Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von asymmetrischer Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung in Verbindung mit UV-vis-Detektion zur Bestimmung der Größe einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe.

Zusammenfassung

Die Partikelgröße ist wohl der wichtigste physikalisch-chemische Parameter, der mit dem Begriff eines Nanopartikels verbunden ist. Genaue Kenntnisse der Größe und Größenverteilung von Nanopartikeln sind für verschiedene Anwendungen von größter Bedeutung. Der Größenbereich ist ebenfalls wichtig, da er die "aktivste" Komponente einer Nanopartikeldosis definiert.

Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung (AF4) ist eine leistungsstarke Technik zur Dimensionierung von Partikeln in Suspension im Größenbereich von ca. 1–1000 nm. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Größeninformationen aus einem AF4-Experiment abzuleiten. Neben der Online-Kopplung von AF4 mit größenempfindlichen Detektoren, die auf den Prinzipien der Multi-Angle Light Scattering oder Dynamic Light Scattering basieren, besteht auch die Möglichkeit, die Größe einer Probe mit ihrer Retentionszeit nach einem etablierten theoretischen Ansatz (FFF-Theorie) oder durch vergleicht es mit den Retentionszeiten von genau definierten Partikelgrößenstandards (externe Größenkalibrierung) zu korrelieren.

Wir beschreiben hier die Entwicklung und interne Validierung eines Standard-Betriebsverfahrens (SOP) zur Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe durch AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion mittels externer Größenkalibrierung mit Gold-Nanopartikel-Standards im Größenbereich von 20–100 nm. Dieses Verfahren bietet eine detaillierte Beschreibung des entwickelten Workflows einschließlich Probenvorbereitung, AF4-Instrumentenaufbau und -Qualifizierung, AF4-Methodenentwicklung und -Fraktionierung der unbekannten Gold-Nanopartikelprobe sowie die Korrelation der erhaltenen Ergebnisse mit der etablierten externen Größenkalibrierung. Das hier beschriebene SOP wurde schließlich im Rahmen einer interlaborativen Vergleichsstudie erfolgreich validiert, die die hervorragende Robustheit und Zuverlässigkeit von AF4 für die Dimensionierung von Nanopartikelproben in Suspensionen hervorhebt.

Einleitung

Gold-Nanopartikel (AuNP) in Form von kolloidalem Gold waren schon lange vor dem Verständnis der Nanopartikel und bevor der Begriff Nanopartikel seinen Weg in das zeitgenössische, wissenschaftliche Vokabular gefunden hatte, ein Teil der menschlichen Kultur gewesen. Ohne besondere Kenntnis ihres nanoskaligen Aussehens wurde die suspendierte AuNP bereits im alten China, Arabien und Indien im V-VI Jahrhundert¹für medizinische und andere Zwecke verwendet, und auch die alten Römer nutzten ihre rubinrote Farbe, um ihre Keramik in der Lycurgus-Cup-Ausstellung im British Museum²zu färben. In der westlichen Welt, im Laufe der Jahrhunderte vom Mittelalter bis zur Neuzeit, suspendiert AuNP wurden vorwiegend als Farbstoffe für Glas und Emaille (Lila von Cassius)³ sowie zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten (Potable Gold), vor allem Syphilis⁴.

Jedoch, alle diese Studien hatten sich in erster Linie auf die Anwendung der ausgesetzten AuNP konzentriert und es war an Michael Faraday im Jahr 1857, den ersten rationalen Ansatz einzuführen, um ihre Bildung, ihre Art sowie ihre Eigenschaften zu untersuchen⁵. Obwohl Faraday bereits wusste, dass diese AuNP sehr winzige Dimensionen haben muss, war es erst die Entwicklung der Elektronenmikroskopie, als explizite Informationen über ihre Größenverteilung zugänglich waren^6,7, was schließlich die Korrelation zwischen Größe und anderen AuNP-Eigenschaften ermöglichte.

Heute, dank ihrer ziemlich einfachen und einfachen Synthese, bemerkenswerten optischen Eigenschaften (Oberflächen-Plasmonresonanz), gute chemische Stabilität und damit geringe Toxizität sowie ihre hohe Vielseitigkeit in Bezug auf verfügbare Größen und Oberflächenmodifikationen, AuNP haben weit verbreitete Anwendungen in Bereichen wie Nanoelektronik⁸, Diagnostik⁹, Krebstherapie¹⁰oder Medikamentenabgabe¹¹gefunden. Natürlich ist für diese Anwendungen die genaue Kenntnis der Größe und Größenverteilung des angewandten AuNP eine Grundvoraussetzung, um eine optimale Wirksamkeit zu gewährleisten^12, und es besteht ein erheblicher Bedarf an robusten und zuverlässigen Werkzeugen zur Bestimmung dieses entscheidenden physikalisch-chemischen Parameters. Heute gibt es eine Vielzahl von Analytischen Techniken, die AuNP in Suspension dimensionieren können, einschließlich, zum Beispiel UV-vis-Spektroskopie (UV-vis)¹³, Dynamic Light Scattering (DLS)¹⁴ oder Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)¹⁵ mit Field-Flow Fractionation (FFF) als Schlüsselakteur in diesem Bereich^{16,17,18,19,20}.

Erstmals 1966 von J. Calvin Giddings²¹konzipiert, umfasst FFF eine Familie von elutionsbasierten Fraktionierungstechniken, bei denen die Trennung innerhalb eines dünnen, bandartigen Kanals ohne stationäre Phase^22,23stattfindet. In FFF wird die Trennung durch die Wechselwirkung einer Probe mit einem externen Kraftfeld induziert, das senkrecht zur Richtung eines laminaren Kanalflusses wirkt, bei dem die Probe in der Regel flussabwärts zu den jeweiligen Inline-Detektoren transportiert wird. Unter diesen verwandten FFF-Techniken ist die asymmetrische Durchflussfeld-Flussfraktion (AF4), bei der ein zweiter Durchfluss (Kreuzfluss) als Kraftfeld fungiert, zum am häufigsten verwendeten Subtyp²⁴geworden. In AF4 ist der Kanalboden (Akkumulationswand) mit einer halbdurchlässigen Ultrafiltrationsmembran ausgestattet, die in der Lage ist, die Probe zu halten und gleichzeitig den Querfluss durch die Membran passieren zu lassen und den Kanal über einen zusätzlichen Ausgang zu verlassen. Auf diese Weise kann der Querstrom die Probe zur Akkumulationswand schieben und so ihrem diffusionsinduzierten Fluss (Brownsche Bewegung) entgegenwirken. In einem resultierenden Gleichgewicht von feld- und diffusionsinduzierten Flussarten; kleinere Probenbestandteile mit höheren Diffusionskoeffizienten richten sich näher am Kanalzentrum aus, während größere Probenbestandteile mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten näher an der Akkumulationswand liegen. Durch das parabolische Strömungsprofil innerhalb des Kanals werden daher kleinere Probenbestandteile in den schnelleren Laminaen des Kanalflusses transportiert und vor größeren Probenbestandteilen elute. Mit FFF-Retentionsparametern und Stokes-Einstein-Diffusionskoeffizientengleichungen können dann die Elutionszeit bzw. das Elutionsvolumen einer Probe in AF4 direkt in ihre hydrodynamische Größe²²übersetzt werden. Hier bezieht sich das beschriebene Elutionsverhalten auf den normalen Elutionsmodus und gilt in der Regel für AF4 innerhalb eines Partikelgrößenbereichs zwischen ca. 1–500 nm (manchmal bis zu 2000 nm je nach Partikeleigenschaften und Fraktionierungsparametern), während die sterisch-hyperlayerElution in der Regel oberhalb dieses Größenschwellenwerts²⁵auftritt.

Es gibt drei gängige Möglichkeiten, Größeninformationen nach der Trennung durch FFF abzuleiten. Da FFF ein modulares Instrument ist, kann es nachgeschaltet mit mehreren Detektoren wie größenempfindlichen Lichtstreudetektoren nach dem Prinzip der Multi-Angle Light Scattering (MALS)^26,27, Dynamic Light Scattering (DLS)^28,29oder sogar einer Kombination aus beidem kombiniert werden, um zusätzliche Forminformationen zu erhalten^30,31. Da jedoch das Retentionsverhalten einer Probe in einem FFF-Kanal im Allgemeinen durch genau definierte physikalische Kräfte gesteuert wird, kann die Größe auch mit einem mathematischen Ansatz (FFF-Theorie) berechnet werden, bei dem ein einfacher Konzentrationsdetektor (z.B. ein UV-Vis-Detektor) ausreicht, um das Vorhandensein einer eluierenden Probe^32,33anzuzeigen.

Als dritte Option berichten wir hier über die Anwendung einer externen Größenkalibrierung^34,35 unter Verwendung klar definierter AuNP-Standards im Größenbereich von 20–100 nm für die Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe in Suspension mit AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion. Dieses einfache Versuchsgebildt wurde absichtlich gewählt, um möglichst vielen Laboratorien die Teilnahme an einem internationalen Interlaborationsvergleich (ILC) zu ermöglichen, der später im Rahmen des Horizont-2020-Projekts ACEnano der Europäischen Union auf der Grundlage des hier vorgestellten Protokolls durchgeführt wurde.

Protokoll

1. AF4-Systemaufbau

1. Montieren Sie die AF4-Patrone und schließen Sie alle Hardwarekomponenten des AF4-Systems und des UV-Vis-Detektors(Materialtabelle) gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch an.
2. Installieren Sie alle notwendigen Softwarepakete zur Steuerung, Datenerfassung, Verarbeitung und Auswertung gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch.
3. Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Signalverbindungen zwischen dem AF4-System und dem UV-Vis-Detektor hergestellt wurden.
4. Stellen Sie sicher, dass die etablierten AF4-UV-vis-Verbindungen dicht und ohne Leckagen sind, indem Sie das Setup mit Reinstwasser (UPW) für 15 min spülen (Spitzendurchfluss 1 mL-min^-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min^-1und Querdurchfluss rate 1,5 ml-min^-1). Öffnen Sie dazu die Steuerungssoftware AF4 und geben Sie die Durchflussraten in die entsprechenden Panels auf der rechten oberen Seite der Zielseite ein. Ziehen Sie ggf. die entsprechenden Anschlüsse (Fittings) fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis keine Leckagen erkennbar sind.
   HINWEIS: Der interne Systemdruck bei allen Messungen sollte überwacht werden und muss innerhalb von 4 bis 12 bar liegen. Wenn der Druck höher oder niedriger ist, müssen die Rückdruckschläuche angepasst werden. Darüber hinaus sollte der Kanaldrucktrend über die gesamte Messzeit konstant sein.
   HINWEIS: Wenn ein Kanalofen verfügbar ist, stellen Sie seine Temperatur auf 25 °C ein, um vergleichbare Messbedingungen während aller AF4-Experimente zu gewährleisten.

2. Vorbereitung von Lösungen und Suspensionen für DIE AF4-UV-vis Systemqualifizierung und Probenanalyse

1. Reinigungslösung
   1. 8 g festes Natriumhydroxid (NaOH) und 2 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 1 L UPW geben und die Lösung bis zur vollständigen Auflösung rühren.
2. Eluent
   1. Fügen Sie 500 l gefiltertes Tensidgemisch zu 2 L gefiltertem und entgastem UPW hinzu, um das Eluent (0,025% (v/v), pH-Wert um 9,4 zu erhalten.
      ANMERKUNG: Eine detaillierte Beschreibung der Verbindungen des Tensidgemisches ist in Tabelle 1 (auch Materialtabelle) enthalten.
3. Willkürlicher AuNP-Größenstandard für die Massenrückgewinnungsbestimmung
   1. Vortex eine beliebige AuNP Größe Standard (50 mg^{-L -1}) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg-L^-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspension.
      VORSICHT: Bei der Arbeit mit Chemikalien, insbesondere NaOH-Pellets, sind notwendige Vorsichtsmaßnahmen und geeignete Schutzausrüstung erforderlich.
      HINWEIS: Es wird allgemein empfohlen, alle notwendigen Lösungen (mit Ausnahme der Reinigungslösung) mit einem 0,1 m-Membranfilter (hydrophiler PVDF oder ähnliches) zu entgasen und zu filtern, um einen geringen Partikelhintergrund während AF4-UV-vis-Experimenten zu gewährleisten. Dies kann entweder durch eine spezielle Vakuumfiltrationseinheit oder durch den Einsatz von Spritzenfiltern festgestellt werden.

3. AF4-UV-vis Systemqualifikation

1. Verwenden Sie die in Schritt 1.4 beschriebenen Softwareeinstellungen, um das System mit der Reinigungslösung für 30 min zu spülen (Tip-Durchflussrate 1^{mL-min -1}, Fokusdurchflussrate 1 mL-min^-1und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml^{-min -1}).
2. Ändern Sie die jeweilige Eluentflasche und spülen Sie das System mit UPW für 20 min (Tip-Durchfluss 1 mL-min^-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min^-1, und Kreuzdurchfluss 1,5 mL^{-min -1}).
3. Ersetzen Sie die entsprechenden Inline-Pumpenfilter.
4. Öffnen Sie die AF4-Patrone und ersetzen Sie die AF4-Membran. Setzen Sie die AF4-Patrone wieder zusammen und schließen Sie sie wieder mit dem AF4-UV-vis-System an.
5. Spülen Sie das gereinigte AF4-UV-vis-System mindestens 30 min mit dem Eluent, um die Membran auszudemt und das System zu stabilisieren (Tip-Durchflussrate 1 mL-min^-1, Fokusdurchfluss rate 1 mL-min^-1, und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml-min^-1). Überprüfen Sie erneut auf mögliche Leckagen (siehe Schritt 1.4).
6. Qualifizieren Sie das AF4-UV-vis-System, indem Sie die Massenrückgewinnung und Variation der Retentionszeit mithilfe eines beliebigen AuNP-Größenstandards bestimmen.
   1. Führen Sie einen Direkteinspritzlauf ohne Anwendung einer Trennkraft durch.
      1. Erstellen einer neuen Messdatei durch Öffnen der Datei| Neue | Führen Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4 aus.
      2. Definieren Sie die Beispiel- und Messbeschreibung sowie das Injektionsvolumen und den Beispielnamen auf der Registerkarte Ausführen. Die Messbedingungen sind in Tabelle 2dargestellt.
      3. Legen Sie die Messparameter in der zweiten Tab-FFF-Methode gemäß Tabelle 2fest.
      4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.
   2. Führen Sie einen Fraktionierungslauf mit Anwendung einer Trennkraft (Cross Flow) durch.
      1. Definieren Sie die Fraktionierungsmethode, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, mithilfe der in Tabelle 3angegebenen Fraktionierungsbedingungen .
      2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.
      3. Führen Sie die Messung im Quadruplicate durch.
         HINWEIS: Der erste Lauf zielt darauf ab, das System (d. h. die AF4-Membran) zu konditionieren und wird von der abschließenden Bewertung der Systemqualifikationsergebnisse ausgeschlossen.
         HINWEIS: Es wird empfohlen, alle generierten Ausführungsdateien zu speichern, indem Sie Datei-| Speichern Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4.
      4. Betrachten Sie das AF4-UV-vis-System qualifiziert, wenn eine Massenwiederherstellung von >80% und eine Variation der Retentionszeit <2% für den beliebigen AuNP-Größenstandard erhalten wird.
      5. Wenn Sie einen Autosampler als Einspritzsystem verwenden, füllen Sie die Nadelwaschbehälterflasche des Autosamplers mit der gleichen Lösung, die durch das AF4-UV-vis-System gepumpt wird (z. B. Reinigungslösung, UPW oder entsprechendes Eluent), um optimale Laufbedingungen zu gewährleisten. Beim Wechsel des Eluents wird generell empfohlen, die Wiederausgleich des AF4-Systems zu verfolgen, indem das UV-vis-Detektorsignal überwacht wird, bis seine Ausgangsbasis konstant stabil bleibt.

4. AF4-UV-vis Probenanalyse

1. Bereiten Sie alle AuNP-Größenstandards für die externe Größenkalibrierung vor, indem Sie die jeweilige AuNP-Suspension (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, je 50 mg) vorstrichen. L^-1) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg l^-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspensionen.
2. Bereiten Sie die unbekannte AuNP-Probe für die Analyse vor, die das gleiche Verfahren wie für die in Schritt 4.1 beschriebenen Kalibrierstandards anwendet.
3. Führen Sie eine Direkteinspritzung aller AuNP-Größenstandards mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.
   1. Geben Sie dazu die entsprechenden Werte, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein, um die Trenn- und Beispielparameter zu definieren, und drücken Sie die Run-Taste, um das Experiment zu starten.
4. Fraktionieren Sie jeden AuNP-Größenstandard einzeln mit der in Tabelle 3 dargestellten AF4-Methode, um die externe Größenkalibrierungsfunktion festzulegen.
   1. Geben Sie die entsprechenden Werte, die in Tabelle 3 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein. Die Fraktionierungsmethode wird durch einen Fokussierschritt, mehrere Elutionsschritte und einen Spülschritt definiert. Nachdem Sie die Methode eingerichtet haben, drücken Sie die Schaltfläche Ausführen, um das Experiment zu starten.
5. Führen Sie eine Direkteinspritzung der unbekannten AuNP-Probe mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.
6. Führen Sie die Fraktionierung der unbekannten AuNP-Probe durch, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführte AF4-Methode durchführen.
7. Führen Sie alle in Abschnitt 3 und 4 genannten Messungen in dreifacher Ausfertigung durch, sofern nicht anders angegeben, um aussagekräftige und statistisch relevante Ergebnisse zu gewährleisten.
   1. 50 mg-L^-1 AuNP-Lagersuspensionen bei 4–8 °C vor Gebrauch lagern. Verdünnte AuNP Suspensionen werden vor der Anwendung ideal erweise innerhalb von 30 min zubereitet.
      HINWEIS: Vortexing ist in der Regel ausreichend und es ist keine Ultraschallbehandlung der Suspensionen erforderlich.
   2. Um eine Korrelation der Retentionszeit der unbekannten AuNP-Probe mit den für die AuNP-Größenstandards erhaltenen Aufbewahrungszeiten zu ermöglichen, messen Sie alle Proben mit der gleichen AF4-Methode.
      ANMERKUNG: Um konstante und gültige Trennbedingungen zu gewährleisten, schließen Sie den im Abschnitt Systemqualifizierung (siehe Schritt 3.6.2) beschriebenen Fraktionierungsschritt nach einer definierten Anzahl von Stichprobenmessungen (z. B. 10 Messungen) ein./wiederholen Sie ihn. Darüber hinaus zeichnen Sie den Systemdruck und die Standeswertstabilität des UV-Vis-Detektors auf. Sie sollten während eines kompletten AF4-UV-vis-Laufs stabil und konstant bleiben.
      HINWEIS: Ersetzen Sie in der Regel die Ultrafiltrationsmembran, wenn der UV-Vis-Detektor (oder Der MalS-Detektor (Multi Angle Light Scattering, falls verfügbar) einen erhöhten Geräuschpegel anzeigt oder die definierten Systemqualifizierungskriterien wie Rückgewinnung, Probenspitzenform oder Wiederholbarkeit fehlen (oder das AF4-UV-vis-System einem gründlichen Reinigungsverfahren unterzogen wurde). Unter den hier beschriebenen Bedingungen ist das qualifizierte AF4-UV-vis-System in der Regel für mindestens 50 Messungen mit derselben Membran stabil; Die Anzahl möglicher aufeinanderfolgender Messungen, die die definierten Qualitätskriterien erfüllen, kann jedoch je nach Probe, Probenmatrix und Eluentenzusammensetzung erheblich variieren.

5. Datenauswertung

1. Führen Sie die Massenwiederherstellungsberechnung entweder mit der Datenauswertungssoftware des AF4-UV-vis-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. UV-vis Peak Area) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch.
   1. Berechnen Sie die AuNP-Massenrückgewinnung, indem Sie die Bereiche unter den jeweiligen UV-Vis-Spitzen der Fraktionierungsmessung (A_{Fractionation}) und der Direktinjektionsmessung (Eine_{Direkteinspritzung}) mit der folgenden Gleichung vergleichen:
      
      HINWEIS: Bei einer Direktinjektionsmessung wird keine Trennkraft angewendet, so dass mögliche Wechselwirkungen einer Analytenart mit der Akkumulationswand vernachlässigt werden können. Die Fläche unter einem jeweiligen UV-Vis-Peak kann nach dem Beer-Lambert-Gesetz direkt mit der AuNP-Masse korreliert werden, vorausgesetzt, dass keine andere Art innerhalb der Probe bei der jeweiligen Wellenlänge absorbiert und/oder i) Elutes zu einer anderen Retentionszeit unter Fraktionierungsbedingungen ii) durch die AF4-Membran entfernt wird.
   2. Importieren Sie die dat.-Dateien, die sowohl aus der Direktinjektion als auch aus dem Fractionation-Lauf gewonnen wurden.
   3. Wählen Sie die UV-Vis-Detektorspur auf der Registerkarte Übersicht aus.
   4. Definieren Sie eine Region of Interest (ROI) und eine Baseline in der Signal- und Basisansicht für alle Messungen.
   5. Setzen Sie eine Direkteinspritzung Überlageein.
   6. Wählen Sie alle Direktinjektionsläufe in der Ansicht "Direkte Injektionskalibrierungseinstellungen" aus und geben Sie einen UV-Aussterbekoeffizienten ein.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den gleichen UV-Vis-Aussterbekoeffizienten sowohl für die Kalibrierung als auch für die Fraktionierungsmessung zu verwenden.
   7. Richten Sie die Kalibrierlinie unter Verwendung des Bereichs unter der UV-vis-Signalspur innerhalb des ROI und der aus der eingegebenen Konzentration und dem Injektionsvolumen berechneten injizierten Menge ein. Die erhaltene Kalibrierung wird im separaten Fenster der Direkteinspritzungskalibrierungsfunktion angezeigt.
   8. Weisen Sie die Kalibrierfunktion den jeweiligen Fraktionierungsmessungen zu.
      HINWEIS: Für jeden Kalibriergrößenstandard und die unbekannte AuNP-Probe muss aufgrund der größenabhängigen UV-Vis-Absorption von AuNP eine separate Kalibrierfunktion eingerichtet werden. Dieser Nachteil des UV-Vis-Detektors kann mit einem massenempfindlichen Detektor wie einem ICP-MS umgangen werden.
   9. Führen Sie die Analysen durch Einfügen einer Berechnung der quantitativen Ergebnisse durch, und die Ergebnisse werden in einer Tabelle auf der rechten Seite als Konzentrations- und injizierte Mengenwerte angezeigt.
2. Berechnen Sie die Variation der Aufbewahrungszeit mit der Datenauswertungssoftware des AF4-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. Aufbewahrungszeiten der AuNP-Kalibrierstandards zu den jeweiligen UV-vis-Spitzenmaxima und bzw. ungültigen Zeiten) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch.
   1. Öffnen Sie das Fenster Übersicht, um die entsprechenden UV-Spuren für alle importierten Messungen anzuzeigen.
   2. Die Spitzenerkennung wird automatisch durchgeführt; passen Sie die Spitzenerkennungsparameter in der Signalverarbeitungs-Toolbox an, um die Leistung zu optimieren. Extrahieren Sie die jeweilige Peak Maxima, indem Sie alle Messdateien durchgehen.
   3. Berechnen Sie die relative Standardabweichung für alle Messungen mit der folgenden Gleichung:
      
      Die Berechnung kann auch mit einer entsprechenden Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt werden.
3. Führen Sie die Größenermittlung entweder mit der vom Hersteller bereitgestellten Datenauswertungssoftware oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (Aufbewahrungszeit bei UV-vis-Maximale an alyte und bzw. ungültiger Zeit) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch. Eine externe Größenkalibrierungsfunktion kann ermittelt werden, indem die lückenhaften, korrigierten Aufbewahrungszeiten (Nettoretentionszeiten, siehe Tabelle 5)der AuNP-Größenstandards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) anhand ihrer hydrodynamischen Größen dargestellt werden, die aus zuvor durchgeführten DLS-Messungen ermittelt wurden (siehe Tabelle 4).
   HINWEIS: Die DLS-Messungen sollten idealerweise am selben Tag wie die jeweiligen Fraktionierungsmessungen durchgeführt werden, um vergleichbare Probeneigenschaften zu gewährleisten.
   1. Nach dem Import der .dat Werden alle Messungen auf der Registerkarte Übersicht angezeigt. Wählen Sie das UV-Vis-Detektorsignal aus der Detektorliste aus, das unter dem Overlay-Fenster angezeigt wird. Definieren Sie für jede Messung einen ROI und einen Basiswert, der in der Signal- und Baseline-Ansicht angepasst werden kann. Verwenden Sie die Signalverarbeitungs-Toolbox auf der rechten Seite, um laute Signale zu glätten. Verwenden Sie die Funktion Verarbeitungsparameter anderen Runs zuweisen, damit die Parameter anderen Messungen bzw. Signalen zugeordnet werden können.
   2. Wählen Sie die Partikelgrößenkalibrierung auf der Registerkarte Einfügen aus.
   3. Wählen Sie alle Kalibrierläufe aus, indem Sie im Tabellenteil Referenzen für Kalibrierung auswählen auf der oberen rechten Seite auf die jeweilige Messung klicken. Alle ausgewählten Messungen werden in einer Tabelle unten angezeigt. Geben Sie den hydrodynamischen Radius für alle Kalibrierungsmessungen ein, die in Tabelle 4angegeben sind. Die Funktion wird im Partikelgrößenkalibrierungsfenster – Funktionsfenster und die Gleichung angezeigt.
      HINWEIS: Der Korrelationskoeffizient (R²) der etablierten Größenkalibrierungsfunktion muss ≥0,990 betragen.
   4. Weisen Sie die Kalibrierungsfunktion den Messungen der unbekannten AuNP-Probe zu, indem Sie die entsprechenden Fraktionen in der Liste "Läufe für Zuweisung auswählen" auswählen.
   5. Zeigen Sie die Ergebnisse an, indem Sie eine Partikelgrößenverteilungsberechnung innerhalb der Registerkarte Einfügen öffnen. Die zuvor erstellte Partikelgrößenkalibrierung wird als Kalibrierung für die unbekannten AuNP-Probenmessungen aufgeführt, die in den rechten Fenstereinstellungenangezeigt wird. Die berechnete Größe wird im Größenverteilungsfenster angezeigt, das auf das maximale Spitzenmaximum beschriftet ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Durchschnittliche Signale für Sample, um alle Messungen einer Probe zu durchschnittlichen, und listen Sie das Ergebnis in der maximalen Höchstbeschriftung auf.
   6. Zeichnen Sie außerdem die Kalibrierungslinie über das Fractogramm, indem Sie das Kontrollkästchen Kalibrierungskurve anzeigen aktivieren. Eine kumulative Größenverteilung ist verfügbar, indem Sie das Kontrollkästchen Kumulative Verteilung anzeigen aktivieren.
      HINWEIS: Wenn Sie die Software des Herstellers für die Datenauswertung verwenden, wird empfohlen, alle Ergebnisse zu einem Bericht hinzuzufügen, der durch Klicken auf Bericht auf der Registerkarte Einfügen generiert werden kann. Die Schaltfläche Bericht fügt einem Dokument alle Ergebnisse, Tabellen und Diagramme hinzu. Auf der Registerkarte Bericht können die Berichtseinstellungen geändert werden, indem Sie die Berichtseinrichtung im Abschnitt Dokument öffnen.

Ergebnisse

Zunächst wurden die AuNP-Größenstandards durch AF4 fraktioniert und durch UV-vis-Messung der Absorption der AuNP bei einer Wellenlänge von 532 nm (Oberflächen-Plasmonresonanz von AuNP) nachgewiesen. Eine Überlagerung der erhaltenen Fraktogramme ist in Abbildung 1dargestellt. Die Retentionszeiten jedes AuNP an seinem jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, das aus dreifachen Messungen gewonnen wird, sind in Tabelle 5aufgeführt. Die relative Standardabweichung aller Retentionszeiten lag unter 1,1% bei abnehmender Messabweichung mit zunehmender Größe. Insgesamt wurde eine hervorragende Wiederholbarkeit erreicht. Es wurde eine konstante Trennkraft angewendet, die zu einem linearen Verhältnis von Elutionszeit und hydrodynamischer Größe führte. Die externe Größenkalibrierungslinie wurde durch Plotten des angegebenen hydrodynamischen Radius gegen die nullzeit korrigierte Elutionszeit (Netto-Retentionszeit) ermittelt. Eine lineare Regressionsanalyse ergab eine lineare Kalibrierfunktion mit einem Intercept a = -3,373 nm ± 1,716 nm und einer Steigung b = 1,209^{nm-min -1} ± 0,055 nm'min^-1. Das lineare Verhalten der Elution wurde mit einem quadrierten Korrelationskoeffizienten R² von 0,9958 bestätigt. Die jeweilige Kalibrierfunktion wird in Abbildung 2visuell dargestellt.

Der zweite Teil befasste sich mit der Analyse der unbekannten AuNP-Probe. Drei Aliquots der Probe wurden nach dem im Protokollabschnitt beschriebenen Verfahren (Abschnitt 4.2) erstellt. Jeder der drei Aliquots wurde in Dreifacharbeit mit der gleichen AF4-Fraktionierungsmethode untersucht, die auch für die AuNP-Größenstandards angewendet wurde. Alle neun AF4-UV-vis-Fraktogramme, die aus der unbekannten AuNP-Probe gewonnen wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt und ihre jeweiligen Auswertungen sind in Tabelle 6zusammengefasst. Die relative Standardabweichung der jeweiligen Retentionszeiten war signifikant gering und lag zwischen 0,1% und 0,5%. Mit Der Partikelgrößenkalibrierungsfunktion, die aus der Fraktionierung der AuNP-Größenstandards gewonnen wurde und sie mit den erhaltenen Retentionszeiten der unbekannten AuNP-Probe am UV-vis-Spitzenmaximum korreliert, konnte ein durchschnittlicher hydrodynamischer Gesamtradius von 29,4 nm ± 0,2 nm berechnet werden. Darüber hinaus wurde eine angemessene Massenrückgewinnung von 83,1 % ± 1,2 % erzielt, was auf keine signifikante Agglomeration oder Auflösung der AuNP-Probe oder eine erhebliche Adsorption von Partikeln auf die Membranoberfläche hindeutet. Abbildung 4 zeigt die erhaltene Partikelgrößenverteilung mit allen neun UV-vis-Signalspuren, die im Durchschnitt die hervorragende Robustheit der angewendeten AF4-Methode hervorheben.

Abbildung 1: AF4-UV-vis Fraktogramme, die aus der dreifachen Analyse der vier einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards mit normalisierten Signalintensitäten und angewendeter konstanter Durchflussrate (schwarze Linie) gewonnen werden. Die Leertaste wird in etwa 5,9 min grau hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Erhaltene externe Größenkalibrierungsfunktion, einschließlich Fehlerbalken, die aus den jeweiligen Standardabweichungen der DLS-Messungen (Tabelle 4) und Varianzen in den erhaltenen AF4-Retentionszeiten (Tabelle 5) abgeleitet wurden, nachdem der angegebene hydrodynamische Radius mit der Retentionszeit jedes einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards an seinem jeweiligen Spitzenmaximum dargestellt wurde. Aus einer linearen Regressionsanalyse wurde eine lineare Kalibrierfunktion mit Standardfehlern in Form von y = a + bx mit a = -3.373 nm ± 1.716 nm und b = 1.209 nm'min^-1 ± 0.055 nm'min^-1 berechnet. Es wurde ein quadrierter Korrelationskoeffizient mit R² = 0,9958 ermittelt, der auf eine lineare Beziehung hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: AF4-UV-vis Fractogramme von dreifachen Messungen von drei Aliquots, die das unbekannte AuNP anzeigen. Der angewendete konstante Durchflussüberfluss über die Messzeit wird als schwarze Linie dargestellt. Der Leerstrich bei etwa 5,9 min wird grau hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Überlagerung der erhaltenen durchschnittlichen Partikelgrößenverteilung (rot) der unbekannten AuNP-Probe und der angewendeten linearen Kalibrierfunktion (gepunktete Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Komponente		CAS-Nr.	Gewicht (%)
Wasser		7732-18-5	88.8
9-Octadecenoic acid (Z)-, Verbindung mit 2,2',2''-Nitrilotris[Ethanol](1:1)		2717-15-9	3.8
Natriumcarbonat		497-19-8	2.7
Alkohole, C12-14-sekundär, ethoxyliert		84133-50-6	1.8
Tetranatrium EDTA		64-02-8	1.4
Polyethylenglykol		25322-68-3	0.9
Natriumoleat		143-19-1	0.5
Natriumbicarbonat		144-55-8	0.1

Tabelle 1: Liste der Bestandteile des Tensidgemisches, das zur Herstellung des Eluentenverwendeters verwendet wird (siehe auch Werkstofftabelle).

AF4-UV-vis Parameter	Einheit	Wert
Abstandsstärke	Μm	350
Detektordurchfluss	mL min-1	0.5
Kreuzdurchflussrate	mL min-1	0 (konstant für 8 min)
Fokusdurchflussrate	mL min-1	0
Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit	Min	0
Injektionsdurchfluss	mL min-1	0.5
Übergangszeit	Min	0
Injektionszeit	Min	0.1
Elutionsschritt	Min	8
Spülen Sie Schrittzeit	Min	0.1
Spülen Schritt durchflussrate	mL min-1	0.1
Injektionsvolumen	Μl	10
Probenkonzentration	mg L-1	12.5
Membrantyp		Regenerierte Cellulose
Membran-Molekulargewichts-Cut-off	kDa	10
Eluent		0,025% (v/v) Tensidmischung
UV-vis Wellenlänge	Nm	532
UV-Vis-Empfindlichkeit	-	0.001

Tabelle 2: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode zur Durchführung des Direkteinspritzlaufs ohne Anwendung einer Trennkraft.

AF4-UV-vis Parameter	Einheit	Wert
Abstandsstärke	Μm	350
Detektordurchfluss	mL min-1	0.5
Kreuzdurchflussrate	mL min-1	1 (60 min konstant, 10 min linear)
Fokusdurchflussrate	mL min-1	1.3
Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit	Min	2
Injektionsdurchfluss	mL min-1	0.2
Übergangszeit	Min	0.2
Injektionszeit	Min	5
Elutionsschritt	Min	70 (60 min konstant, 10 min linear)
Spülschritt	Min	9
Spülen Schritt durchflussrate	mL min-1	0.5
Injektionsvolumen	Μl	50
Probenkonzentration	mg L-1	12.5
Membrantyp		Regenerierte Cellulose
Membran-Molekulargewichts-Cut-off	kDa	10
Eluent		0,025% (v/v) Tensidmischung
UV-vis Wellenlänge	Nm	532
UV-Vis-Empfindlichkeit	-	0.001

Tabelle 3: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode, um den Fraktionierungslauf unter Anwendung eines Querflusses als Trennkraft durchzuführen.

Kalibrierstandard	Verschlussmittel	Mittlere Größe (TEM) (nm)	Lebenslauf (mittlere Größe TEM) (%)	Zeta-Potenzial (mV)	SD (Zetapotential) (mV)	Hydrodynamischer Radius (DLS) (nm)	SD (hydrodynamischer Radius) (nm)	Pdi	SD (PDI)
AuNP 20 nm	Citrat	20.1	≤ 8	-48.9	1.5	10.95	0.12	0.082	0.009
AuNP 40 nm	Citrat	40.8	≤ 8	-30.4	1.0	20.30	0.13	0.127	0.006
AuNP 80 nm	Citrat	79.2	≤ 8	-51.5	1.3	38.85	0.23	0.138	0.013
AuNP 100 nm	Citrat	102.2	≤ 8	-50.9	0.9	52.30	0.37	0.078	0.009

Tabelle 4: Zusammenfassung der physikalisch-chemischen Parameter der angewandten AuNP-Kalibrierstandards, einschließlich Verschlussmittel, TEM-Mittelgröße, Zeta-Potenzial, das in der nativen Suspension bestimmt wird, sowie des hydrodynamischen DLS-Radius und des im Eluent ermittelten Polydispersitätsindex (PDI).

Kalibrierstandard	Ausführen	Retentionszeit bei Maximaler Höchstgeschwindigkeit (min)	Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)	Durchschnittliche Netto-Einbehaltungszeit (min)	SD (%) (Netto-Aufbewahrungszeit)	SD (min) (Netto-Aufbewahrungszeit)
AuNP 20 nm	1	17.368	11.468	11.56	1.02	0.12
	2	17.409	11.509
	3	17.589	11.689
AuNP 40 nm	1	25.316	19.416	19.49	0.68	0.13
	2	25.32	19.42
	3	25.548	19.648
AuNP 80 nm	1	42.095	36.195	36.29	0.23	0.08
	2	42.219	36.319
	3	42.257	36.357
AuNP 100 nm	1	50.975	45.075	45.06	0.07	0.03
	2	50.924	45.024
	3	50.986	45.086

Tabelle 5: Retentionszeiten der AuNP-Kalibrierstandards am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum abgeleitet aus den jeweiligen AF4-UV-vis Fraktogrammen nach dem in Tabelle 3beschriebenen Verfahren.

Aliquote	Ausführen	Haltezeit maximum (min)	Durchschnittliche Retentionszeit bei Höchstgeschwindigkeit (min)	Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)	SD (%) Aufbewahrungszeit	Hydrodynamischer Radius (nm)	Erholung (%)
1	1	32.689	32.70	26.789	0.07	29.03	85.34
	2	32.687		26.787
	3	32.719		26.819
2	1	32.989	33.08	27.089	0.37	29.49	81.73
	2	33.073		27.173
	3	33.187		27.287
3	1	33.053	33.14	27.153	0.49	29.56	82.14
	2	33.071		27.171
	3	33.291		27.391

Tabelle 6: Zusammenfassung der Retentionszeiten am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, des hydrodynamischen Radius, der aus der externen Größenkalibrierung berechnet wird (Abbildung 2) und der Rückgewinnungsrate der unbekannten AuNP-Probe aus der AF4-UV-vis-Analyse.

Diskussion

Die hydrodynamische Größe eines unbekannten AuNP wurde von AF4 genau bewertet, gekoppelt mit einem UV-Vis-Detektor mit genau definierten AuNP-Größenstandards von 20 nm bis 100 nm. Die entwickelte AF4-Methode wurde mit einem konstanten Cross-Flow-Profil optimiert, um eine lineare Beziehung zwischen gemessener Retentionszeit und AuNP-Größe herzustellen und so eine einfache Größenbestimmung aus der linearen Regressionsanalyse zu ermöglichen. Besonderes Augenmerk lag auch auf die Erreichung ausreichend hoher Rückgewinnungsraten, die auf keinen signifikanten Probenverlust während der Fraktionierung hindeuten, und darauf, dass die entwickelte AF4-Methode, einschließlich des angewendeten Eluenten und der Membran, gut mit allen fraktionierten AuNP-Proben übereinstimmte.

Die Methodenentwicklung ist wohl der wichtigste Schritt in AF4 und mehrere Parameter, einschließlich Kanalabmessungen, Strömungsparameter sowie Eluent, Membran, Abstandshöhe und sogar Probeneigenschaften müssen berücksichtigt werden, um die Fraktionierung innerhalb eines gegebenen Elutionszeitfensters zu verbessern. Der Zweck dieses Absatzes besteht darin, den Leser durch die kritischen Schritte zu führen, die optimiert wurden, um die Größe des unbekannten AuNP-Beispiels, das hier beschrieben wird, erfolgreich zu bestimmen. Für eine detailliertere Beschreibung der allgemeinen Entwicklung einer AF4-Methode wird der Leser auf den AF4-Abschnitt "ISO/TS21362:2018 - Nanotechnologien - Analyse von Nanoobjekten mit asymmetrischer Durchfluss- und Zentrifugalfeldflussfraktionierung"²⁵verwiesen. Bei einem genaueren Blick auf die in Tabelle 3angegebenen angewandten Fraktionierungsbedingungen ist der erste kritische Schritt die Einführung und Entspannung der AuNP-Probe im AF4-Kanal. Dieser Schritt wird durch den Einspritzfluss, den Fokusfluss und den Querfluss gesteuert, deren Zusammenspiel die Probe zwingt, sich in der Nähe der Membranoberfläche zu lokalisieren und sie in einem schmalen Band in der Nähe des Injektionsports des AF4-Kanals zu konzentrieren, der im Grunde den Startpunkt der Fraktionierung definiert. Eine ausreichende Lockerung der Probe ist obligatorisch, da in diesem Schritt Probenbestandteile unterschiedlicher Größe in unterschiedlichen Höhen des AF4-Kanals lokalisieren und so die Grundlage für eine erfolgreiche Größenfraktionierung schaffen. Unvollständige Probenentspannung ist in der Regel durch eine erhöhte Hohlraumspitzenfläche sichtbar, die aus nicht zurückgehaltenen (d. h. nicht entspannten) Probenbestandteilen resultiert. Dieser Effekt kann durch eine Erhöhung der Injektionszeit und/oder der angewendeten Durchflussrate gemildert werden. Beide Parameter müssen jedoch sorgfältig optimiert werden, insbesondere für Proben, die anfällig für Agglomeration und Adsorption auf die AF4-Membran sind und durch die jeweiligen Rückgewinnungsraten für verschiedene Parametereinstellungen^36,37überwacht werden können. Die angewendete Injektionszeit von 5 min zusammen mit einer Kreuzdurchflussrate von 1,0^{ml-min -1} ergab Rückgewinnungsraten >80% für alle AuNP-Proben und eine vernachlässigbare Hohlraumspitzenfläche, die nahezu optimale Entspannungsbedingungen anzeigt. Nach ausreichender Entspannung der AuNP-Probe wurde der Fokusstrom gestoppt und der Probentransport entlang der AF4-Kanallänge zum jeweiligen UV-Vis-Detektor eingeleitet, der den zweiten kritischen Schritt darstellt. Um eine ausreichend hohe Fraktionierungsleistung zu angemessenen Analysezeiten zu gewährleisten, wurde eine konstante Durchflussrate von 1,0 ml-min^-1 für 30–50 min (abhängig vom jeweiligen fraktionierten AuNP-Größenstandard) gefolgt von einem 10 min linearen Querdurchflusszerfall bei einer Detektordurchflussrate von 0,5 ml.min^-1 angewendet. Die Verwendung eines konstanten Cross-Flow-Profils über die Trennung aller AuNP-Größenstandards ergab eine lineare Beziehung zwischen Retentionszeit und AuNP-Größe nach FFF-Theorie²², wodurch die Größenbestimmung der unbekannten AuNP-Probe durch einfache lineare Regressionsanalyse ermöglicht wurde. Allerdings wurden andere Profile als ein konstanter Querfluss auch für die Dimensionierung von Nanopartikeln genutzt, was letztlich zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Retentionszeit und Partikelgröße^38,39führt. Darüber hinaus ist die Größenbestimmung in AF4 mit genau definierten Größenstandards nicht auf AuNP beschränkt, sondern kann auch auf Nanopartikel mit anderen Größen und Elementarzusammensetzungen (z.B. Silber^38,40 oder Kieselsäure-Nanopartikel^41,42)angewendet werden. Darüber hinaus ist ICP-MS bei der Arbeit mit verdünnten Proben ein hochempfindlicher Elementardetektor, der mit AF4 gekoppelt werden kann, was die Vielseitigkeit dieses analytischen Ansatzes zur Dimensionierung einer Vielzahl von Nanopartikeln in Suspensionen ergänzt.

Trotz seiner weit verbreiteten Anwendung hat die externe Größenkalibrierung mit genau definierten Größenstandards in AF4 einige Besonderheiten, die bei der Verwendung für die genaue Dimensionierung unbekannter Proben berücksichtigt werden müssen. Zunächst beruht sie in hohem Maße auf der Anwendung vergleichbarer Bedingungen bei der Fraktionierung der jeweiligen Größennormen und der tatsächlichen Stichprobe. In dem hier dargestellten Fall ist es daher zwingend erforderlich, dass sowohl die AuNP-Größenstandards als auch die unbekannte AuNP-Probe nach der gleichen AF4-Methode sowie das gleiche Eluent und dieselbe Membran fraktioniert werden, was diesen Ansatz ziemlich unflexibel macht. Da keine größenempfindlichen Detektoren, z. B. Lichtstreuung (MALS und DLS), zur Hand sind, ist es zudem schwierig festzustellen, ob eine entsprechende AF4-Methode mit Größenstandards ausreichend gut funktioniert oder nicht. Dies gilt insbesondere für unbekannte Proben, die sehr große Größenverteilungen aufweisen, wobei unklar bleibt, ob alle Probenbestandteile dem normalen Elutionsmuster folgen: Fraktionierung von kleineren zu größeren Partikeln, oder ob größere Probenbestandteile bereits im sterisch-hyperlayer-Modus leuchten, wodurch potenziell mit kleineren Probenbestandteilen^43,44ko-eluiert werden. Auch wenn die FFF-Theorie betont, dass AF4-Trennungen allein aufgrund von Unterschieden in der hydrodynamischen Größe mit Teilchen, die als Punktmassen betrachtet werden, ohne Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung^22,eine andere Geschichte mit Partikel-Partikel- und Partikel-Membran-Wechselwirkungen (wie elektrostatische Anziehung/Abstoßung oder Van-der-Waals-Attraktion) spielen können und möglicherweise eine messbare Verzerrung in Größenbestimmung über externe Größenkalibrierung^45,46einführen. Es wird daher empfohlen, Größennormen zu verwenden, die ideal auf die Zusammensetzung und die Oberflächeneigenschaften (Zeta-Potenzial) des Teilchens^40,42 oder, wenn diese nicht verfügbar sind, zumindest gut charakterisierte Partikelgrößenstandards (z. B. Polystyrollatexpartikel) zu verwenden und ihre Vergleichbarkeit mit dem Teilchen von Interesse insbesondere hinsichtlich ihres Oberflächen-Zeta-Potenzials in der jeweiligen Umgebung, in dem die Analyse durchgeführt werden soll, sorgfältig zu bewerten^41,47.

Die Vielseitigkeit von AF4 wird oft als seine größte Stärke angesehen, da es einen Anwendungsbereich bietet, der über die meisten anderen gängigen Größentechniken in diesem Bereich hinausgeht^22,48,49. Gleichzeitig kann es aufgrund seiner damit verbundenen mutmaßlichen Komplexität auch als sein wichtigster Nachteil angesehen werden, insbesondere gegen schnelle und vorgeblich einfach zu bedienende Größentechniken wie DLS, Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Single-Partikel-ICP-MS. Wenn man AF4 jedoch mit diesen populären Größentechniken relativiert, wird deutlich, dass alle Techniken ihre Vor- und Nachteile haben, aber alle tragen zu einem umfassenderen Verständnis der physikalisch-chemischen Natur von Nanopartikeln bei und sollten daher als komplementär und nicht als wettbewerbsfähig betrachtet werden.

Das hier vorgestellte Standard-Betriebsverfahren (SOP) unterstreicht die hervorragende Anwendbarkeit von AF4-UV-vis mit externer Größenkalibrierung für die Dimensionierung einer unbekannten AuNP-Probe in Suspension und wurde schließlich als empfohlene Richtlinie für die AF4-Analyse einer unbekannten AuNP-Probe im Rahmen eines internationalen Laborvergleichs (ILC) angewendet, der im Rahmen des Horizon 2020-Projekts ACEnano durchgeführt wurde (das Ergebnis dieser ILC wird Gegenstand einer zukünftigen Veröffentlichung sein). Dieses Protokoll ergänzt somit die ermutigenden und laufenden internationalen Bemühungen zur Validierung und Standardisierung der AF4-Methoden^25,50,51,52 und unterstreicht das vielversprechende Potenzial von AF4 auf dem Gebiet der Nanopartikelcharakterisierung.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF)	Postnova Analytics GmbH	Z-FIL-TEF-002	Used for filtration of aqueous solutions
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)	Merck Millipore	Durapore Millex	Used for filtration of NovaChem100
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL)	Eppendorf AG	Research Plus	Used to prepare diluted AuNP suspensions
AF4 cartridge	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF - AF4 Analytical Channel	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)	Postnova Analytics GmbH	Z-AF4-MEM-612-10KD	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Analytical Balance (0.1 mg precision)	Sartorius	ENTRIS124I-1S	Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution
Autosampler	Postnova Analytics GmbH	PN5300	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Channel Oven	Postnova Analytics GmbH	PN4020	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Crossflow Module	Postnova Analytics GmbH	AF2000 MF Control Module	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Disposable Pipette Tips (1000 µL)	Eppendorf AG	ep T.I.P.S	Used to prepare diluted AuNP suspensions
Flasks (e.g. 2 liter volume)	neoLab	1-0199	Used for eluent storage
Focus Pump	Postnova Analytics GmbH	PN1131	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)	Postnova Analytics GmbH	VIA-002	Used for sample storage
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)	Postnova Analytics GmbH	NovaCal Gold	50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function
Magnetic Stirrer	IKA	VIBRAX-VXR	Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW
Personal Computer (PC)	Dell Technologies	/	Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)	/	/	In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)	Postnova Analytics GmbH	Z-VIA-09150868	Used for sample storage
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting Grade	Carl Roth GmbH & Co KG	2326.1	Used for the preparation of the cleaning solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.a	Carl Roth GmbH & Co KG	6771.1	Used for the preparation of the cleaning solution
Software Package for Control and Data Acquisition	Postnova Analytics GmbH	NovaFFF AF2000 Software	Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Software Package for Data Evaluation	Postnova Analytics GmbH	NovaAnalysis Software	Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual
Software Package for final Data Processing	OriginLab Corporation	Origin 2019	Used for final data processing
Solvent Degasser	Postnova Analytics GmbH	PN7520	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Selector	Postnova Analytics GmbH	PN7310	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent Organizer	Postnova Analytics GmbH	PN7140	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Surfactant Mixture	Postnova Analytics GmbH	NovaChem100	Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation
Tip Pump	Postnova Analytics GmbH	PN1130	Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Unknown AuNP sample	BBI Solutions	EM.GC60	60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function
UV-vis Detector	Postnova Analytics GmbH	PN3211	UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system
Vacuum Filtration Unit	Postnova Analytics GmbH	Eluent Filtration System	Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions
Vortex	IKA	Vortex Genie 2	Used for homogenization of diluted AuNP suspensions
Water Purification System	Merck Millipore	Milli-Q Integral 5	Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions