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요약

이 프로토콜은 알 수 없는 금 나노입자 샘플의 크기를 측정하기 위한 UV-vis 검출과 결합된 비대칭 유동 필드-흐름 분획의 사용을 설명합니다.

초록

입자 크기는 틀림없이 나노 입자의 개념과 관련된 가장 중요한 물리 화학 파라미터입니다. 나노 입자의 크기와 크기 분포에 대한 정확한 지식은 다양한 응용 분야에서 가장 중요합니다. 크기 범위는 나노 입자 용량의 가장 "활성"구성 요소를 정의하기 때문에 중요합니다.

비대칭 유동 필드-흐름 분획(AF4)은 약 1-1000 nm의 크기 범위에서 현탁액의 입자 크기를 조정하는 강력한 기술입니다. AF4 실험에서 크기 정보를 파생하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 다각광 산란 또는 다이나믹 라이트 산란의 원리에 따라 크기에 민감한 검출기와 온라인으로 AF4를 결합하는 것 외에도, 잘 확립된 이론적 접근법(FFF 이론)을 사용하여 시료의 크기를 보존 시간과 상관연관하거나 잘 정의된 입자 크기 표준(외부 크기 교정)의 보존 시간과 비교할 가능성도 있다.

여기서는 20-100 nm 크기의 크기 범위에서 금 나노 입자 표준과 외부 크기 교정을 사용하여 UV-vis 검출과 결합된 AF4에 의한 알 수 없는 금 나노 입자 샘플의 크기 조정을 위한 표준 작동 절차(SOP)의 개발 및 사내 검증을 설명합니다. 이 절차는 샘플 준비, AF4 계측기 설정 및 검증, AF4 방법 개발 및 알 수없는 금 나노 입자 샘플의 분획을 포함한 개발 된 워크플로우에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 확립 된 외부 크기 교정과 얻은 결과의 상관 관계를 제공합니다. 여기서 설명된 SOP는 결국 서스펜션에서 나노 미립자 시료의 크기 조정을 위한 AF4의 우수한 견고성과 신뢰성을 강조하는 실험실 간 비교 연구의 프레임에서 성공적으로 검증되었습니다.

서문

콜로이드 금 형태의 금 나노 입자 (AuNP)는 나노 입자가 무엇인지 에 대한 이해가 있기 오래 전에 인간 문화의 일부였으며 나노 입자라는 용어가 현대적이고 과학적인 어휘로 들어가는 것을 발견했습니다. 그들의 나노 규모 외관에 대한 뚜렷한 지식없이, 중단 AuNP는 이미 V-VI 세기 기원전1에서고대 중국, 아라비아, 인도에서 의료 및 기타 목적을 위해 사용되었으며, 또한 고대 로마인들은 대영 박물관2에서리커거스 컵 전시회에서 도자기를 얼룩지게하기 위해 루비 붉은 색을 이용했습니다. 서구 세계에서, 현대 시대에 중세시대까지 수세기 동안, AuNP는 주로 유리와 에나멜 (카시우스의 보라색) 3색광제로서 사용되었을 뿐만 아니라 다양한 질병(Potable Gold), 특히 매독4를치료하기 위해 사용되었다.

그러나, 이러한 모든 연구는 주로 일시 중단 AuNP의 응용 프로그램에 초점을 맞춘 했다 그리고 그것은 그들의 형성을 조사 하는 첫 번째 합리적인 접근 방식을 소개 하는 1857 년에 마이클 패라데이까지 했다, 그들의 특성 뿐만 아니라 그들의 속성5. 패라데이는 이러한 AuNP가 매우 미세한 치수를 가져야한다는 것을 이미 알고 있었지만, 크기 분포에 대한 명시적 정보에 액세스 할 때 전자 현미경 검사가 개발될때까지는 6,7,결국 크기와 다른 AuNP 속성 사이의 상관 관계를 가능하게했습니다.

요즘, 그들의 매우 쉽고 간단한 합성 덕분에, 놀라운 광학 특성 (표면 플라스몬 공명), 좋은 화학 적 안정성과 따라서 사소한 독성뿐만 아니라 사용 가능한 크기와 표면 수정의 측면에서 자신의 높은 다기능성, AuNP는 나노 전자8,진단9,암 치료10,또는 약물 전달11등의 분야에서 광범위한 응용 프로그램을 발견했다. 이러한 응용 분야에서 적용된 AuNP의 크기와 크기 분포에 대한 정확한 지식은 최적의효능(12)을 보장하기 위한 기본 전제 조건이며 이 중요한 물리 화학 파라미터를 결정하기 위한 견고하고 신뢰할 수 있는 도구에 대한 상당한 수요가 있습니다. 오늘날, AuNP를 현탁액으로 조정할 수 있는 분석 기술이 많고, 예를 들어, UV-vis 분광기(UV-vis)(13),동적 광 산란(DLS)14 또는 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분광법(spICP-MS)15 필드-유량 분별(FFF)이 이 분야의 핵심 플레이어인16,17,18,19,20.

1966년 J. Calvin Giddings21에의해 처음 개념화된 FFF는 고정단계22,23이없는 얇고 리본같은 채널 내에서 분리가 이루어지는 용출 기반 분획 기술의 제품군으로 구성된다. FFF에서, 분리는 샘플이 일반적으로 각각의 인라인 검출기로 하류로 이송되는 라미나르 채널 흐름의 방향에 수직으로 작용하는 외부 힘 필드와의 샘플의 상호 작용에 의해 유도된다. 이러한 관련 FFF-기술 중, 두 번째 흐름(cross flow)이 포스 필드역할을 하는 비대칭 유동 필드-흐름 분획(AF4)은 가장 널리 사용되는 하위유형(24)이되었다. AF4에서, 채널 바닥(축적 벽)에는 시료를 유지하면서 동시에 교차 흐름이 멤브레인을 통과하고 추가 콘센트를 통해 채널을 떠날 수 있는 반응과성 초여과 멤브레인이 장착되어 있습니다. 이를 통해, 교차 흐름은 시료를 축적 벽쪽으로 밀어 확산 유도플럭스(Brownian motion)에 대응할 수 있다. 필드 및 확산 유도 플럭스의 결과 평형에서; 더 높은 확산 계수를 나타내는 작은 샘플 성분은 채널 센터에 더 가깝게 정렬되며 더 큰 샘플 성분은 낮은 확산 계수를 나타내는 축적 벽에 더 가깝게 위치합니다. 따라서 채널 내부의 포물선 흐름 프로파일로 인해 더 작은 샘플 성분은 더 큰 샘플 성분보다 앞서 채널 흐름의 빠른 라미네로 이송됩니다. FFF 보존 파라미터및 스토크스-아인슈타인 확산 계수 방정식을 사용하여, 용출 시간 및 각각 용출 부피, AF4 샘플의 유체역학 적 크기22로직접 변환될 수 있다. 여기서 설명된 용출 거동은 정상 용출 모드를 말하며 일반적으로 약 1-500 nm(입자 특성 및 분획 파라미터에 따라 2000nm까지) 사이의 입자 크기 범위 내에서 AF4에 유효하지만 steric-hyperlayer 용출은 일반적으로 이 크기 임계값25이상으로 발생합니다.

FFF에 의해 분리 된 후 크기 정보를 파생하는 세 가지 일반적인 방법이 있습니다. FFF는 모듈식 기기이기 때문에, 다각광 산란(MALS)26,27,다이나믹 라이트 산란(DLS)28,29,또는 둘 다의 조합에 기초하여 크기에 민감한 광 산란 검출기와 같은 다중 검출기와 다운스트림을 결합하여 추가 형상 정보를 얻을 수있다 30,31. 그러나, FFF 채널내 시료의 보존 거동은 일반적으로 잘 정의된 물리적 힘에 의해 제어되기 때문에, 간단한 농도 검출기(예를 들어, UV-vis 검출기)가 용출시32,33의존재를 나타내기에 충분한 수학적 접근법(FFF 이론)을 사용하여 크기를 계산할 수 있다.

세 번째 옵션으로, 우리는 UV-vis검출과결합된 AF4를 사용하여 서스펜션에서 알 수 없는 금 나노입자 샘플의 크기 조정을 위해 20-100 nm의 크기 범위에서 잘 정의된 AuNP 표준을 사용하여 외부 크기 보정34,35의 적용을 보고합니다. 이 간단한 실험 설정은 가능한 한 많은 실험실이 국제 실험실 간 비교 (ILC)에 가입 할 수 있도록 의도적으로 선택되었으며, 나중에 여기에 제시 된 프로토콜에 따라 유럽 연합 호라이즌 2020 프로젝트 ACEnano의 프레임에서 수행되었습니다.

프로토콜

1. AF4 시스템 설정

  1. AF4 카트리지를 조립하고 제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 AF4 시스템과 UV-vis 검출기(재료테이블)의모든 하드웨어 구성 요소를 연결합니다.
  2. 제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 제어, 데이터 수집, 처리 및 평가를 위해 필요한 모든 소프트웨어 패키지를 설치합니다.
  3. AF4 시스템과 UV-vis 검출기 간의 필요한 모든 신호 연결이 확립되었는지 확인합니다.
  4. 15분 동안 초순수(UPW)로 설정을 플러시하여 기존 AF4-UV-vis 연결이 단단하고 누수 없이 있는지 확인하십시오(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1),교차 유량 1.5mL(@min-1). 이렇게 하려면 AF4 제어 소프트웨어를 열고 방문 페이지의 오른쪽 상단에 있는 각 패널에 유량체를 입력합니다. 필요한 경우 각 커넥터(피팅)를 조이고 누출이 관찰되지 않으면 절차를 반복합니다.
    참고: 모든 측정 중 내부 시스템 압력을 모니터링해야 하며 4~12bar 이내여야 합니다. 압력이 높거나 낮을 경우, 압력 튜브를 조정해야합니다. 또한 전체 측정 시간에 걸쳐 채널 압력 추세가 일정해야 합니다.
    참고: 채널 오븐을 사용할 수 있는 경우 온도를 25°C로 설정하여 모든 AF4 실험에서 유사한 측정 조건을 보장합니다.

2. AF4-UV-vis 시스템 자격 및 샘플 분석을 위한 솔루션 및 서스펜션 준비

  1. 청소 솔루션
    1. 수산화나트륨 8g과 도데킬 황산나트륨 2g을 UPW 1L에 넣고 총 용해될 때까지 용액을 저어줍니다.
  2. 용인성
    1. 여과된 계면활성제 혼합물 500μL을 여과 및 탈가UPW 2L에 추가하여 용출(0.025%(v/v), pH 약 9.4)를 얻습니다.
      참고: 계면활성제 혼합물의 화합물에 대한 자세한 설명은 표 1(또한 재료 표)에제공됩니다.
  3. 질량 복구 측정을 위한 임의 AuNP 크기 표준
    1. 소용돌이 임의 AuNP 크기 표준 (50 mg∙L-1)2 분 동안 그것을 희석 1:4 UPW와 함께 12.5 mg∙L-1의최종 질량 농도를 얻을 수 있습니다. 희석 후 추가 2분 동안 소용돌이가 얻어진 서스펜션을 균질화한다.
      주의: 화학 물질, 특히 NaOH 펠릿으로 작업할 때 필요한 예방 조치와 적절한 보호 장비가 필요합니다.
      참고: 일반적으로 AF4-UV-vis 실험 중 낮은 입자 배경을 보장하기 위해 0.1 μm 멤브레인 필터(친수성 PVDF 또는 이와 유사한)를 사용하여 필요한 모든 솔루션(세척 용액 제외)을 탈가스 및 필터링하는 것이 좋습니다. 전용 진공 여과 장치 또는 주사기 필터를 사용하여 이를 만들 수 있습니다.

3. AF4-UV-vis 시스템 자격

  1. 1.4단계에서 설명된 소프트웨어 설정을 사용하여 30분 동안 세척 용액으로 시스템을 플러시합니다(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1,교차 유량 1.5mL+min-1).
  2. 각각의 용액 병을 변경하고 UPW로 시스템을 20분 동안 플러시합니다(팁 유량 1mL(@min-1),초점 유량 1mL(@min-1,크로스 유량 1.5mL+min-1).
  3. 각각의 인라인 펌프 필터를 교체합니다.
  4. AF4 카트리지를 열고 AF4 멤브레인을 교체합니다. AF4 카트리지를 다시 조립하고 AF4-UV-vis 시스템과 다시 연결합니다.
  5. 멤브레인을 평형화하고 시스템을 안정화하기 위해 청소된 AF4-UV-vis 시스템을 최소 30분 동안 용액으로 플러시하여 시스템을 안정화시킵니다(팁 유량 1mL(@min-1,초점 유량 1mL(@min-1,및 크로스 유량 1.5mL+min-1). 잠재적인 누출을 다시 확인합니다(1.4단계 참조).
  6. 임의AuNP 크기 표준을 사용하여 대량 회수 및 보존 시간의 변동을 결정하여 AF4-UV-vis 시스템을 검증합니다.
    1. 분리력을 적용하지 않고 직접 사출 실행을 수행합니다.
      1. 파일을 열어 새 측정 파일 만들기 | 새로운 | AF4 제어 소프트웨어에서 실행합니다.
      2. 실행 탭 내에서 샘플 및 측정 설명과 사출 볼륨 및 샘플 이름을 정의합니다. 측정 조건은 표 2에표시됩니다.
      3. 표 2에따라 두 번째 탭 FFF 메서드에서 측정 매개 변수를 설정합니다.
      4. 실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.
    2. 분리력(크로스 흐름)을 적용하여 분획 실행을 수행합니다.
      1. 표 3에 지정된 분수 조건을 사용하여 이전 섹션에 설명된 대로 분수 메서드를 정의합니다.
      2. 실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.
      3. 네 배에서 측정을 수행합니다.
        참고: 첫 번째 실행은 시스템(즉, AF4 멤브레인)을 컨디셔닝하는 것을 목표로 하며 시스템 자격 결과의 최종 평가에서 제외됩니다.
        참고: 파일을 열어 생성된 모든 실행 파일을 저장하는 것이 좋습니다| AF4 제어 소프트웨어에 저장합니다.
      4. AF4-UV-vis-system은 임의AuNP 크기 표준에 대해 >80%의 대량 회수 및 보유 시간 및 2%의 변형을 얻을 경우 자격을 갖춘 것으로 간주합니다.
      5. 자동 샘플러를 사출 시스템으로 사용하는 경우, 최적의 주행 조건을 보장하기 위해 AF4-UV-vis 시스템(예: 청소 용액, UPW 또는 각각용염)을 통해 펌핑되는 동일한 솔루션으로 자동 샘플러의 바늘 세척 저수지 병을 채웁니다. 용광을 변경할 때, 일반적으로 기준선이 일정한 수준에서 안정적으로 유지될 때까지 UV-vis-detector 신호를 모니터링하여 AF4 시스템의 재평을 따르는 것이 좋습니다.

4. AF4-UV-vis 샘플 분석

  1. 각각의 AuNP 서스펜션(20nm, 40nm, 80nm, 100nm, 각 50 mg)을 소용돌이시켜 외부 크기 교정을 위한 모든 AuNP 크기 표준을 준비한다. L-1)2 분 동안 12.5 mg의 mg∙L-1의최종 질량 농도를 얻기 위해 UPW로 1:4를 희석한다. 희석 후 추가 2분 동안 소용돌이가 얻어진 서스펜션을 균질화한다.
  2. 4.1 단계에서 설명된 교정 표준과 동일한 절차를 적용하는 분석을 위해 알 수 없는 AuNP 샘플을 준비한다.
  3. 표 2에표시된 AF4 방법을 사용하여 모든 AuNP 크기 표준의 직접 사출 측정을 수행한다.
    1. 이렇게 하려면 표 2에 요약된 각 값을 적절한 위치에서 제조업체의 소프트웨어에 입력하여 분리 및 샘플 매개 변수를 정의하고 실행 버튼을 눌러 실험을 시작합니다.
  4. 표 3에 표시된 AF4 방법을 사용하여 각 AuNP 크기 표준을 개별적으로 분수하여 외부 크기 교정 기능을 설정합니다.
    1. 표 3에 요약된 각 값을 적절한 위치에서 제조업체의 소프트웨어에 입력합니다. 분획 방법은 초점 단계, 여러 용출 단계 및 헹도 단계에 의해 정의됩니다. 메서드를 설정한 후 실행 버튼을 눌러 실험을 시작합니다.
  5. 표 2에표시된 AF4 방법을 사용하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 직접 사출 측정을 수행한다.
  6. 표 3에나열된 AF4 방법을 수행하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 분획을 수행한다.
  7. 의미 있고 통계적으로 관련된 결과를 보장하기 위해 달리 명시되지 않는 한 3항과 4항에 언급된 모든 측정을 삼중측정을 수행합니다.
    1. 저장 50 mg∙L-1 AuNP 재고 현탁액을 사용하기 전에 4-8°C에 보관하십시오. 희석 된 AuNP 서스펜션은 신청 30 분 이내에 이상적으로 준비됩니다.
      참고 : 소용돌이는 일반적으로 충분하며 서스펜션의 초음파가 필요하지 않습니다.
    2. AuNP 크기 표준에 대해 얻어진 보존 시간과 알 수 없는 AuNP 샘플의 보존 시간의 상관관계를 가능하게 하기 위해 동일한 AF4 방법을 사용하여 모든 샘플을 측정합니다.
      참고: 일정하고 유효한 분리 조건을 보장하기 위해 정의된 수의 샘플 측정(예: 10측정)이 지나면 시스템 자격 섹션에 설명된 분수 단계를 포함/반복합니다( 예: 10측정). 또한 시스템 압력 및 UV-vis 검출기 기준선 안정성을 기록합니다. 그들은 완전한 AF4-UV-vis 실행을 따라 안정적이고 일정하게 유지해야합니다.
      참고: 일반적으로 UV-vis 검출기(또는 다중 각도 광 산란(MALS) 검출기(또는 사용 가능한 경우)가 복구, 시료 피크 형상 또는 반복성(또는 AF4-UV-vis-system)과 같은 향상된 노이즈 레벨 또는 정의된 시스템 자격 기준을 표시할 때 초여침 멤브레인을 교체한다(또는 AF4-UV-vis-system은 철저한 세척 절차를 거쳤다). 여기에 설명된 조건하에서, 자격을 갖춘 AF4-UV-vis 시스템은 일반적으로 동일한 멤브레인을 사용하여 적어도 50개의 측정에 대해 안정적입니다. 그러나, 정의된 품질 기준을 충족하는 가능한 연속 측정 횟수는 시료, 샘플 매트릭스 및 용액 조성에 따라 크게 달라질 수 있다.

5. 데이터 평가

  1. 제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(즉, UV-vis 피크 영역)를 내보낸 후 AF4-UV-vis 시스템 제조업체에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어 또는 스프레드시트 분석을 사용하여 대량 복구 계산을 수행합니다.
    1. 다음 방정식을 사용하여 분획 측정(A분별)및 직접 주입 측정(A직접 주입)의각각UV-vis 피크 아래 영역을 비교하여 AuNP 질량 회수를 계산합니다.
      figure-protocol-5675
      참고: 직접 주입 측정 중에 분리 력이 적용되지 않으므로 축적 벽이있는 해석 종의 잠재적 상호 작용을 무시할 수 있습니다. 각각의 UV-vis 피크 아래 영역은 샘플 내의 다른 종들이 분획 조건 ii하에서 다른 보존 시간에 흡수되지 않는다고 가정하여 맥주-램버트 법을 사용하여 AuNP 질량과 직접 상관관계가 있을 수 있다.
    2. 직접 주입 및 분별 실행 모두에서 얻은 dat. 파일을 가져옵니다.
    3. 개요 탭에서 UV-vis 검출기 추적을 선택합니다.
    4. 모든 측정에 대한 신호 및 기준보기에서 관심 영역(ROI)과 기준선을 정의합니다.
    5. 삽입을 통해 직접 사출 교정을 삽입합니다.
    6. 직접 사출 교정 설정 보기에서 모든 직접 사출 실행을 선택하고 UV 소멸 계수를 입력합니다.
      참고: 교정 및 분획 측정 모두에 동일한 UV-vis 소멸 계수를 사용하는 것이 중요합니다.
    7. ROVI 내의 UV-vis 신호 추적 하에 있는 영역을 이용하여 교정 라인을 설정하고 입력된 농도 및 사출 부피로부터 계산된 주입량을 설정한다. 획득된 교정은 별도의 직접 사출 교정 기능 창에 표시됩니다.
    8. 교정 함수를 각 분획 측정에 할당합니다.
      참고: 각 교정 크기 표준 및 알 수 없는 AuNP 샘플에 대해 AuNP의 크기에 종속된 UV-vis 흡광도로 인해 별도의 교정 기능을 수립해야 합니다. UV-vis 검출기의 이러한 단점은 ICP-MS와 같은 질량 감지기를 사용하여 회피할 수 있습니다.
    9. 정량적 결과 계산을 삽입하여 분석을 수행하고 결과는 농도 및 주입 된 양 값으로 오른쪽 테이블 내에 표시됩니다.
  2. 제조업체 매뉴얼에 명시된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(즉, 각각 UV-vis 피크 최대량 및 각 보이드 시간)의 내보내기 후 AF4 시스템 제조업체 또는 스프레드시트 분석에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어 또는 스프레드시트 분석을 사용하여 보존 시간의 변동을 계산합니다.
    1. 개요 창을 열어 가져온 모든 측정값에 대해 각각의 UV 추적을 표시합니다.
    2. 피크 감지는 자동으로 수행됩니다. 신호 처리 도구 상자 내에서 피크 검출 매개 변수를 조정하여 성능을 최적화합니다. 모든 측정 파일을 통과하여 각각의 피크 최대값을 추출합니다.
    3. 다음 방정식을 사용하여 모든 측정에 대한 상대표준 편차를 계산합니다.
      figure-protocol-7136
      계산은 각각의 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
  3. 제조업체 매뉴얼에 제공된 지침에 따라 각 데이터 수집 소프트웨어에서 필요한 모든 원시 데이터(UV-vis 피크 최대 분석 및 각 보이드 시간)를 내보낸 후 제조업체또는 스프레드시트 분석에서 제공하는 데이터 평가 소프트웨어를 사용하여 크기 측정을 수행합니다. 외부 크기 교정 기능은 이전에 수행된 DLS 측정에서 얻은 유체역학적 크기에 대해 AuNP 크기 표준(20nm, 40nm, 80nm, 100nm)의 보이드 시간 수정 된 보존 시간(순 보존 시간, 표 5참조)을 플로팅하여 확립될 수 있다(표 4참조).
    참고: DLS 측정은 유사한 샘플 특성을 보장하기 위해 각각의 분획 측정과 동일한 날에 이상적으로 수행되어야 합니다.
    1. .dat 파일을 가져온 후 모든 측정값이 개요 탭에 표시됩니다. 오버레이 창 아래에 표시되는 검출기 목록에서 UV-vis 검출기 신호를 선택합니다. 신호 및 기준선 뷰에서 조정할 수 있는 각 측정에 대해 ROI 및 기준선을 정의합니다. 오른쪽의 신호 처리 도구 상자를 사용하여 시끄러운 신호를 부드럽게 합니다. 다른 실행 함수에 할당 처리 매개 변수를 사용하여 매개 변수를 각각 다른 측정에 할당할 수 있습니다.
    2. 삽입 탭에서 파티클 크기 보정을 선택합니다.
    3. 오른쪽 상단의 교정 테이블에 대한 참조 선택에서 각 측정값을 클릭하여 모든 교정 실행을 선택합니다. 선택한 모든 측정값은 아래 표에 표시됩니다. 표 4에지정된 모든 교정 측정에 대한 유체 역학 반지름을 입력합니다. 함수는 파티클 크기 보정에 표시됩니다 – 함수 창과 방정식도 표시됩니다.
      참고: 설정된 크기 교정함수의 상관 계수(R2)는 ≥0.990이어야 한다.
    4. 할당에 대한 실행 선택 목록 내에서 각각의 분획을 선택하여 알 수 없는 AuNP 샘플의 측정에 교정 함수를 할당합니다.
    5. 삽입 탭 내에서 파티클 크기 분포 계산을 열어 결과를 표시합니다. 이전에 생성된 파티클 크기 보정은 오른쪽 창 설정에표시되는 알 수 없는 AuNP 샘플 측정에 대한 교정으로 나열됩니다. 계산된 크기는 최대값으로 레이블이 지정된 크기 분포 창에 표시됩니다. 샘플 확인란의 평균 신호를 선택하여 한 샘플의 모든 측정값을 평균화하고 결과를 최대 최대 레이블로 나열합니다.
    6. 또한 교정 곡선 확인란 표시를 선택하여 교정 선을 프랙토그램 위에 플롯합니다. 누적 크기 분포는 누적 배포 확인란 표시를 선택하여 사용할 수 있습니다.
      참고: 데이터 평가를 위해 제조업체의 소프트웨어를 사용하는 경우 삽입 탭 내부의 보고서를 클릭하여 생성할 수 있는 모든 결과를 보고서에 추가하는 것이 좋습니다. 보고서 단추는 모든 결과, 테이블 및 다이어그램을 문서에 추가합니다. 보고서 탭에서 문서 섹션 내에서 보고서 설정을 열어 보고서 설정을 변경할 수 있습니다.

결과

첫째, AuNP 크기 표준은 AF4에 의해 분획되고 532nm(AuNP의 표면 플라스몬 공명)에서 AuNP의 흡광도를 측정하는 UV-vis에 의해 검출되었다. 얻어진 프랙토그램의 오버레이는 도 1에제시된다. 삼중 측정에서 얻은 각 Uv-vis 피크 최대값에서 각 AuNP의 보존 시간은 표 5에나열됩니다. 모든 보존 시간의 상대적인 표준 편차는 크기가 증가함에 따라 측정 차이가 감소하면서 1.1% 미만이었습니다. 전반적으로, 우수한 반복성을 달성했다. 일정한 분리 력이 적용되어 용출 시간과 유체 역학 크기의 선형 관계가 발생했습니다. 외부 크기 보정 라인은 보이드 시간 보정 된 용출 시간 (순 보존 시간)에 대해 지정된 유체 역학 반경을 플로팅하여 설정되었습니다. 선형 회귀 분석 결과 인터셉트a =-3.373 nm ± 1.716 nm 및 슬로프 b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055 nm+min-1을가진 선형 교정 함수가 생성되었다. 용출의 선형 거동은 0.9958의 제곱 된 상관 계수 R2로 확인되었다. 각 교정 함수는 도 2에시각적으로 표시됩니다.

두 번째 부분은 알 수 없는 AuNP 샘플의 분석을 다루었습니다. 시료의 3개의 알리쿼트(aliquots)는 프로토콜섹션(섹션 4.2)에기재된 절차에 따라 제조되었다. 각각 3개의 알리쿼트들은 AuNP 크기 표준에도 적용된 동일한 AF4 분획 방법을 사용하여 삼중에서 조사되었다. 알 수 없는 AuNP 샘플에서 얻은 9개의 AF4-UV-vis fractograms는 모두 도 3에 제시되고 각각의 평가는 표 6에요약된다. 각 보존 시간의 상대적 표준 편차는 상당히 낮았으며 0.1 %에서 0.5 % 사이로 배열되었습니다. AuNP 크기 표준의 분획으로부터 얻은 입자 크기 보정 기능을 사용하여 UV-vis 피크 최대값에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 획득된 보존 시간과 상관관계가 있으며, 전체 평균 유체 역학 반경 29.4nm ± 0.2nm를 계산할 수 있다. 더욱이, 83.1%의 합리적인 질량 회수는 1.2%± AuNP 시료의 유의한 응집 또는 용해 또는 막 표면에 입자의 상당한 흡착을 나타내지 않는 것을 나타낸다. 도 4는 적용된 AF4 방법의 우수한 견고성을 강조하여 평균 9개의 UV-vis 신호 추적을 통해 얻어진 입자 크기 분포를 표시합니다.

figure-results-1468
그림 1: 정규화된 신호 강도로 4개의 개별 AuNP 크기 교정 표준의 삼중 분석에서 얻은 AF4-UV-vis fractograms및 지속적인 교차 유량(black line)을 적용하였다. 보이드 피크는 약 5.9분 에서 회색으로 강조 표시됩니다.

figure-results-1864
그림 2: 각 개별 AuNP 크기 교정 표준의 보존 시간에 대해 지정된 유체역학 반경을 플로팅한 후 각 DLS측정(표 4)과얻어진 AF4 보존 시간(표5)의각 표준 편차로부터 파생된 오차 바를 포함하는 외부 크기 교정 기능을 획득하였다. y =-3.373 nm ± 1.716 nm 및 b = 1.209 nm·민-1 ± 0.055 nm·min-1을 가진 y=a +bx 형태의 표준 오차가 있는 선형 교정 함수는 선형 회귀 분석에서 계산되었다. R2 = 0.9958과의 제곱 된 상관 관계 계수가 결정되어 선형 관계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2526
그림 3: AF4-UV-비스 프랙토그램의 삼중 측식 측정은 알 수 없는 AuNP를 표시하는 3개의 알리쿼트. 측정 시간 동안 적용된 상수 교차 유량은 검은색 선으로 도시된다. 약 5.9분의 보이드 피크가 회색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2942
그림 4: 알 수 없는 AuNP 샘플및 적용된 선형 교정 함수(점선)의 얻어진 평균 입자 크기 분포(red)의 오버레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구성 요소CAS-아니오무게 (%)
물7732-18-588.8
9-옥타데스노산 (Z)-, 2,2',2'-니트리로트리스[에탄올](1:1) 화합물2717-15-93.8
탄산나트륨497-19-82.7
알코올, C12-14 보조, 에톡시84133-50-61.8
테트라나트륨 EDTA64-02-81.4
폴리에틸렌 글리콜25322-68-30.9
올레아테 나트륨143-19-10.5
중탄산나트륨144-55-80.1

표 1: 용액을 준비하는 데 사용되는 계면 활성제 혼합물의구성 요소 목록(재료 표 참조).

AF4-UV-vis 매개변수단위값
스페이서 두께Μ m350
검출기 유량mL 분-1 0.5
교차 유량mL 분-1 0(8분 동안 상수)
초점 유량mL 분-1 0
지연 시간/안정화 시간분0
사출 유량mL 분-1 0.5
전환 시간분0
주입 시간분0.1
용출 단계분8
단계 헹기 시간분0.1
헹기 단계 유량mL 분-1 0.1
사출 볼륨μL10
샘플 농도mg L-1 12.5
멤브레인 타입재생셀룰로오스
멤브레인 분자량 차단Kda10
용인성0.025% (v/v) 계면활성제 혼합물
UV 비스 파장Nm532
UV-vis 감도-0.001

표 2: 분리력의 적용 없이 직접 사출 실행을 수행하기 위한 AF4-UV-vis 분별 방법 파라미터의 요약.

AF4-UV-vis 매개변수단위값
스페이서 두께Μ m350
검출기 유량mL 분-1 0.5
교차 유량mL 분-1 1 (60분 상수, 10분 선형)
초점 유량mL 분-1 1.3
지연 시간/안정화 시간분2
사출 유량mL 분-1 0.2
전환 시간분0.2
주입 시간분5
용출 단계분70 (60분 상수, 10분 선형)
헹기 단계분9
헹기 단계 유량mL 분-1 0.5
사출 볼륨μL50
샘플 농도mg L-1 12.5
멤브레인 타입재생셀룰로오스
멤브레인 분자량 차단Kda10
용인성0.025% (v/v) 계면활성제 혼합물
UV 비스 파장Nm532
UV-vis 감도-0.001

표 3: 분리력으로서 교차 흐름의 적용을 통해 분획 실행을 수행하기 위해 AF4-UV-vis 분별 법 매개변수의 요약.

교정 표준캡핑 에이전트평균 크기(TEM) (nm)이력서(평균 크기 TEM) (%)제타 잠재력 (mV)SD(제타 잠재력) (mV)유체 역학 반경(DLS) (nm)SD(유체역학 적 반경) (nm)PdiSD (PDI)
AuNP 20 nm시트르산20.1≤ 8-48.91.510.950.120.0820.009
AuNP 40 nm시트르산40.8≤ 8-30.41.020.300.130.1270.006
AuNP 80 nm시트르산79.2≤ 8-51.51.338.850.230.1380.013
AuNP 100 nm시트르산102.2≤ 8-50.90.952.300.370.0780.009

표 4: 적용된 AuNP 교정 표준의 물리화학 파라미터의 요약은, 상주 현탁액에서 결정된 제타 전위뿐만 아니라 DLS 유체역학 반경, 및 다분산지수(PDI)에서 결정된다.

교정 표준실행최대 최대(최소)의 보존 시간최대 최대(최소)의 순 보존 시간(최소)평균 순 보유 시간(최소)SD (%) (순보유시간)SD(최소) (순 보유 시간)
AuNP 20 nm117.36811.46811.561.020.12
217.40911.509
317.58911.689
AuNP 40 nm125.31619.41619.490.680.13
225.3219.42
325.54819.648
AuNP 80 nm142.09536.19536.290.230.08
242.21936.319
342.25736.357
AuNP 100 nm150.97545.07545.060.070.03
250.92445.024
350.98645.086

표 5: 표 3에기재된 방법을 이용하여 각각의 AF4-UV-vis fractograms로부터 유래된 각각의 UV-Vis 피크 최대값에서 AuNP 교정 표준의 보존 시간.

알리따옴표트실행보존 시간 최대(최소)최대 최대(최소)의 평균 보존 시간(최소)최대 최대(최소)의 순 보존 시간(최소)SD (%) 보존 시간유체 역학 반경(nm)복구(%)
1132.68932.7026.7890.0729.0385.34
232.68726.787
332.71926.819
2132.98933.0827.0890.3729.4981.73
233.07327.173
333.18727.287
3133.05333.1427.1530.4929.5682.14
233.07127.171
333.29127.391

표 6: 각 UV-Vis 피크 최대값에서 의 보존 시간을 요약하여, 외부 크기교정(도 2)으로부터계산된 유체역학 반경 및 AF4-UV-vis 분석에서 얻은 알 수 없는 AuNP 샘플의 회수율.

토론

알 수 없는 AuNP의 유체 역학 크기는 20nm에서 100nm에 이르는 잘 정의된 AuNP 크기 표준을 사용하여 UV-vis 검출기와 결합된 AF4에 의해 정확하게 평가되었습니다. 개발된 AF4 방법은 측정된 보존 시간과 AuNP 크기 사이의 선형 관계를 확립하기 위해 일정한 교차 흐름 프로파일을 사용하여 최적화되어 선형 회귀 분석에서 간단한 크기 측정을 가능하게 했습니다. 특히 분획 시 상당한 시료 손실을 나타내는 충분히 높은 회수율을 달성하는 데 중점을 두었으며, 적용된 용염 및 멤브레인을 포함한 개발된 AF4 방법이 모든 분획된 AuNP 샘플과 잘 일치한다는 점도 있었다.

방법 개발은 틀림없이 AF4및 채널 치수, 흐름 매개 변수뿐만 아니라 용출, 멤브레인, 스페이서 높이, 심지어 샘플 속성을 포함한 여러 매개 변수에서 가장 중요한 단계입니다 주어진 용출 시간 기간 내에서 분획을 개선하기 위해 고려해야합니다. 이 단락의 목적은 여기에서 설명한 알 수 없는 AuNP 샘플의 크기를 성공적으로 결정하기 위해 최적화된 중요한 단계를 독자를 안내하는 것입니다. 일반적으로 AF4 방법을 개발하는 방법에 대한 보다 상세한 설명을 위해, 독자는 'ISO/TS21362:2018 - 나노기술- 비대칭 유동 및 원심 필드 흐름 분획을사용하여 나노 물체의 분석'의 AF4 섹션을 지칭한다. 표 3에주어진 적용된 분획 조건을 자세히 살펴보면, 첫 번째 중요한 단계는 AF4 채널에서 AuNP 샘플의 도입 및 이완입니다. 이 단계는 사출 흐름, 초점 흐름 및 교차 흐름에 의해 제어되며, 그 상호 작용은 샘플을 멤브레인 표면에 가깝게 배치하고 기본적으로 분획의 시작점을 정의하는 AF4 채널의 주입 포트 근처의 좁은 대역에 집중하도록 강요합니다. 이 단계에서와 같이 시료의 충분한 이완이 필수적이며, 다양한 크기의 샘플 성분은 AF4 채널의 다른 높이에서 찾아성공적인 크기 분획의 기초를 제공한다. 불완전한 견본 이완은 일반적으로 유지되지 않은 (즉, 비 이완) 샘플 성분으로 인한 증가 된 공허 피크 영역에 의해 볼 수 있습니다. 이 효과는 주입 시간 및/또는 적용된 교차 유량을 증가시킴으로써 완화될 수 있다. 그러나 두 매개 변수 모두 신중하게 최적화해야 하며, 특히 AF4 멤브레인에 대한 응집 및 흡착되기 쉬운 시료에 대해 서로 다른 파라미터설정(36,37)에대해 얻어진 각각의 회수율에 의해 모니터링될 수 있다. 1.0mL+min-1의 교차 유량과 함께 5분의 적용된 주입 시간은 모든 AuNP 샘플에 대한 회수율 >80%와 거의 최적의 휴식 조건을 나타내는 무시할 수 있는 보이드 피크 영역을 나타냈습니다. AuNP 샘플의 충분한 이완 후, 각 UV-vis 검출기로의 AF4 채널 길이를 따라 초점 흐름이 중지되고 샘플 전송이 두 번째 임계 단계를 나타내기 시작했다. 합리적인 분석 시간에 충분히 높은 분획 전력을 보장하기 위해, 30-50 분 당 1.0mL(@min-1)의 일정한 교차 유량 (각각분획 된 AuNP 크기 표준에 따라 다름)이 적용되었고, 0.5 mL.min-1의 검출기 유량에서 10 분 선형 교차 유량 붕괴가 적용되었습니다. 모든 AuNP 크기 표준의 분리에 걸쳐 일정한 교차 흐름 프로파일을 사용하여 FFF-theory22에이어 보존 시간과 AuNP 크기 사이의 선형 관계를 밝혀, 따라서 간단한 선형 회귀 분석에 의해 알 수없는 AuNP 샘플의 크기 측정을 가능하게한다. 그러나, 일정한 교차 흐름 이외의 프로파일은 나노 입자의 크기 조정을 위해 악용되어 궁극적으로 보존 시간과 입자 크기38, 39사이의 비선형 관계로 이어진다. 또한, 잘 정의된 크기 표준을 사용하는 AF4의 크기 측정은 AuNP에 국한되지 않고 다른 크기 및 원소 조성(예를 들어, 은38,40 또는 실리카 나노입자41,42)을가진 나노입자에도 적용될 수 있다. 또한 희석 시료로 작업할 때 ICP-MS는 매우 민감한 원소 검출기로 AF4와 결합될 수 있으며, 현탁액에서 다양한 나노입자를 크기 조정하기 위한 이 분석 접근법의 다기능성을 더합니다.

광범위한 적용에도 불구하고 AF4의 잘 정의된 크기 표준을 사용하는 외부 크기 교정에는 알 수 없는 샘플의 정확한 크기 조정을 위해 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 특성이 있습니다. 우선, 각각의 크기 표준과 실제 샘플의 분획 중에 유사한 조건의 적용에 크게 의존한다. 여기에 제시된 경우, 따라서 AuNP 크기 표준과 알려지지 않은 AuNP 샘플모두 동일한 AF4 방법뿐만 아니라 동일한 용염 및 동일한 멤브레인을 사용하여 분획되어 이 접근법을 매우 유연하게 렌더링하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 크기에 민감한 검출기가 없는 경우, 예를 들어, 빛 산란(MALS 및 DLS)을 손에 들고, 크기 표준을 사용하는 각 AF4 방법이 충분히 잘 작동하는지 여부를 결정하기 어렵다. 이것은 특히 모든 샘플 성분이 정상적인 용용 패턴을 따르는지 여부가 불분명하게 남아 있는 알 수 없는 샘플에 대해 마찬가지입니다: 더 작은 입자에서 더 큰 입자로분획, 또는 더 큰 샘플 성분이 이미 스테릭 하이퍼레이어 모드에서 elute여부를 수행하여 더 작은 샘플 성분43,44와잠재적으로 동조할 수 있습니다. 또한, FFF 이론은 AF4가환경과의상호 작용 없이 포인트 질량으로 간주되는 입자와 유체 역학적 크기의 차이에 기초하여 단독으로 분리된다는 것을 강조하지만, 현실은 입자 입자 및 입자 막 상호 작용(예: 정전기 어트랙션/반발 또는 반-데르-왈스 어트랙션)과 다른 이야기를 들려주며, 46개의 외부 측정을 통해 상당한 역할을 할 수 있으며, 잠재적으로46개의외부 측정을 통해 측정 가능한 크기 측정을 도입할 수 있다. 따라서 관심 있는 입자(40) 및 표면 특성(Zeta potential)과 이상적으로 일치하는 크기 표준을 사용하는 것이좋습니다(40) 또는, 이들이 사용할 수 없는 경우, 적어도 잘 특징적인 입자 크기 표준(예를 들어, 폴리스티렌 라텍스 입자)을사용하고,특히 47의 잠재적인 분석에서 관심 있는 입자와의 비교가능성을 신중하게 평가하는 것이좋습니다.

AF4의 다재다능함은 종종 가장 큰 강점으로 간주됩니다, 그것은이 분야에서 대부분의 일반적인 크기 조정 기술을 넘어 응용 범위를 제공으로22,48,49. 동시에, 그 관련 된 아마도 복잡성으로 인해, 그것은 또한 특히 DLS와 같은 빠르고 표면적으로 사용하기 쉬운 크기 조정 기술에 대 한 그것의 가장 중요 한 단점으로 간주 될 수 있습니다., 나노 입자 추적 분석, 또는 단일 입자 ICP-MS. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 인기 있는 크기 조정 기법으로 관점에 AF4를 넣어 때, 그것은 분명 하 게 모든 기술 그들의 장 단점, 하지만 그들 모두는 나노 입자의 physico-화학 적 특성의 보다 포괄적인 이해에 기여 하 고 따라서 경쟁 보다는 보완 으로 간주 되어야 한다.

여기에 제시된 표준 운영 절차(SOP)는, 서스펜션에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 크기 조정을 위한 외부 크기 보정을 갖춘 AF4-UV-vis의 우수한 적용성을 강조하고, 결국 호라이즌 2020 프로젝트의 프레임에서 수행된 국제 간 실험실 비교(ILC) 내에서 알 수 없는 AuNP 샘플의 AF4 분석을 위한 권장 지침으로 적용되었다. 따라서 이 프로토콜은 AF4 방법론25,50,51,52가 나노입자 특성화 분야에서 AF4의 유망한 잠재력을 강조하고 검증하고 표준화하기 위한 격려적이고 지속적인 국제적 노력을 추가합니다.

공개

이 원고의 모든 저자는 이 프로토콜에 제품이 활용되는 Postnova Analytics GmbH의 직원입니다.

감사의 말

저자는 여기에 제시 된 프로토콜의 준비의 모든 단계를 통해 유익한 토론을위한 전체 ACEnano 컨소시엄에 감사드립니다. 저자는 또한 ACEnano 프로젝트의 프레임에 보조금 계약 nº 720952에 따라 유럽 연합 호라이즌 2020 프로그램 (H2020)에서 자금을 주셔서 감사합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 µm Membrane Filters (hydrophilic PVDF)Postnova Analytics GmbHZ-FIL-TEF-002Used for filtration of aqueous solutions
0.22 µm PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)Merck MilliporeDurapore MillexUsed for filtration of NovaChem100
Adjustable Volume Pipettes (1000 µL)Eppendorf AGResearch PlusUsed to prepare diluted AuNP suspensions
AF4 cartridgePostnova Analytics GmbHAF2000 MF - AF4 Analytical ChannelComponent of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)Postnova Analytics GmbHZ-AF4-MEM-612-10KDComponent of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Analytical Balance (0.1 mg precision)SartoriusENTRIS124I-1SUsed to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution
AutosamplerPostnova Analytics GmbHPN5300Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Channel OvenPostnova Analytics GmbHPN4020Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Crossflow ModulePostnova Analytics GmbHAF2000 MF Control ModuleComponent of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Disposable Pipette Tips (1000 µL)Eppendorf AGep T.I.P.SUsed to prepare diluted AuNP suspensions
Flasks (e.g. 2 liter volume)neoLab1-0199Used for eluent storage
Focus PumpPostnova Analytics GmbHPN1131Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)Postnova Analytics GmbHVIA-002Used for sample storage
Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)Postnova Analytics GmbHNovaCal Gold50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function
Magnetic StirrerIKAVIBRAX-VXRUsed to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW
Personal Computer (PC)Dell Technologies/Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)//In accordance with respective laboratory’s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials
Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)Postnova Analytics GmbHZ-VIA-09150868Used for sample storage
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), ≥99 %, Blotting GradeCarl Roth GmbH & Co KG2326.1Used for the preparation of the cleaning solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, ≥98 %, p.aCarl Roth GmbH & Co KG6771.1Used for the preparation of the cleaning solution
Software Package for Control and Data AcquisitionPostnova Analytics GmbHNovaFFF AF2000 SoftwareSoftware for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual
Software Package for Data EvaluationPostnova Analytics GmbHNovaAnalysis SoftwareSoftware for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual
Software Package for final Data ProcessingOriginLab CorporationOrigin 2019Used for final data processing
Solvent DegasserPostnova Analytics GmbHPN7520Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent SelectorPostnova Analytics GmbHPN7310Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Solvent OrganizerPostnova Analytics GmbHPN7140Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Surfactant MixturePostnova Analytics GmbHNovaChem100Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation
Tip PumpPostnova Analytics GmbHPN1130Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript
Unknown AuNP sampleBBI SolutionsEM.GC6060 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function
UV-vis DetectorPostnova Analytics GmbHPN3211UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system
Vacuum Filtration UnitPostnova Analytics GmbHEluent Filtration SystemUsed to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions
VortexIKAVortex Genie 2Used for homogenization of diluted AuNP suspensions
Water Purification SystemMerck MilliporeMilli-Q Integral 5Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 MΩcm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions

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