Creación de pares de modelos in vivo/in vitro derivados de pacientes de PDX y organoides derivados de PDX para la investigación farmacológica del cáncer

Resumen

Un método se describe para crear organoids usando los xenografts paciente-derivados (PDX) para la investigación in vitro, dando por resultado pares hechos juego de modelos in vivo/ines vitro. Los tumores de PDX fueron cosechados/procesados en pedazos pequeños mecánicamente o enzimático, seguidos por el Clevers' método para crecer los organoids del tumor que fueron pasados, cryopreserved y caracterizados contra el PDX original.

Resumen

Los xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (PDXs) se consideran los modelos preclínicos más predictivos, en gran parte se cree que son impulsados por células madre cancerosas (CSC) para la evaluación convencional de medicamentos contra el cáncer. Una gran biblioteca de PDXs refleja la diversidad de las poblaciones de pacientes y, por lo tanto, permite ensayos preclínicos basados en la población ("Ensayos clínicos con ratones tipo Fase II"); sin embargo, PDX tiene limitaciones prácticas de bajo rendimiento, altos costos y larga duración. Los organoides tumorales, también siendo modelos impulsados por CSC derivados por pacientes, pueden considerarse como el equivalente in vitro de PDX, superando ciertas limitaciones de PDX para tratar con grandes bibliotecas de organoides o compuestos. Este estudio describe un método para crear los organoids PDX-derivados (PDXO), así dando por resultado los modelos apareados para la investigación in vitro e in vivo de la farmacología. los tumores Subcutáneo-trasplantados PDX-CR2110 fueron recogidos de ratones del tumor-cojinete cuando los tumores alcanzaron 200-800 milímetros^3,por un procedimiento aprobado de la autopsia, seguido por el retiro de los tejidos adyacentes del no-tumor y la disociación en pequeños fragmentos del tumor. Los pequeños fragmentos de tumor se lavaron y pasaron a través de un colador celular de 100 μm para eliminar los desechos. Los racimos celulares fueron recogidos y suspendidos en la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) y plateados en una placa de 6 pozos como gotita sólida con los medios líquidos circundantes para el crecimiento en una incubadora del CO_2. El crecimiento organoide fue supervisado dos veces semanalmente bajo microscopia ligera y registrado por la fotografía, seguida por el cambio medio líquido 2 o 3 veces por semana. Los organoides crecidos fueron pasados más a fondo (7 días más adelante) en un ratio 1:2 interrumpiendo los organoids encajados BME usando el esquileo mecánico, ayudado por la adición de tripsina y la adición de 10 μM Y-27632. Los organoides fueron criopreservados en crio-tubos para almacenamiento a largo plazo, después de la liberación de BME por centrifugación, y también muestreados (por ejemplo, ADN, ARN y bloque FFPE) para su posterior caracterización.

Introducción

Los cánceres son una colección de diversos trastornos genéticos e inmunológicos. El desarrollo exitoso de tratamientos efectivos depende en gran medida de los modelos experimentales que predicen eficazmente los resultados clínicos. Las bibliotecas grandes de xenoinjertos paciente-derivados bien-caracterizados (PDX) se han visto durante mucho tiempo como el sistema in vivo traslacional de la opción para probar chemo- y/o terapias apuntadas debido a su capacidad de recapitular características del tumor paciente, heterogeneidad y respuesta de la droga paciente^1,así permitiendo que la fase II-como los ensayos clínicos del ratón mejore éxito clínico^2,3. Los PDX se consideran generalmente como enfermedades de células madre cancerosas, con estabilidad genética, en contraste con los xenoinjertos derivados de la línea celular². En las últimas décadas, se han creado grandes colecciones de PDXs en todo el mundo, convirtiéndose en el caballo de batalla del desarrollo de medicamentos contra el cáncer en la actualidad. Aunque son ampliamente utilizados y con un gran valor de traslación, estos modelos animales son intrínsecamente costosos, consumen mucho tiempo y bajo rendimiento, por lo tanto, inadecuados para el cribado a gran escala. Los PDX también son indeseables para las pruebas de inmunooncología (IO) debido a una naturaleza inmunocomprocomprotege⁴. Por lo tanto, no es práctico aprovechar al máximo la gran biblioteca disponible de PDXs.

Descubrimientos recientes, iniciados por el laboratorio⁵de Hans Clevers, han llevado al establecimiento de cultivos in vitro de organoides generados a partir de células madre adultas en la mayoría de los órganos humanos de origen epitelial^5. Estos protocolos se han perfeccionado aún más para permitir el crecimiento de organoides a partir de supuestos CSCs en carcinomas humanos de diversas indicaciones^6,7. Estos organoides derivados de pacientes (DOP) son genómicamente estables^8,9 y se ha demostrado que son altamente predictivos de los resultados del tratamiento clínico^10,11,12. Además, la naturaleza in vitro de las DOP permite el cribado de alto rendimiento (HTS)^13,lo que potencialmente ofrece una ventaja sobre los modelos in vivo y aprovecha las grandes bibliotecas organoides como sustituto de la población de pacientes. Las DOP están preparadas para convertirse en una importante plataforma de descubrimiento y traslación, superando las muchas limitaciones de las PDX descritas anteriormente.

Tanto la DOP como la PDX son modelos derivados de pacientes e impulsados por CSC, con la capacidad de evaluar la terapéutica en el contexto de un tratamiento personalizado o un formato de ensayo clínico. Las grandes bibliotecas existentes de PDXs, como la colección patentada de >3000 PDXs^14,15,16,17,son por lo tanto adecuadas para la rápida generación de bibliotecas de organoides tumorales (organoides derivados de PDX, o PDXO), lo que resulta en una biblioteca emparejada de modelos pdx y pdxo emparejados. Este informe describe el procedimiento para crear y para caracterizar el cáncer colorrectal PDXO-CR2110 en lo referente a su modelo^{parental 16}de PDX-CR2110.

Protocolo

Todos los protocolos y enmiendas o procedimientos relacionados con el cuidado y uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Crown Bioscience (IACUC) antes de realizar los estudios. El cuidado y uso de los animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices internacionales de la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio) según lo informado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación (2011). Todos los procedimientos experimentales en animales se llevaron a cabo en condiciones estériles en instalaciones libres de patógenos específicos y se llevaron a cabo en estricta conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de diferentes instituciones gubernamentales (por ejemplo, los Institutos Nacionales de Salud). Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la institución de la instalación (por ejemplo, el Comité institucional de la IACUC).

1. Preparación para el trasplante de tumores

1. Alojamiento de animales
   1. Casa Balb / c ratones desnudos (n = 5) en jaulas ventiladas individuales, a 20-26 ° C, 30-70% de humedad, y un ciclo de iluminación de 12 h luz / 12-h oscuro, con ropa de cama de mazorca de maíz cambiada semanalmente, y la irradiación esterilizada alimentos gránulos secos más agua potable estéril ad libitum.
2. Preparación de fragmentos tumorales de donantes
   1. Vigile de cerca a los ratones donantes que contienen tumores para el peso corporal (BW, vía la balanza de pesaje), y el volumen del tumor (TV, por la medida de la pinza).
   2. Cuando la TV alcanza los 800-1000 mm^3,eutanasia a los animales que contienen tumores en una capucha de riesgo biológico.
      1. Coloque los ratones en una cámara de eutanasia con una tapa que entregue gas CO₂ a la cámara. Descargue gas en la cámara a una velocidad de flujo que produzca una rápida inconsciencia con una angustia mínima para el animal. El caudal óptimo para el CO₂ es de alrededor de 2-2,5 Lpm.
      2. Asegurar la eutanasia observando que los animales no recuperan la conciencia.
      3. Después de la muerte clínica aparente, mantenga el flujo de gas durante >1 minuto para minimizar la posibilidad de que un animal pueda recuperarse.
   3. Esterilizar la piel alrededor del tumor usando hisopos de yodoforo. Recoger los tumores mediante la extracción de tejidos adyacentes no tumorales y la colocación en una placa de Petri que contiene 20 mL de PBS, pre-refrigerado (4 °C) antes de la eutanasia.
   4. Lave los tumores con PBS en otra placa de Petri para eliminar los componentes sanguíneos seguidos de cortar por la mitad y eliminar cualquier piel, vasos sanguíneos, calcificación y/o necrosis adicionales.
   5. Coloque solo piezas tumorales intactas en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL con 20 mL de PBS, antes de transportarlos a una sala de animales separada para su trasplante.

2. Crecimiento tumoral subcutáneo

1. Inoculación subcutánea del pedazo del tumor en ratones immunocompromised
   1. Corte el tumor pdx en pedazos de 2 milímetros con un bisturí, y coloque cada uno en los trocars para la implantación subcutánea (SC).
   2. Anestesiar a los animales receptores con isoflurano al 5% (mantenido por un cono nasal al 1%). Los animales se relajan, perdiendo su reflejo corrector y eventualmente quedando inmóviles, hasta no responder al dolor. Fije los ratones anestesiados en un tablero de experimento en la posición lateral correcta y esterilice con hisopos de yodoforo, particularmente las áreas que rodean el sitio de inoculación del tumor.
   3. En la piel del flanco izquierdo justo craneal a la cadera, hacer una incisión de 0,5 cm con un bisturí y crear un túnel debajo de la piel hacia el miembro anterior, 2-3 cm, utilizando pórceps contundentes.
   4. Transferir asépticamente un cubo de fragmento de tumor por sitio de inoculación desde el medio y colocar profundamente dentro del túnel subcutáneo. Confirme visualmente la posición del fragmento antes del cierre de la herida con los clips de la herida.
   5. Monitorear a los ratones implantados en el tumor (5) hasta que se vuelvan conscientes para mantener la reclinación esternal, y luego devolverlos a su jaula solo después de su recuperación completa de la anestesia.
2. Monitoreo de la salud de ratones con tumores
   1. Compruebe el consumo de agua y alimentos diariamente y registre el peso corporal semanalmente.
   2. Revise los ratones durante el monitoreo de rutina. Registre cualquier efecto sobre la movilidad, la respiración, el aseo y la apariencia general, el consumo de alimentos y agua, la ganancia / pérdida de BW, la ascitis, etc.
   3. Mida la TV dos veces por semana usando pinzas y exprese en mm³ por: TV = 0.5 a × b^2,donde a y b son la longitud y la anchura del tumor, respectivamente.
   4. Sacrificar animales para recoger muestras cuando aparezca alguno de los siguientes signos: pérdida de BW >20%; movilidad deteriorada (no capaz de comer o beber); incapaz de moverse normalmente debido a ascitis significativa o abdomen agrandado; esfuerzo en la respiración; muerte.

3. Necropsia y cosecha tumoral

1. Cuando el volumen tumoral alcanzó los 200-800 mm^3,eutanasia a los ratones según los protocolos aprobados (véase el paso 1.2.2).
2. Recoja los tejidos del tumor quitando los tejidos no-tumorales adyacentes, seguido colocando el tejido en un tubo plástico de 50 mL con AD+++ (en el hielo) antes de la disociación.

4. Preparación para el cultivo organoide derivado de PDX

NOTA: Todos los siguientes pasos se realizaron dentro de un gabinete de bioseguridad por las pautas estándar de cultivo de tejidos. Mantenga las existencias precalentadas de placas de 96, 24 y 6 pozos en una incubadora de 37 °C antes de su uso.

1. Preparaciones de reactivos
   1. Prepare la solución del extracto de la membrana del sótano (BME) (factor de crecimiento reducido, Fenol Rojo-libre). Mantenga 10 mL de BME en un refrigerador de 4 °C durante la noche. Una vez descongelado, gire la botella de BME para asegurar la dispersión.
   2. Prepare el medio base/tampón de lavado AD+++. Añadir 5 mL de L-glutamina de 200 mM, HEPES de 1 M y Pluma/Estreptococo al medio AVANZADO DMEM/F12 pipeteando con una pipeta de 5 mL.
   3. Preparar el medio organoide del colon descrito por Sato et al.¹⁸ mediante la suplementación de medios base con N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Nicotinamida (10 mM), SD202190 (10 nM), R-espondina (500 ng/mL), L-glutamina (2 mM), HEPES (10 μM), penicilina-estreptomicina (1x) e Y-27623 (10 μM)^19.
   4. Preparar AD+++Medio de digestión: 10 mL de 1x medio de cultivo organoide con 500 μL de colagenasa tipo II (20 mg/mL) y 10 μL de RhoKI Y-27632 (10 mM).
2. Disociación^{tumoral 20}
   1. Transfiera el tumor en un tubo plástico de 50 mL a una placa de Petri de 10 cm. Tome una fotografía macroscópica junto a una regla y registre una descripción de sus condiciones (es decir, tamaño, tejidos grasos, vascularización, necrosis, etc.).
   2. Elimine el exceso de AD+++ por aspiración y corte el tejido tumoral en trozos pequeños con tijeras seguidas de transferencia de 1-2 piezas en un microtubo de 2 mL para la congelación instantánea en hielo seco. Conservar a -80 °C para perfiles genómicos. Picar las piezas restantes en piezas más finas por tijeras antes de transferir a un tubo de plástico de 50 mL utilizando AD +++.
   3. Lavar el tejido picado 2-3 veces por 35 mL de AD+++, seguido de la adición de 10 mL de medio de digestión (ver paso 4.1.4) y la colocación en una coctelera orbital a 4 x g durante 1 h a 37 °C.
   4. Homogeneizar el tejido digerido pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de plástico estéril de 5 mL, seguida de la adición de 20 mL de AD+++ y la filtración por colador celular de 100 μm.
   5. Lavar el paso a través dos veces con AD +++ (girar a 450 x g durante 5 min), seguido de resuspensión en BME (añadir 4x volumen de BME a la pastilla para la suspensión) y mantener en el hielo¹⁹.
3. Preparación del cultivo organoide
   1. Agregue la suspensión de celda BME en la placa de 6 pozos en múltiples gotas hasta un total de 200 μL por pozo.
   2. Transfiera la placa a una incubadora de 37 °C. Después de 30 min, las gotas de gel se solidifican.
   3. Añadir 2 mL de medio organoide a cada pozo, con las gotas representativas registradas por fotografía microscópica antes de transferir a una incubadora (37 °C y 5% de_CO2).
   4. Mantener los cultivos organoides con cambio medio cada 3-4 días, y el paso en una proporción de 1:2 cada 7 días o dependiendo de su crecimiento y densidad.

5. Histopatología y análisis de secuenciación de próxima generación (NGS)

1. histopatología
   1. Recoger organoides del pozo con el medio existente utilizando una pipeta P1000, seguida de centrifugación (espín a 450 x g durante 5 min), lavado con PBS y fijación en formalina al 10% durante 1 h.
   2. Coloque los organoides fijos en gelatina al 100% en la parte inferior del tubo cónico de 50 mL, seguido de procesamiento e incrustación de tejidos de rutina.
   3. Realice la coloración de hematoxilina-eosina (H&E) utilizando protocolos estándar en secciones de parafina de 4 mm.
2. RNAseq y secuenciación completa del exoma
   1. Recoger organoides del pozo con el medio de cultivo existente utilizando una pipeta P1000, seguido de centrifugación utilizando una microcentrífuga a la velocidad máxima (12.000 x g)durante 5 min a 4 °C.
   2. Recoja el pellet eliminando el sobrenadante medio para asegurarse de que no haya BME visible presente, seguido de congelación instantánea en un microtubo (hielo seco) y luego transferirlo a un congelador de -80 °C.
   3. Extraiga el ARN o la DNA usando el procedimiento estándar de fabricantes y realice el análisis de NGS para RNAseq y la secuenciación entera del exoma (WES).

6. Ensayo_{IC 50} ²⁰

1. Siembra organoide en placa de 384 pozos para ensayo IC₅₀
   1. Disociar organoides en gotas de BME de cada pozo (digerir BME) mediante la adición de 20 μL de solución de dispase 100x a cada pozo (placa de 6 pozos), que contenía 2 mL de medio organoide, seguido de 10 min de incubación a 37 °C.
   2. Pipette digirió organoides de todos los pozos a través de un filtro de 70 μm en un tubo de plástico de 50 mL para recoger los organoides.
   3. Contar los organoides bajo microscopía para la determinación de la concentración organoide. Suspenda los organoides utilizando el medio de cultivo, antes de añadir BME para alcanzar la concentración final del 5% (v/v) sobre hielo.
   4. Agregue 50 μL de la suspensión organoide en cada placa de 384 pozos con el dispensador de líquido, de acuerdo con el mapa de la placa con una densidad de siembra de 200 PDXOs CR2110 por pozo en el medio de cultivo organoide correspondiente.
2. Tratamiento con cisplatino e irinotecán
   1. Use cisplatino (con la concentración más alta de 100 μM) e "irinotecán" (con la concentración más alta de 10 μM). Añadir SN-38 (un metabolito de irinotecán, a diferencia del irinotecán que se suele utilizar para estudios in vivo) a cada pozo según el esquema de dilución del fármaco durante 9 dosis, en dilución en serie por dispener digital.
   2. Cree el mapa de placas utilizando la herramienta de software del dispensador digital. Incluir un vehículo de control negativo con 100% de viabilidad y control postivo de starurosporina de 5 μM, que mostró 0% de viabilidad.
   3. Vuelva a colocar las placas de 384 pozos tratadas con fármacos en la incubadora de 37 °C.
3. Determinación de la viabilidad de las células organoides después del tratamiento farmacológico
   1. Al final de los 5 días de tratamiento farmacológico, determine la viabilidad de las células organoides utilizando reactivos de viabilidad de células luminiscentes según el procedimiento recomendado por el fabricante. Agregue el reactivo luminiscente en cada pozo con el disipador líquido y mezcle durante 5 minutos en una coctelera de placas, seguida de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
   2. Grabe la señal luminiscente en un lector de placas multi-pozo de luminiscencia.
   3. Calcule las viabilidades normalizadas de cada pozo utilizando las lecturas en bruto del lector de placas y cree una curva dosis-respuesta y valores de IC₅₀ por ajuste de curva no lineal.

Resultados

Morfología de PDXOs, típica de organoides bajo microcopia ligera, y consistente con PDX parental por tinción H&E
Bajo microscopía de luz, PDXO-CR2110 demuestra una morfología quística típica(Figura 1A),como se describió anteriormente para organoides derivados de pacientes (DOP), evidencia que apoya la similitud entre PDXO y DOP bajo las mismas condiciones de cultivo.

El examen histopatológico por tinción H&E revela que las estructuras...

Discusión

Los datos preliminares para PDX-/PDXO-CR2110 en este informe apoyan la equivalencia biológica entre PDX y su derivado, PDXO, con respecto a la genómica, la histopatología y la farmacología, puesto que ambos modelos representan las formas de la enfermedad derivadas del CSC original del paciente. Ambos modelos son modelos de enfermedad derivados del paciente, potencialmente predictivos de la respuesta clínica de los pacientes^10,11,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634028	Base medium
DMEM	Hyclone	SH30243.01	Washing medium
Collagenese type II	Invitrogen	17101015	Digest tumor
Matrigel	Corning	356231	Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)
N-Ac	Sigma	A9165	Organoid culture medium
A83-01	Tocris	2939	Organoid culture medium
B27	Life Technologies	17504044	Organoid culture medium
EGF	Peprotech	AF-100-15	Organoid culture medium
Noggin	Peprotech	120-10C	Organoid culture medium
Nicotinamide	Sigma	N0636	Organoid culture medium
SB202190	Sigma	S7076	Organoid culture medium
Gastrin	Sigma	G9145	Organoid culture medium
Rspondin	Peprotech	120-38-1000	Organoid culture medium
L-glutamine	Life Technologies	35050038	Organoid culture medium
Hepes	Life Technologies	15630056	Organoid culture medium
penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140122	Organoid culture medium
Y-27632	Abmole	M1817	Organoid culture medium
Dispase	Life Technologies	17105041	Screening assay
CellTiter-Glo 3D	Promega	G9683	Screening assay (luminescent ATP indicator)
Multidrop dispenser	Thermo Fisher	Multidrop combi	Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition
Digital dispener	Tecan	D300e	Compound addition
Envision Plate reader	Perkin Elmer	2104	Luminescence reading
Balb/c nude mice	Beijing HFK Bio-Technology Co
RNAeasy Mini kit	Qiagen	74104	tRNA purification kit
DNAeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506	DNA purification kit
Histogel	Thermo Fisher	HG-4000-012	Organoid embedding