сигнала на люминесцентный многоязычный пластинчатый считыватель.
   3. Рассчитайте нормализованные жизнеспособности каждой скважины, используя необработанные показания считывателя пластин, и создайте кривую доза-отклик и значения IC₅₀ путем нелинейной подгонки кривой.

Результаты

Морфология PDXOs, типичная для органоидов при световой микроскопии и согласующаяся с родительским PDX на окрашивание H&E
При световой микроскопии PDXO-CR2110 демонстрирует типичную кистозную морфологию(рисунок 1A),как описано ранее для органоидов, полученных от пациен...

Обсуждение

Предварительные данные для PDX-/PDXO-CR2110 в этом отчете подтверждают биологическую эквивалентность между PDX и его производным, PDXO, в отношении геномики, гистопатологии и фармакологии, поскольку обе модели представляют формы заболевания, полученные из исходного CSC пациента. Обе модели являю?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634028	Base medium
DMEM	Hyclone	SH30243.01	Washing medium
Collagenese type II	Invitrogen	17101015	Digest tumor
Matrigel	Corning	356231	Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac	Sigma	A9165	Organoid culture medium
A83-01	Tocris	2939	Organoid culture medium
B27	Life Technologies	17504044	Organoid culture medium
EGF	Peprotech	AF-100-15	Organoid culture medium
Noggin	Peprotech	120-10C	Organoid culture medium
Nicotinamide	Sigma	N0636	Organoid culture medium
SB202190	Sigma	S7076	Organoid culture medium
Gastrin	Sigma	G9145	Organoid culture medium
Rspondin	Peprotech	120-38-1000	Organoid culture medium
L-glutamine	Life Technologies	35050038	Organoid culture medium
Hepes	Life Technologies	15630056	Organoid culture medium
penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140122	Organoid culture medium
Y-27632	Abmole	M1817	Organoid culture medium
Dispase	Life Technologies	17105041	Screening assay
CellTiter-Glo 3D	Promega	G9683	Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser	Thermo Fisher	Multidrop combi	Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener	Tecan	D300e	Compound addition
Envision Plate reader	Perkin Elmer	2104	Luminescence reading
Balb/c nude mice	Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit	Qiagen	74104	tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA purification kit
Histogel	Thermo Fisher	HG-4000-012	Organoid embedding