Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Zusammenfassung

Das Zentralnervensystem (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von neuronalen, gliaalen, stromalen und vaskulären Zellen reguliert, die seine ordnungsgemäße Funktion erleichtern. Obwohl die Untersuchung dieser Zellen isoliert in vitro oder zusammen ex vivo liefert nützliche physiologische Informationen; wichtige Merkmale der neuronalen Zellphysiologie werden in solchen Kontexten übersehen. Daher ist es notwendig, neuronale Zellen in ihrer nativen in vivo Umgebung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die sich wiederholende In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Nervenzellen im Nagetierkortex als Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung bestimmter Zellen über einen längeren Zeitraum von Stunden bis Monaten. Wir beschreiben detailliert die Verwendung der grob stabilen Gehirnvaskulatur als grobe Karte oder fluoreszierend beschriftete Dendriten als feine Karte ausgewählter Hirnregionen von Interesse. Anhand dieser Karten als visuellen Schlüssel zeigen wir, wie neuronale Zellen für die nachfolgende repetitive In-vivo-Bildgebung präzise verlegt werden können. Anhand von Beispielen für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierend markierten Mikroglia, Neuronen und NG2⁺ Zellen demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit dieser Technik, eine sich wiederholende Visualisierung der zellulären Dynamik am selben Hirnort über längere Zeiträume zu ermöglichen, die weitere Hilfe beim Verständnis der strukturellen und funktionellen Reaktionen dieser Zellen in der normalen Physiologie oder nach pathologischen Beleidigungen unterstützen kann. Gegebenenfalls kann dieser Ansatz an die funktionelle Bildgebung von Nervenzellen gekoppelt werden, z. B. mit Kalziumbildgebung. Dieser Ansatz ist besonders eine leistungsstarke Technik, um die physikalische Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS in vivo zu visualisieren, wenn genetische Mausmodelle oder bestimmte Farbstoffe mit unterschiedlichen fluoreszierenden Tags zur Kennzeichnung der gefährdeten Zellen verfügbar sind.

Einleitung

Das zentralnervöse System (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen ansässigen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia und gefäßassoziierten Zellen, gesteuert. Traditionell wurden Neurozellen in isolierten, ko-kultivierten^1,2,3,4,5 (in vitro) oder ausgeschnittenem Hirngewebe (ex vivo)^6,7,8,9,10 Kontexte untersucht. Es ist jedoch notwendig, das Verhalten neuronaler Zellen und Interaktionen in der nativen Umgebung des intakten Gehirns in vivo weiter zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um in vivo-Regionen von Interesse abzubilden und diese Regionen in zukünftigen Imaging-Sitzungen genau neu abzubilden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen ZNS-Zelltypen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen.

Die Entwicklung von in vivo bildgebenden Ansätzen hat signifikante Gewinne für das richtige Verständnis der neuronalen Funktion^{11,12,13,14,15}geliefert. Insbesondere bieten diese Ansätze mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Erstens verfügen In-vivo-Bildgebungssysteme über physiologisch relevante Zell- und Gewebekomponenten wie die Vaskulatur mit dem gesamten Repertoire zellulärer Wechselwirkungen, um ein vollständiges Verständnis der neuronalen Netzwerkphysiologie zu ermöglichen. Zweitens deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte Nervenzellen (wie Mikroglia) wichtige Merkmale ihrer Identität und damit die Physiologie^16,17 verlieren, die in der in vivo-Einstellung erhalten werden können, wenn sie aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden. Drittens bieten In-vivo-Bildgebungssysteme die Möglichkeit für stabile Längsuntersuchungen von Wochen bis Monaten, um z.B. zelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Angesichts der zunehmenden Hinweise auf Beiträge des peripheren Immunsystems^18,19 und des Mikrobioms^20,21 in der ZNS-Physiologie bieten In-vivo-Systeme eine Plattform, um solche Beiträge und Wirkungen auf ZNS-Zellen zu befragen. Daher sind Ansätze, die Längs-in-vivo-Bildgebung verwenden, um neuroimmune Physiologie und Wechselwirkungen in gesunden, verletzten und kranken Zuständen zu untersuchen, eine große komplementäre Ergänzung zu traditionellen Ansätzen.

In diesem Protokoll beschreiben wir einen zuverlässigen Ansatz, um verschiedene Zelltypen im Gehirn abzubilden, einschließlich Mikroglia, Neuronen und NG2⁺ Zellen als Beispiele. Es wurden zwei Ansätze zur Visualisierung von Nervenzellen in vivo entwickelt: der ausgedünnte Schädelansatz und der offene Schädel mit einem Schädelfensteransatz. Obwohl verdünnte Schädelansätze im Einsatz sind und bevorzugt werden, weil sie einige der Nachteile des offenen Schädelansatzes überwinden, wie z.B. Glialzellaktivierung, überphysiologische Wirbelsäulendynamik und die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln^22,23,24,25, verdünnte Schädelansätze zeigen auch einige kritische Nachteile. Erstens ist das Ausdünnungsverfahren ein sehr heikles Verfahren, das viele Forscher nur schwer perfektionieren können, vor allem, wenn eine erneute Ausdünnung notwendig ist. Dies ist der Fall, weil es für Experimentatoren oft schwierig ist, festzustellen, dass sie den Schädel auf eine Tiefe von 20 m ausgedünnt haben. Zweitens müsste für angemessene Vergleiche zwischen Mäusen die Ausdünnung identisch sein, und eine Vielzahl von Ausdünnungserfolgen zwischen Bildgebungssitzungen oder Mäusen könnte die Visualisierung neuronaler Strukturen erschweren. Drittens können Tiere mit verdünnten Schädeln bei Verwendung bei der Längsbildgebung nur für eine begrenzte Anzahl von Sitzungen verwendet werden, wenn eine erneute Ausdünnung des Schädels zum Einsatz kommt. Forth, da ein Teil des Knochengewebes noch erhalten bleibt, könnte die Klarheit in der Tiefe der Bildgebung durch den ausgedünnten Schädelansatz beeinträchtigt werden, der eine großartige Visualisierung von oberflächlicheren, aber nicht so viel mit tieferen Regionen ermöglicht. Vor diesem Hintergrund können tiefere Hirnstrukturen wie der Hippocampus nicht erfolgreich mit dem ausgedünnten Schädelansatz abgebildet werden. Diese Überlegungen werfen die Notwendigkeit alternativer und ergänzender Ansätze auf, die diese Bedenken ausräumen könnten.

Alternativ zum ausgedünnten Schädelansatz verwendet der Ansatz der offenen Schädelfensterimplantation ein Verfahren, bei dem der Schädel durch einen optisch klaren Glasdeckel ersetzt wird. Dies ermöglicht eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Bildgebungssitzungen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode aufgrund des Ersatzes des Schädels durch den Glasdeckel ein klares Sichtfenster fluoreszierender Gehirnzellen für längere Zeit von Stunden bis Monaten und kann daher eingesetzt werden, um Zellaktivität und Wechselwirkungen zu untersuchen, die für Physiologie, Alterung und Pathologie relevant sind.

Insgesamt beschreiben wir Schritte, die befolgt werden können, um chronische Schädelfenster durch eine stereotaxic-Kraniotomie zu implantieren, die in vivo-Bildgebung von Hirnregionen von Interesse ermöglicht. Wir beschreiben auch, wie die grob stabile Gehirnvaskulatur oder die fluoreszierend markierten Dendriten verwendet werden könnten, um eine grobe oder eine feine Karte bzw. der Hirnregionen von Interesse zu erzeugen. Dieser Ansatz kann dann für wiederholte Bildgebung über mehrere Sitzungen verwendet werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt daher in ihrer Fähigkeit, die langfristigen Veränderungen oder Stase in Gehirnelementen einschließlich der Anordnung, Morphologie und Wechselwirkungen der verschiedenen zellulären Typen abzubilden.

Protokoll

Alle Schritte entsprechen den Richtlinien, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia festgelegt und genehmigt wurden.

1. Mauspräparat für die Schädelfensterimplantation

HINWEIS: Verschiedene transgene Mauslinien mit floreszenten Tags eignen sich für die Bildgebung.

1. Verwenden Sie CX3CR1^GFP/+ Mäuse^26, um Mikroglia in vivo zu visualisieren. Typischerweise werden jugendliche bis junge Erwachsene, 4 bis 10 Wochen alte Mäuse mit einem Gewicht von 17-25 g, verwendet.
   HINWEIS: Obwohl dieser Ansatz sogar für vorentwöhnte Mäuse geeignet ist, kann die Notwendigkeit, die Mäuse mit ihren Müttern zur Fütterung in ihren Käfig zurückbringen, die Genesung erschweren, wenn die Mutter sich nach der Operation nicht angemessen um Welpen kümmert. Daher wird die Verwendung von Mäusen nach der Entwöhnung empfohlen.
2. Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (5% Sauerstoffdurchfluss für die Induktion für 1 min) in einer Anästhesiekammer. Stellen Sie fest, dass die Maus keine Bewegungs- oder Zuckungsreaktionen auf Zehen- und/oder Schwanzkneifen anzeigt. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und im Freien gründlich rasieren Sie das Haar auf dem Kopf zwischen den Ohren von etwa der Augenhöhe bis zur Spitze des Halsbereichs mit einem Haarschneider.
   HINWEIS: Die Konzentration von Isofluran würde von der Größe der Induktionskammer abhängen. Daher können für kleinere Kammern 3-4% Isofluran verwendet werden, um effektiv Anästhesie zu induzieren, während größere Kammern bis zu 5% benötigen.
3. Bewegen Sie die Maus auf die stereotaktische Operationsstation Nasenkegel für Anästhesie (1,5-2% für die Wartung für die Operation), stabilisieren Sie ihren Kopf mit Ohrbügeln, und halten Sie die Maus auf einem Heizpad, um die Körpertemperatur warm zu halten.
4. Schmieren Sie beide Augen mit Augensalbe. Injizieren Sie 100 l 0,25% Bupivicain (um der Maus eine lokale Analgesie zu bieten, die 8-12 h dauert) und 100 l von 4 mg/ml Dexamethason (um die Entzündung zu reduzieren, die durch den chirurgischen Eingriff entstehen kann) subkutan an der Einschnittstelle. Lassen Sie die Maus mindestens 5 min sitzen, bevor Sie zum nächsten Schritt wechseln.
5. Reinigen Sie den rasierten Kopf mit drei abwechselnden Tupfern Betadin und 70% Alkohol. Machen Sie einen Mittellinien-Kopfhautschnitt mit chirurgischer Klinge oder Schere, die sich von der Rückseite des Schädelbereichs zwischen den Ohren bis zum vorderen Bereich zwischen den Augen erstreckt. Die restliche Haut wird geschnitten, um den Schädel freizulegen.
6. Reinigen Sie das Bindegewebe zwischen der Kopfhaut und dem darunter liegenden Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid (H_2O2) und lokalisieren Sie den Hirnbereich, der mit stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden soll.
   HINWEIS: Es gibt oft einige Blutungen (Schritt 1.5) aus dem Schnitt auf der Schädeloberfläche. Diese Blutung löst sich in der Regel von selbst innerhalb von 3-5 min. Reinigung mit dem Peroxid hilft. Vorherige Bupivacaine Behandlung (Schritt 1.4) wird auch festgestellt, um die Menge der Blutungwährend während dieser Zeit zu begrenzen.

2. Maus-Kranielle Fenster-Implantationchirurgie

1. Bohren Sie mit einem Zahnbohrer (0,7 mm Spitzendurchmesser) eine kreisförmige Öffnung von 4 mm in den Schädel und entfernen Sie diesen Teil des Schädels vorsichtig mit spitzen Zangen. Für die Abbildung des somatosensorischen Kortex von 6-8 Wochen alten Mäusen, lokalisieren Sie das Zentrum der Kraniotomie bei -2,5 posterior und 2,0 seitlich zu Bregma. Während des Bohrens befeuchten Sie den Schädel regelmäßig mit sterilen Saline- und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen, Knochenablagerungen abzureinigen und den Schädelknochen zur eventuellen Entfernung zu erweichen.
   HINWEIS: Die Koordinaten für die Kraniotomie variieren je nach Interessengebiet und Alter der Mäuse.
2. Nachdem der Schädel entfernt wurde, legen Sie vorsichtig ein kleines Deckglas (Größe #0 bei 0,1 x 0,02 mm Dicke) mit Saline in der Craniotomie befeuchtet. Überschüssige Saline mit einem sterilen Wisch abtrocknen.
3. Mit einem spitzen Applikator (wie eine Pipette Spitze oder das spitze Ende eines gebrochenen Holzwatte-Tupfer-Sticks), cyanoacrylat Leim um das Fenster auftragen und lassen Sie es an Gehirn und Schädel zu befestigen. Tragen Sie den Primerkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn mit einem aushärtenden Licht für 20-40 s aus. Bereiten Sie einen Brunnen um das Fenster mit dem endigen Kleber vor und härten Sie mit einem Aushärtelicht für 20-40 s aus.
4. Kleben Sie eine kleine Kopfplatte auf den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre der Kraniotomie zuerst mit dem Primerkleber als Primer und dann mit dem Endkleber. Beide mit dem Aushärtelicht für je 20-40 s aushärten.
   HINWEIS: Nähte werden nicht benötigt, wenn der Schädel während dieses Vorgangs vollständig mit dem Kleber bedeckt ist.

3. Post-Chirurgie-Pflege

1. Lassen Sie die Maus in Abwesenheit von Anästhesie aufwachen (Erholung auf einem Heizkissen verkürzt die Erholungszeit) und bringen Sie sie in ihren HeimischenKäfig zurück, sobald sie vollständig wach ist. Injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR (0,5 mg/kg) als postoperative Analgesie, die für 72 h ausreicht.
2. Um eine gesunde Genesung von der Operation zu erleichtern, stellen Sie der Maus eine zusätzliche weiche Nahrung zur Verfügung, die in Form von regelmäßigen festen Chow in Wasser sein kann, um das Chow oder Nahrung in Form eines Gels zu erweichen.
   HINWEIS: Eine einmalige Versorgung der Soft Food unmittelbar nach der Operation ist ausreichend.
3. Überwachen Sie die Maus täglich auf Gesundheit und richtige Genesung für die ersten 72 h des chirurgischen Eingriffs. Danach, führen Sie die Bildgebung bereits ab 2 Wochen nach der Fensterimplantationschirurgie durch.
   HINWEIS: Wenn es gut gemacht wird, erholen sich Mäuse gut und zeigen normales ambulantes Verhalten, ausreichende Käfigexploration, gute Hydratation, stabile Gewichtszunahme und umfangreiche Interaktionen mit anderen Mäusen im Käfig und anderen Gegenständen im Käfig. Mäuse, die Lethargie, Dehydrierung und mehr als 10% Gewichtsverlust nach der Operation zeigen, werden eingeschläfert und aus der Studie entfernt.

4. Zwei-Photonen-Gehirn-Mapping für die erste Bildgebung

1. Anästhesisieren Sie die Maus (Isoflurane, 5 % Induktion und 1,5 % Wartung). Stabilisieren Sie den Kopf mit Schrauben, um die Kopfplatte auf der Zwei-Photon-Mikroskop-Bühne zu montieren, und werden auf einer Heizplatte bei 35 °C gehalten. Injizieren Sie intraperitoneal 100 l Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamine B (2 mg/ml).
   HINWEIS: Die Bildgebung könnte auch bei wachen Mäusen ohne Anästhesie durchgeführt werden. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Anästhesie die mikrogliaale Überwachungsdynamik^{beeinflusst 27,28,29} und dass die Kopffixierung für zwei Photonenbilder bei wachen Mäusen den Stress auch während der chronischen Bildgebung für mindestens 25 Tage erhöht (siehe Juczewski et al., 2020)³⁰.
2. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters sanft mit einem Wattestäbchen, der mit 70 % Ethanol umgesiebt ist. Legen Sie ein paar Tropfen Wasser oder Salzine auf das Schädelfenster und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung, da das Ziel eine Tauchlinse ist.
3. Zeichnen Sie eine grobe Karte von Hand, um die wichtigsten Sehenswürdigkeiten des Blutgefäßes in einem Labor-Notebook zu bezeichnen, während Sie das Okular durch Epifloreszenz betrachten. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während zweier Photonenabbildungen zu identifizieren. Alternativ können Sie die Blutgefäße entweder über eine am Mikroskop angebrachte Kamera oder über eine Handkamera oder ein Telefon fotografieren.
   HINWEIS: Diese handgezeichneten Bilder und Bilder sollen es erleichtern, die gleichen breiten Bereiche unter dem Mikroskop vor zwei Photonenbildern erneut zu besuchen. Dabei handelt es sich nicht um eine genaue Bildzuordnung.
4. Sammeln Sie unter zwei Photonenbildern nach Bedarf Bilder von blühenden Zellen und Gefäßen. Nehmen Sie sorgfältige Notizen mit geeigneten Koordinaten auf, um sicherzustellen, dass die genauen Bereiche für die nachfolgende Bildgebung überprüft werden können. Sammeln Sie in dieser ersten Bildgebungssitzung mehrere Sichtfelder, z.B. erfassen Sie z-stack-Bilder alle 1-2 m durch ein Gewebevolumen.
   HINWEIS: Beim Sammeln von Bildern von zwei Photonen werden die Landmarken des Blutgefäßes für grobe Kartierung verwendet. Wenn eine feine Kartierung erforderlich ist, werden YFP-markierte Dendriten von Thy1-YFP^31-Mäusen verwendet.
   1. Verwenden Sie diese empfohlenen Parameter für die Bildgebung: eine Wellenlänge von 880-900 nm ist optimal; für GFP und/oder dsRed / Rhodamine Anregung, ein 565 nm dichroitischen Spiegel mit 525/50 nm (grüner Kanal) und 620/60 nm (roter Kanal) Emissionsfilter verwendet werden; für gfP- und YFP-Trennung wird ein 509 nm dichroitischer Spiegel mit 500/15 und 537/26 nm Emissionsfiltern verwendet; die Leistung im Gehirn wird bei 25 mW oder darunter gehalten; Bildauflösung beträgt 1024 x 1024 Pixel, das Sichtfeld mit einem 25X 0.9 NA Objektiv bei einem 1,5-fachen Zoomfaktor beträgt 295,24 x 295,24 m.
5. Am Ende der Bildgebung, nehmen Sie die Maus von der Bühne, lassen Sie es aus der Anästhesie aufwachen und kehren Sie in seinen heimischen Käfig bis zu einer zukünftigen Bildgebung Sitzung.

5. Zwei-Photonen-Bildgebung und Re-Imaging

1. Für zukünftige nachfolgende Bildgebungssitzungen, die von einigen Stunden bis Monaten nach der ersten Bildgebungssitzung stattfinden können, die Maus anästhesieren (Isofluran, 5% Induktion und 1,5% Wartung), am Zwei-Photonen-Mikroskop montieren, auf einer Heizplatte warten und 100 l einen Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamine B (2 mg/ml) erneut injizieren.
2. Öffnen Sie die zuvor erhaltenen Bilder in ImageJ, und identifizieren Sie mithilfe dieser Bilder sowie der Notizen aus der vorherigen Sitzung die zuvor abgebildeten Bereiche und stellen Sie sie sorgfältig neu ab.
3. Wiederholen Sie dies so lange, wie das Bildgebungsfenster klar ist oder für den Umfang der Studie als wesentlich ist.

Ergebnisse

Zur Visualisierung der mikrogliaalen Dynamik in vivo wurden doppeltransgene CX3CR1^GFP/+:Thy1^YFP-Mäuse verwendet. Die Thy1-YFP H Linie wird im Gegensatz zur Thy1-GFP M-Linie verwendet, um Blütenstaubüberlappungen von Mikroglia (GFP) und Neuronen (YFP) zu vermeiden. Alternative Ansätze könnten eine Reporterlinie verwenden, in der Microglia z.B. mit tdTomato und dann die Thy1-GFP M-Linie beschriftet werden kann. Ein Nachteil der H-Linie ist, dass YFP viele Neuronen kennzeichnet und das Etikett mit...

Diskussion

Das Aufkommen der in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung hat Möglichkeiten eröffnet, die Fülle von zellulären Interaktionen und Dynamiken zu erforschen, die im gesunden Gehirn auftreten. Erste Studien konzentrierten sich auf die Verwendung des offenen Schädel-Craniotomie-Ansatzes zur Bildneuronaldendriten durch akute und chronische Bildgebung^37,38. Dies kann auch verwendet werden, um neuroimmune Wechselwirkungen im Gehirn zu klären. Dieses Protokoll beschreibt ei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Drill Bit	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1