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요약

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

초록

중추 신경계 (CNS)는 적절한 기능을 용이하게하는 신경, 신경교, 기질 및 혈관 세포의 복잡한 상호 작용에 의해 조절됩니다. 비록 시험관 내 또는 함께 전 생체 내에서 격리에서 이러한 세포를 연구 하는 데 유용한 생리 정보를 제공; 신경 세포 생리학의 현저한 특징은 그러한 맥락에서 놓칠 것입니다. 따라서 생체 내 환경에서 자신의 네이티브신경 세포를 연구할 필요가 있다. 여기에서 상세한 프로토콜은 설치류 피질에 있는 신경 세포의 생체 내 2광자 화상 진찰에 있는 반복적인 기술하고 시간에서 달에 시간의 연장된 기간 동안 특정 세포를 구상하고 공부하기 위한 공구로 설명합니다. 우리는 거친지도 또는 형광으로 표시된 원원자로 심하게 안정된 뇌 혈관의 사용을 관심있는 일부 뇌 영역의 미세한지도로 자세히 설명합니다. 이러한 맵을 시각적 키로 사용하여, 우리는 어떻게 신경 세포가 생체 내 이미징에서 후속 반복을 위해 정확하게 재배치될 수 있는지 보여줍니다. 형광 표지 된 마이크로글리아, 뉴런 및 NG2+ 세포의 생체 내 이미징의 예를 사용하여,이 프로토콜은 장기간 에 걸쳐 동일한 뇌 위치에서 세포 역학의 반복적 인 시각화를 허용하는이 기술의 능력을 보여 주며, 이는 정상적인 생리학 또는 다음 병리학 적 모욕에서 이러한 세포의 구조적 및 기능적 반응을 이해하는 데 더 도움이 될 수 있습니다. 필요한 경우, 이 접근법은 신경 세포의 기능적 이미징(예: 칼슘 이미징)과 결합될 수 있습니다. 이 접근법은 특히 유전 마우스 모델 또는 관심있는 세포를 라벨화하기 위해 뚜렷한 형광 태그가있는 특정 염료가 있는 생체 내의 CNS의 다른 세포 유형 간의 물리적 상호 작용을 시각화하는 강력한 기술입니다.

서문

중추 신경계 (CNS)는 뉴런, glia 및 혈관 관련 세포를 포함한 다양한 상주 세포 유형 간의 상호 작용의 복잡한 상호 작용에 의해 지배된다. 전통적으로 신경세포는 분리, 공동 배양1,,2,,3,4,4,5(시험관내) 또는 절제된 뇌 조직(ex vivo)5 6,,7,,8,,9,,10개의 문맥에서 연구되었다. 그러나, 생체 내에서 온전한 뇌의 네이티브 환경에서 신경 세포 행동과 상호 작용을 더 이해할 필요가 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 관심있는 생체 영역에서 매핑하고 오랜 기간 동안 다양한 CNS 세포 유형 사이의 복잡한 상호 작용을 추적하기 위해 향후 이미징 세션에서 해당 영역을 정확하게 다시 이미지하는 방법을 설명합니다.

생체 내 이미징 접근법의 발달은 신경,기능(11,,12,13,14,,15)의 적절한 이해를 위해 상당한 이득을제공했습니다., 특히, 이러한 접근 방식은 기존의 체외 및 ex vivo 접근 방식에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 생체 내 이미징 시스템은 신경망 생리학의 완전한 이해를 제공하기 위해 세포 상호 작용의 전체 레퍼토리와 혈관과 같은 생리학적으로 관련된 세포 및 조직 성분을 갖는다. 둘째, 최근 연구 결과는 그들의 네이티브 환경에서 제거될 때, 특정 신경 세포 (microglia와 같은)가 생체 내 설정에서 보존될 수 있는 그들의 정체성 및 따라서 생리학16,,17의 중요한 특징을 분실한다는 것을 건의합니다. 셋째, 생체 내 이미징 시스템은 CNS 세포 상호 작용을 연구하기 위해 몇 주에서 몇 달까지의 안정적인 세로 조사를 위한 기회를 제공합니다. 마지막으로, CNS 생리학에서 말초 면역 계통18,,19 및 미생물군유전체20,,21의 기여도에 대한 증가증거를 감안할 때, 생체 내 시스템은 CNS 세포에 대한 그러한 기여와 효과를 심문하는 플랫폼을 제공한다. 따라서, 건강, 부상 및 질병 상태에서 신경 면역 생리학 및 상호 작용을 연구하기 위하여 생체 내 화상 진찰에 있는 세로를 사용하는 접근은 전통적인 접근에 큰 보완적인 추가입니다.

이 프로토콜에서, 우리는 예로 마이크로글리아, 뉴런 및 NG2+ 세포를 포함하여 두뇌에 있는 다른 세포 모형을 이미지하는 믿을 수 있는 접근법을 기술합니다. 생체 내 신경 세포를 시각화하는 두 가지 접근법이 개발되었습니다: 얇은 두개골 접근법과 두개골 창 접근법을 가진 열린 두개골. 얇은 두개골 접근법이 사용 중이며 신경교 세포 활성화, 생리학적 척추 역학 및 항 염증제22,,23,,24,,25,얇은 두개골 접근법과 같은 열린 두개골 접근법의 단점 중 일부를 극복하기 때문에 선호되지만 얇은 두개골 접근법은 또한 몇 가지 중요한 단점을 보여줍니다. 첫째, 숱이 절차는 많은 연구원이 재 숱이 필요할 때 특히 완벽하기 어려운 것을 찾아는 아주 섬세한 절차입니다. 이것은 실험자가 두개골을 ~20 μm 깊이로 얇게 했다는 것을 확인하기가 어렵기 때문입니다. 둘째, 마우스 사이의 적절한 비교를 위해, 숱이 동일해야 하고 화상 진찰 세션 또는 마우스 사이 숱이 성공의 다양한 신경 구조물의 시각화를 복잡하게 할 수 있었습니다. 셋째, 세로 화상 진찰에 사용될 때, 얇은 두개골을 가진 동물은 두개골의 재숱이 채택될 때 세션의 제한된 수에만 사용될 수 있습니다. 포스, 뼈 조직의 일부는 여전히 남아 있기 때문에, 이미징의 깊이에 선명도 더 피상적이지만 더 깊은 영역만큼 많은 것을 허용 얇은 두개골 접근에서 손상 될 수 있습니다. 이에 비추어 해마와 같은 더 깊은 뇌 구조는 얇은 두개골 접근법으로 성공적으로 이미지화 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항은 이러한 우려를 극복할 수 있는 대안적이고 보완적인 접근법의 필요성을 제기합니다.

얇은 두개골 접근법에 대한 대안으로, 열린 두개골 창 이식 접근법은 두개골을 광학적으로 맑은 유리 커버슬립으로 대체하는 절차를 사용합니다. 이를 통해 거의 무제한의 이미징 세션을 허용합니다. 더욱이, 유리 커버슬립으로 두개골을 교체하는 것을 감안할 때, 이 방법은 몇 시간에서 달까지 광범위한 기간 동안 형광 태그된 뇌 세포의 명확한 보기 창을 허용하고, 따라서 생리학, 노화 및 병리학과 관련된 세포 활동 및 상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다.

전반적으로, 우리는 관심있는 두뇌 지구의 생체 내 화상 진찰을 가능하게 하는 입체 적인 두개골 절제술을 통해 임플란트 만성 두개골 창을 하기 위하여 따를 수 있는 단계를 상세히 설명합니다. 우리는 또한 어떻게 심하게 안정된 두뇌 혈관 또는 형광으로 표시된 원더라이트가 관심있는 두뇌 지구의 각각 거친 또는 미세지도를 생성하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근 은 다음 여러 세션에 반복 된 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 기술의 중요성은, 그러므로, 다른 세포 모형의 배열, 형태학 및 상호 작용을 포함하여 두뇌 요소에 있는 장기 변경 또는 정지를 이미지하는 기능에 있습니다.

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프로토콜

모든 단계는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 설정 및 승인 된 지침에 따라.

1. 두개골 창 이식에 대한 마우스 준비

참고: 플로리스트포트 태그가 있는 다양한 형질전환 마우스 라인은 이미징에 적합합니다.

  1. CX3CR1GFP/+ 마우스(26)를 사용하여 생체 내 마이크로글리아를 시각화합니다. 전형적으로, 17-25 g의 무게가 있는 4-10 주 된 마우스에 젊은 성인에 청소년이 사용됩니다.
    참고 : 비록, 이 접근법은 미리 짜인 마우스를 위해 조차 쉽다, 수유를 위해 그들의 어머니와 함께 그들의 새장에 마우스를 반환하는 필요, 어머니가 수술 후 새끼의 적당한 배려를 취하지 않는 경우에 복구를 복잡하게 할 수 있습니다. 따라서 마우스를 포스트 위닝하는 것이 좋습니다.
  2. 마취 챔버에서 이소플루란 (1 분 동안 유도를위한 산소의 5 % 흐름)를 사용하여 마우스를 마취한다. 마우스에 발가락 및/또는 꼬리 핀치에 대한 움직임이나 경련 반응이 표시되지 않는지 확인합니다. 마우스를 챔버 밖으로 꺼내 야외에서 머리 의 머리카락을 머리 사이를 머리 의 머리카락을 머리 위정도에서 머리 트리머를 사용하여 목 부위의 상단까지 철저히 면도하십시오.
    참고: 사용된 이소플루란의 농도는 유도 챔버의 크기에 따라 달라집니다. 따라서, 더 작은 챔버의 경우, 3-4% 이소플루란을 효과적으로 마취를 유도하는 데 사용할 수 있으며, 더 큰 챔버는 최대 5%를 필요로 한다.
  3. 마취를 위해 입체 수술 스테이션 코 콘으로 마우스를 이동 (수술 유지 보수를위한 1.5-2 %, 귀 막대를 사용하여 머리를 안정화하고, 따뜻한 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 유지.
  4. 눈 연고로 두 눈을 윤활합니다. 100 μL000 0.25% 부피비카인(8-12h 지속되는 마우스에 국소 진통을 제공하기 위해) 및 4 mg/mL 덱사메타손의 100 μL(수술 절차에서 발생할 수 있는 염증을 줄이기 위해) 절개 부위에서 피하한다. 다음 단계로 이동하기 전에 마우스가 5분 이상 앉아 있게 합니다.
  5. 세 번의 베타딘 면봉과 70% 알코올로 면도된 머리를 청소하십시오. 귀 사이의 두개골 부위 뒤쪽에서 눈 사이의 정면 영역으로 확장되는 수술 용 블레이드 또는 가위를 사용하여 중간 선 두피 절개를 합니다. 나머지 피부는 두개골을 노출하기 위해 절단됩니다.
  6. 과산화수소(H2O2)로두피와 기본 두개골 사이에 위치한 결합 조직을 청소하고 스테레오전술 좌표로 이미지할 뇌 영역을 국소화합니다.
    참고 : 종종 두개골 표면의 절개에서 약간의 출혈 (1.5 단계)이 있습니다. 이 출혈은 일반적으로 3-5 분 이내에 자체적으로 해결됩니다. 이전 부피바카인 치료 (단계 1.4) 또한이 시간 동안 출혈의 양을 제한 하는 것으로 지적 된다.

2. 마우스 두개골 창 이식 수술

  1. 치과 드릴 비트 (0.7mm 팁 직경)를 사용하여 두개골에 원형 개구부 ~ 4mm를 드릴링하고 뾰족한 집게를 사용하여 두개골의이 부분을 조심스럽게 제거하십시오. 6-8주 된 마우스의 소마티코 피질을 이미징하기 위해- -2.5 후방 및 ±2.0 측면에서 두개내절제술의 중심을 브레그마에 찾아냅니다. 드릴링 하는 동안, 정기적으로 뇌를 냉각 하는 멸균 식염수와 면 봉면으로 두개골을 축 하, 뼈 파편을 청소 하 고 최종 제거에 대 한 두개골 뼈를 부드럽게.
    참고: 두개골 절제술에 대한 좌표는 관심 영역과 마우스의 나이에 따라 달라집니다.
  2. 두개골을 제거 한 후, 조심스럽게 두개골 절제술에 식염수로 적신 작은 커버 글래스 (크기 #0 0.1 ± 0.02mm 두께)를 배치합니다. 멸균 닦아 여분의 식염수를 건조.
  3. 뾰족한 어플리케이터(예: 피펫 팁 또는 깨진 나무 면봉 스틱의 뾰족한 끝)를 사용하여 창 주변에 시아노아크라이레이트 접착제를 적용하여 뇌와 두개골에 부착할 수 있도록 합니다. 두개골의 나머지 부분에 프라이머 접착제를 적용하고 20-40 초경경화빛으로 치료하십시오.
  4. 프라이머 접착제를 프라이머로 먼저 두개골의 반구에 두개골에 작은 머리 접시를 붙이고 최종 접착제로. 각각 20-40 s의 경화 광으로 모두 치료하십시오.
    참고: 이 절차 중에 두개골이 접착제로 완전히 덮여 있는 경우 봉합사필요하지 않습니다.

3. 수술 후 치료

  1. 마취가 없는 상태에서 마우스가 깨어나도록 허용합니다(가열 패드에서 복구하면 복구 시간이 단축됩니다) 한 번 완전히 깨어 나면 홈 케이지로 되돌아갑니다. 72h에 충분 한 수술 후 진통으로 buprenorphine SR의 하나의 피하 복용량을 주입 (0.5 mg/kg) 수술 후 진통으로.
  2. 수술에서 건강한 회복을 용이하게하기 위해, 마우스에게 여분의 부드러운 음식을 제공, 이는 젤의 형태로 차우 또는 음식을 부드럽게하기 위해 물에 일반 고체 차우의 형태로 될 수 있습니다.
    참고: 수술 직후 소프트 푸드를 일회성으로 제공하는 것만으로도 충분합니다.
  3. 수술 절차의 첫 번째 72 시간 동안 건강과 적절한 회복을 위해 매일 마우스를 모니터링하십시오. 그 후, 창 이식 수술에서 2 주 일찍부터 이미징을 수행.
    참고: 잘 하면, 마우스는 정상적인 외래 행동, 충분 한 케이지 탐사, 좋은 수분 공급, 안정적인 체중 증가 및 케이지에 있는 다른 마우스와 광범위 한 상호 작용을 보여주는 잘 복구 및 케이지에 다른 항목. 혼수, 탈수 및 수술 후 10% 이상의 체중 감소를 나타내는 마우스는 안락사및 연구에서 제거됩니다.

4. 초기 이미징을 위한 2광자 뇌 매핑

  1. 마우스 마취(이소플루란, 5% 유도 및 1.5% 유지 보수). 나사를 사용하여 헤드플레이트를 2광광 현미경 단계에 장착하고 35°C의 가열 플레이트에 유지관리한다. 로다민 B(2 mg/mL)와 같은 혈관 염료의 100 μL을 내보라고 한다.
    참고: 이미징은 마취 없이 깨어있는 마우스에서도 할 수 있습니다. 그러나, 최근 연구에 따르면 마취는 마이크로글리아겔 감시역학27,,28,,29에 영향을 미치고 깨어 있는 마우스에서 2개의 광자 이미징에 대한 헤드 고정이 적어도 25일 동안 만성 이미징 중에도 스트레스를 증가시킨다는 것을 나타낸다(Juczewski et al., 2020 참조)30.
  2. 70% 에탄올에 두드려 면봉을 사용하여 두개골 창의 표면을 부드럽게 청소하십시오. 두개골 창에 물이나 식염수 몇 방울을 넣고 목표가 몰입 렌즈이기 때문에 목표 렌즈를 용액으로 낮춥춥니까.
  3. 거친 지도를 손으로 그려 실험실 노트북에서 주요 혈관 랜드 마크를 나타내는 동안 epiflorescence에 의해 안구를 통해 보고. 이 도면을 사용하여 두 개의 광자 이미징 중에 특정 영역을 식별합니다. 또는 현미경에 장착된 카메라를 통해 또는 핸드헬드 카메라 또는 전화를 통해 혈관 사진을 찍습니다.
    참고: 손으로 그린 이 이미지와 사진은 두 개의 광자 이미징 전에 현미경하에서 동일한 넓은 영역을 다시 방문하는 것을 용이하게 하기 위한 것입니다. 이러한 매핑은 정확한 이미지 매핑이 아닙니다.
  4. 두 개의 광자 이미징에서 필요에 따라 식물성 세포와 혈관의 이미지를 수집합니다. 후속 이미징을 위해 정확한 영역을 다시 검토할 수 있도록 적절한 좌표로 주의 하십시오. 이 초기 이미징 세션에서 여러 가지 시야를 수집합니다(예: 조직의 부피를 통해 1-2 μm마다 z 스택 이미지를 획득합니다.
    참고: 두 개의 광자로 이미지를 수집하는 동안 혈관 랜드마크는 거친 매핑에 사용됩니다. 미세 매핑이 필요한 경우, Thy1-YFP31 마우스의 YFP 라벨 형원가 사용됩니다.
    1. 이미징에 이러한 권장 매개 변수를 사용하십시오: 880-900 nm의 파장이 최적입니다. GFP 및/또는 dsRed/로다민 여기의 경우 525/50 nm(녹색 채널) 및 620/60 nm(빨간색 채널) 방출 필터가 있는 565nm 디크로이크 미러가 사용됩니다. GFP 및 YFP 분리의 경우 500/15 및 537/26 nm 방출 필터가 있는 509 nm dichroic 미러가 사용됩니다. 뇌의 힘은 25 mW 이하로 유지됩니다. 이미지 해상도는 1024 x 1024 픽셀이며, 1.5X 줌 계수에서 25X 0.9 NA 목표로 촬영한 시야는 295.24 x 295.24 μm이다.
  5. 이미징의 끝에서, 무대에서 마우스를 가지고, 마취에서 일어나 미래의 이미징 세션까지 홈 케이지로 돌아갈 수 있습니다.

5. 2광자 이미징 및 재이미징

  1. 초기 이미징 세션 후 몇 시간에서 몇 달까지 어디서나 할 수있는 미래의 후속 이미징 세션의 경우 마우스 (Isoflurane, 5 % 유도 및 1.5 % 유지 보수)를 마취하고 2 광자 현미경에 장착하고 가열 판에 유지하고 로다민 B (2 mg /mL)와 같은 혈관 염료를 100 μl다시 주입합니다.
  2. ImageJ에서 이전에 얻은 이미지를 열고 이전 세션의 메모뿐만 아니라 이러한 이미지를 사용하여 이전에 이미지된 영역을 식별하고 신중하게 다시 이미지화합니다.
  3. 이미징 창이 명확하거나 연구의 범위에 필수적인 한 이것을 반복하십시오.

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결과

생체 내에서 마이크로글리아역학을 시각화하기 위해 이중 형질전환 CX3CR1GFP/+:Thy1YFP 마우스가 사용되었다. Thy1-YFP H 라인은 microglia (GFP) 및 뉴런 (YFP)의 꽃 중첩을 피하기 위해 Thy1-GFP M 라인과 반대로 사용됩니다. 대체 접근법은 마이크로글리아가 예를 들어 tdTomato로 표시되고 Thy1-GFP M 라인을 사용할 수 있는 리포터 라인을 사용할 수 있습니다. H 라인의 단점은 YFP가 많은 뉴런을 라벨?...

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토론

생체 내 2광자 이미징의 출현은 건강한 뇌에서 발생하는 세포 상호 작용과 역학의 과다를 탐구 할 수있는 기회를 열었습니다. 초기 연구는 급성 및 만성 이미징37, 38모두에,의해 심신경 원더라이트를 이미지에 개방 두개골 두개골 절제술 접근법을 사용하는 데 초점을맞췄다. 이것은 또한 두뇌에 있는 신경 면역 상호 작용을 해명하기 위하여 이용될 수 ?...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 원고에 제시된 아이디어에 대해 논의해 주신 에요랩 회원들에게 감사드립니다. 우리는 NG2DsRed 마우스33의선물에 대한 버지니아 대학의 Kipnis 연구소에서 박사 저스틴 Rustenhoven 감사합니다. 이 작품은 U.B.E (K22 NS104392)에 건강의 국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 자금지원.

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자료

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