Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica crônica de implantação de janelas cranianas que pode ser usada para imagens longitudinais de estruturas neuro-glio-vasculares, interações e função em condições saudáveis e doentes. Serve como uma alternativa complementar à abordagem de imagem transcranária que, embora muitas vezes preferida, possui algumas limitações críticas.

Resumo

O sistema nervoso central (SNC) é regulado por uma complexa interação de células neuronais, gliais, estrômicas e vasculares que facilitam sua função adequada. Embora estudar essas células isoladamente in vitro ou juntos ex vivo fornece informações fisiológicas úteis; características salientes da fisiologia celular neural farão falta em tais contextos. Portanto, há a necessidade de estudar células neurais em seu ambiente in vivo nativo. O protocolo aqui detalhado descreve a imagem repetitiva in vivo de duas fótons de células neurais no córtex roedor como uma ferramenta para visualizar e estudar células específicas durante longos períodos de tempo de horas a meses. Descrevemos em detalhes o uso da vasculatura cerebral grosseiramente estável como um mapa grosseiro ou dendritos fluorescentes rotulados como um bom mapa de regiões cerebrais selecionadas de interesse. Usando esses mapas como uma chave visual, mostramos como as células neurais podem ser precisamente realocadas para imagens in vivo repetitivas subsequentes. Utilizando exemplos de imagens in vivo de microglia fluorescentes, neurônios e células NG2⁺ , este protocolo demonstra a capacidade desta técnica de permitir a visualização repetitiva da dinâmica celular na mesma localização cerebral por longos períodos de tempo, que podem ajudar ainda mais na compreensão das respostas estruturais e funcionais dessas células na fisiologia normal ou seguindo insultos patológicos. Quando necessário, essa abordagem pode ser acoplada à imagem funcional de células neurais, por exemplo, com imagem de cálcio. Essa abordagem é especialmente uma técnica poderosa para visualizar a interação física entre diferentes tipos celulares do CNS in vivo quando modelos genéticos de camundongos ou corantes específicos com marcas fluorescentes distintas para rotular as células de interesse estão disponíveis.

Introdução

O sistema nervoso central (SNC) é regido por uma complexa interação entre vários tipos de células residentes, incluindo neurônios, glia e células associadas a vasos. Tradicionalmente, as células neurais eram estudadas em tecidos cerebrais isolados, co-cultivados^1,,2,,3,,4,5 (in vitro) ou tecido cerebral exsequipado (ex vivo)^{6,,7,,8,,9,,10} contextos. No entanto, é necessário entender melhor o comportamento das células neurais e as interações no ambiente nativo do cérebro intacto in vivo. Neste protocolo, descrevemos um método para mapear regiões in vivo de interesse e reimagem precisamente essas regiões em futuras sessões de imagem para acompanhar as interações complexas entre os vários tipos de células CNS ao longo de longos períodos de tempo.

O desenvolvimento de abordagens de imagem in vivo proporcionou ganhos significativos para a compreensão adequada da função neural^{11,,12,,13,14,,15}. Especificamente, essas abordagens oferecem várias vantagens em relação às abordagens in vitro e ex vivo tradicionais. Primeiro, os sistemas de imagem in vivo possuem componentes fisiologicamente relevantes de células e tecidos, como a vasculatura com o repertório completo das interações celulares para proporcionar uma compreensão completa da fisiologia da rede neural. Em segundo lugar, achados recentes sugerem que, quando removidas de seu ambiente nativo, certas células neurais (como a microglia) perdem características importantes de sua identidade e,^portanto,fisiologia¹⁶,¹⁷ que podem ser preservadas no cenário in vivo. Em terceiro lugar, os sistemas de imagem in vivo oferecem a oportunidade de investigações longitudinais estáveis de semanas a meses para estudar as interações celulares do CNS. Finalmente, dadas as evidências crescentes de contribuições do sistema imunológico periférico^18,19 e do microbioma^20,21 na fisiologia do CNS, os sistemas in vivo fornecem uma plataforma para interrogar tais contribuições e efeitos sobre as células CNS. Assim, abordagens que empregam imagens longitudinais in vivo para estudar fisiologia neuroi imune e interações em estados saudáveis, feridos e doentes são uma grande adição complementar às abordagens tradicionais.

Neste protocolo, descrevemos uma abordagem confiável para a imagem de diferentes tipos de células no cérebro, incluindo microglia, neurônios e células NG2⁺ como exemplos. Duas abordagens para visualizar células neurais in vivo foram desenvolvidas: a aproximação do crânio diluído e o crânio aberto com uma aproximação da janela craniana. Embora abordagens finas do crânio estejam em uso e sejam preferidas porque superam algumas das desvantagens da abordagem do crânio aberto, como ativação celular gliana, dinâmica da coluna vertebral mais alta que fisiológica e o uso de agentes anti-inflamatórios^{22,,23,,24,,25}, abordagens finas do crânio também mostram algumas desvantagens críticas. Em primeiro lugar, o procedimento de afinamento é um procedimento muito delicado que muitos pesquisadores acham difícil de aperfeiçoar especialmente quando o diluir é necessário. Este é o caso porque muitas vezes é difícil para os experimentadores verificar que eles diminuíram o crânio a uma profundidade de ~20 μm. Em segundo lugar, para comparações adequadas entre camundongos, o afinamento precisaria ser idêntico e uma variedade de sucesso de afinamento entre sessões de imagem ou camundongos poderia complicar a visualização de estruturas neurais. Em terceiro lugar, quando empregados para imagens longitudinais, animais com crânios finos só podem ser usados para um número limitado de sessões quando o diluir do crânio é empregado. Por diante, uma vez que parte do tecido ósseo ainda permanece, a clareza em profundidade da imagem pode ser comprometida a partir da abordagem do crânio diluído permitindo uma grande visualização de regiões mais superficiais, mas não tanto com regiões mais profundas. À luz disso, estruturas cerebrais mais profundas, como o hipocampo, não podem ser imagens com sucesso com a aproximação do crânio diluído. Essas considerações levantam a necessidade de abordagens alternativas e complementares que possam superar essas preocupações.

Alternativa à abordagem do crânio diluído, a abordagem de implantação da janela aberta do crânio usa um procedimento no qual o crânio é substituído por uma mancha de vidro opticamente clara. Isso permite um número quase ilimitado de sessões de imagem. Além disso, dada a substituição do crânio pelo deslizamento de tampa de vidro, este método permite uma janela de visualização clara de células cerebrais fluorescentes marcadas por longos períodos de horas a meses e, portanto, pode ser empregado para estudar a atividade celular e interações relevantes para fisiologia, envelhecimento e patologia.

No geral, detalhamos etapas que podem ser seguidas para fazer o implante de janelas cranianas crônicas através de uma craniotomia estereotaxa que permite imagens in vivo de regiões cerebrais de interesse. Também descrevemos como a vasculatura cerebral grosseiramente estável ou os dendritos fluorescentes rotulados poderiam ser usados para gerar um mapa grosseiro ou fino, respectivamente, das regiões cerebrais de interesse. Esta abordagem pode então ser usada para imagens repetidas ao longo de várias sessões. A importância dessa técnica, portanto, reside em sua capacidade de imaginar as mudanças ou estase a longo prazo em elementos cerebrais, incluindo o arranjo, morfologia e interações dos diferentes tipos celulares.

Protocolo

Todas as etapas estão de acordo com as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia.

1. Preparação do rato para implantação de janelas cranianas

NOTA: Várias linhas de mouse transgênicas com etiquetas florescente são adequadas para imagens.

1. Use mouses CX3CR1^{GFP/+ 26} para visualizar microglia in vivo. Normalmente, são usados camundongos de 4 a 10 semanas de idade que pesam de 17 a 25 g.
   NOTA: Embora essa abordagem seja até adequada para camundongos pré-desmamados, a necessidade de devolver os camundongos à gaiola com suas mães para alimentação, pode complicar a recuperação se a mãe não cuidar adequadamente dos filhotes após a cirurgia. Portanto, recomenda-se o uso de camundongos pós-desmascrime.
2. Anestesiar o camundongo usando isoflurane (fluxo de 5% em oxigênio para indução por 1 min) em uma câmara anestésico. Verifique se o mouse não mostra nenhuma resposta de movimento ou contração ao dedo do dedo do dedo do dedo do reino e/ou pitadas de cauda. Retire o rato da câmara e, ao ar livre, raspe completamente o cabelo da cabeça entre as orelhas do nível dos olhos até o topo da região do pescoço usando um aparador de cabelo.
   NOTA: A concentração de isoflurane utilizada dependeria do tamanho da câmara de indução. Portanto, para câmaras menores, 3-4% de isoflurane pode ser usado para induzir anestesia efetivamente, enquanto câmaras maiores exigirão até 5%.
3. Mova o rato para o cone do nariz da estação de cirurgia estereotática para anestesia (1,5-2% para manutenção da cirurgia), estabilize a cabeça usando barras de ouvido e mantenha o rato em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal aquecida.
4. Lubrifique os dois olhos com pomada ocular. Injete 100 μL de 0,25% de bupivicaine (para fornecer analgesia local ao camundongo que durará 8-12 h) e 100 μL de dexametasona de 4 mg/mL (para reduzir a inflamação que pode resultar do procedimento cirúrgico) subcutânea no local da incisão. Deixe o mouse sentar por pelo menos 5 minutos antes de passar para o próximo passo.
5. Limpe a cabeça raspada com três cotonetes alternados de betadina e 70% de álcool. Faça uma incisão de couro cabeludo médio usando lâmina cirúrgica ou tesoura estendendo-se da parte de trás da região do crânio entre as orelhas e a área frontal entre os olhos. A pele restante é cortada para expor o crânio.
6. Limpe o tecido conjuntivo localizado entre o couro cabeludo e o crânio subjacente com 3% de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) e localize a área cerebral a ser imagen com coordenadas estereostáticas.
   NOTA: Muitas vezes há algum sangramento (passo 1.5) da incisão na superfície do crânio. Este sangramento geralmente se resolve sozinho dentro de 3-5 minutos. A limpeza com o peróxido ajuda. O tratamento prévio de bupivacaína (etapa 1.4) também é observado para limitar a quantidade de sangramento durante este período.

2. Cirurgia de implantação da janela craniana do rato

1. Perfurar uma abertura circular ~4 mm no crânio usando uma broca dentária (diâmetro de ponta de 0,7 mm) e remova cuidadosamente esta porção do crânio usando fórceps pontiagudos. Para a imagem do córtex somatosensorial de camundongos de 6-8 semanas de idade, localize o centro da craniotomia em -2,5 posterior e ± 2,0 lateral para bregma. Durante a perfuração, umedeça regularmente o crânio com soro fisiológico e cotonetes de algodão para resfriar o cérebro, limpar detritos ósseos e suavizar o osso do crânio para eventual remoção.
   NOTA: As coordenadas para a craniotomia variariam dependendo da região de interesse e da idade dos camundongos.
2. Depois que o crânio for removido, coloque cuidadosamente um pequeno vidro de cobertura (tamanho #0 a 0,1 ± 0,02 mm de espessura) umedecido com soro fisiológico na craniotomia. Seque o excesso de soro fisiológico usando uma limpeza estéril.
3. Usando um aplicador pontiagudo (como uma ponta de pipeta ou a ponta pontiaguda de um bastão de algodão de madeira quebrado), aplique cola cianoacrilato ao redor da janela e permita que ela se conecte ao cérebro e ao crânio. Aplique a cola do primer no resto do crânio e cure-a com uma luz de cura para 20-40 s. Prepare um poço ao redor da janela com a cola final e cure com uma luz de cura para 20-40 s.
4. Cole uma pequena placa de cabeça no crânio no hemisfério contralateral da craniotomia primeiro com a cola do primer como cartilha e depois com a cola final. Cure ambos com a luz de cura para 20-40 s cada.
   NOTA: As suturas não são necessárias se o crânio estiver totalmente coberto com a cola durante este procedimento.

3. Cuidados pós-cirurgia

1. Deixe o mouse acordar na ausência de anestesia (a recuperação feita em uma almofada de aquecimento encurta o tempo de recuperação) e devolvê-lo à gaiola de origem uma vez totalmente acordado. Injete uma dose subcutânea de buprenorfina SR (0,5 mg/kg) como analgesia pós-operatória que é suficiente para 72 h.
2. Para facilitar uma recuperação saudável da cirurgia, forneça ao rato um alimento extra macio, que pode ser na forma de comida sólida regular na água para suavizar a comida ou a comida na forma de um gel.
   NOTA: Uma provisão única do alimento macio imediatamente após a cirurgia é suficiente.
3. Monitore o camundongo diariamente para a saúde e recuperação adequada para as primeiras 72 horas do procedimento cirúrgico. Depois, realize imagens a partir de 2 semanas da cirurgia de implantação da janela.
   NOTA: Se bem feito, os camundongos se recuperam bem apresentando comportamentos ambulatoriais normais, exploração suficiente da gaiola, boa hidratação, ganho de peso estável e interações extensas com outros camundongos na gaiola e outros itens da gaiola. Camundongos que mostram letargia, desidratação e perda de peso superior a 10% após a cirurgia são eutanizados e removidos do estudo.

4. Mapeamento cerebral de dois fótons para imagem inicial

1. Anestesiar o camundongo (Isoflurane, 5 % de indução e 1,5 % de manutenção). Estabilize a cabeça usando parafusos para montar a placa de cabeça no estágio do microscópio de dois fótons, sendo mantido em uma placa de aquecimento a 35 °C. Injete intraperitoneally 100 μL de corante de vaso sanguíneo, como Rhodamine B (2 mg/mL).
   NOTA: A imagem também pode ser feita em camundongos acordados sem anestesia. No entanto, estudos recentes indicam que a anestesia afeta a dinâmica de vigilância microglial^27,28,29 e que a fixação da cabeça para duas imagens de fótons em camundongos acordados aumenta o estresse mesmo durante a imagem crônica por pelo menos 25 dias (ver Juczewski et al., 2020)³⁰.
2. Limpe a superfície da janela craniana suavemente usando um cotonete de algodão com 70% de etanol. Coloque algumas gotas de água ou soro fisiológico na janela craniana e baixe a lente objetiva na solução, já que o objetivo é uma lente de imersão.
3. Desenhe manualmente um mapa grosseiro para denotar os principais marcos dos vasos sanguíneos em um caderno de laboratório enquanto olha através da ocular por epiflorescência. Use este desenho para identificar as regiões específicas durante duas imagens de fótons. Alternativamente, tire fotos dos vasos sanguíneos através de uma câmera instalada no microscópio ou através de uma câmera ou telefone portátil.
   NOTA: Estas imagens e imagens desenhadas à mão devem facilitar a revisitar as mesmas regiões amplas sob o microscópio antes de duas imagens de fótons. Não são mapeamento preciso de imagens.
4. Sob duas imagens de fótons, coletar imagens de células e vasos florescente, conforme necessário. Faça observações cuidadosas com coordenadas apropriadas para garantir que as regiões precisas possam ser revisitadas para imagens subsequentes. Colete vários campos de visão nesta sessão inicial de imagem, por exemplo, adquira imagens de pilha de z a cada 1-2 μm através de um volume de tecido.
   NOTA: Ao coletar imagens por dois fótons, os marcos dos vasos sanguíneos são usados para mapeamento grosseiro. Se for necessário um mapeamento fino, são usados dendritos rotulados por YFP de ratos Thy1-YFP^31.
   1. Use estes parâmetros recomendados para imagem: um comprimento de onda de 880-900 nm é o ideal; para excitação GFP e/ou dsRed / Rhodamine, são utilizados filtros de emissão de 565 nm com filtros de emissão de 525/50 nm (canal verde) e 620/60 nm (canal vermelho); para separação GFP e YFP, são utilizados filtros de emissão 509 nm com filtros de emissão 500/15 e 537/26 nm; a potência no cérebro é mantida a 25 mW ou abaixo; resolução de imagem é de 1024 x 1024 pixels, o campo de visão tomado com um objetivo 25X 0.9 NA em um fator de zoom de 1,5X é de 295,24 x 295,24 μm.
5. No final da imagem, tire o rato do palco, permita que ele acorde da anestesia e retorne à sua gaiola doméstica até uma futura sessão de imagem.

5. Imagem de dois fótons e re-imagem

1. Para futuras sessões de imagem subsequentes, que podem ser em qualquer lugar de algumas horas a meses após a sessão inicial de imagem, anestesiar o mouse (Isoflurane, 5% de indução e 1,5% de manutenção), montar no microscópio de dois fótons, manter em uma placa de aquecimento e reinjetar 100 μl um corante de vaso sanguíneo como Rhodamine B (2 mg/mL).
2. Abra as imagens obtidas anteriormente no ImageJ e, usando essas imagens, bem como as notas da sessão anterior, identifique as áreas anteriormente imagens e reimagem-as cuidadosamente.
3. Repita isso enquanto a janela de imagem estiver clara ou essencial para a extensão do estudo.

Resultados

Para visualizar a dinâmica microglial in vivo, foram utilizados^camundongos CX3CR1^GFP/+duplo transgênicos. A linha Thy1-YFP H é usada em oposição à linha Thy1-GFP M para evitar a sobreposição de flores de microglia (GFP) e neurônios (YFP). Abordagens alternativas podem usar uma linha de repórteres na qual a microglia é rotulada com, por exemplo, tdTomato e, em seguida, a linha M Thy1-GFP pode ser usada. Uma desvantagem da linha H é que o YFP rotula muitos neurônios e o rótulo aumenta co...

Discussão

O advento da imagem in vivo de dois fótons abriu oportunidades para explorar a infinidade de interações celulares e dinâmicas que ocorrem no cérebro saudável. Estudos iniciais se concentraram no uso da abordagem da craniotomia do crânio aberto para dendritos neuronais de imagem por imagem aguda e crônica^37,38. Isso também pode ser usado para elucidar interações neuroimunes no cérebro. Este protocolo descreve um método para a imagem confiável de cél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Drill Bit	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1