Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Zusammenfassung

Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.

Zusammenfassung

Die kryogene Elektronentomographie (CryoET) ist eine leistungsfähige Methode, um die 3D-Struktur biologischer Proben in einem nativen Zustand zu untersuchen. Der aktuelle Stand der Technik CryoET in Kombination mit der Subtomogramm-Mittelungsanalyse ermöglicht die hochauflösende strukturelle Bestimmung makromolekularer Komplexe, die in mehreren Kopien innerhalb tomographischer Rekonstruktionen vorhanden sind. Tomographische Experimente erfordern in der Regel eine große Menge an Neigungsreihen, die mit High-End-Transmissionselektronenmikroskopen mit erheblichen Betriebskosten erfasst werden müssen. Obwohl sich der Durchsatz und die Zuverlässigkeit automatisierter Datenerfassungsroutinen in den letzten Jahren ständig verbessert haben, kann der Prozess der Auswahl von Regionen von Interesse, in denen eine Neigungsreihe erfasst wird, nicht einfach automatisiert werden und ist immer noch auf die manuelle Eingabe des Benutzers angewiesen. Daher ist der Aufbau einer groß angelegten Datenerfassungssitzung ein zeitaufwändiges Verfahren, das die verbleibende Mikroskopzeit, die für die Erfassung von Neigungsreihen zur Verfügung steht, erheblich reduzieren kann. Hier beschreibt das Protokoll die kürzlich entwickelten Implementierungen auf Basis des SerialEM-Pakets und der PyEM-Software, die die Zeiteffizienz des Grid-Screenings und der großflächigen Tilt-Series-Datenerfassung deutlich verbessern. Das vorgestellte Protokoll veranschaulicht, wie SerialEM-Skriptfunktionen verwendet werden, um die Rasterzuordnung, die Rasterquadratzuordnung und die Erfassung von Neigungsreihen vollständig zu automatisieren. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll, wie PyEM verwendet wird, um zusätzliche Erfassungsziele im Offline-Modus auszuwählen, nachdem die automatisierte Datenerfassung initiiert wurde. Zur Veranschaulichung dieses Protokolls wird seine Anwendung im Rahmen der High-End-Datenerfassung der Sars-Cov-2-Neigungsserie beschrieben. Die vorgestellte Pipeline eignet sich besonders zur Maximierung der Zeiteffizienz von Tomographie-Experimenten, die eine sorgfältige Auswahl von Erfassungszielen und gleichzeitig eine große Menge an zu sammelnden Neigungsreihen erfordern.

Einleitung

Kryogene Elektronenmikroskopie (CryoEM) Methoden basieren auf der Abbildung biologischer Proben mittels eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) nach ihrer schnellen Vitrifikation, einem Probenvorbereitungsverfahren, das die molekularen und zellulären Strukturen von Proben in einem nahezu nativen und hydratisierten Zustand bewahrt^1,2. In der kryogenen Elektronentomographie (CryoET) wird ein 3D-Modell der verglasten Probe erreicht, indem eine Reihe von Bildern derselben Region von Interesse aus verschiedenen Orientierungen, die sogenannte Tilt-Serie, entnommen wird, gefolgt von der rechnerischen Rekonstruktion des tomographischen Bandes^3. Diese fortschrittliche Bildgebungstechnik hat sich zu einer leistungsfähigen Methode zur strukturellen Untersuchung biologischer Prozesse im Kontext ihrer nativen zellulären Umgebung entwickelt^4,5,6.

Neben der ultrastrukturellen Analyse der vitrifizierten Probe können hochauflösende Rekonstruktionen makromolekularer Komplexe, die in mehreren Kopien innerhalb des tomographischen Volumens vorhanden sind, durch Anwendung des Subtomogramms mit einem Mittelwert von⁵erhalten werden. Dieser Rekonstruktionsansatz basiert auf der iterativen Ausrichtung und Mittelung von Teilvolumina, die die interessierende Struktur enthalten, und zielt darauf ab, das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der endgültigen Rekonstruktion^7,8zu erhöhen. Die Subtomogramm-Mittelung beruht auf der Erfassung und Verarbeitung einer großen Datenmenge, die oft die Erfassung von Hunderten von Neigungsserien mittels High-End-TEMs mit belastenden Betriebskosten erfordert.

Derzeit ist die Einrichtung solcher automatisierten CryoET-Sitzungen ein zeitaufwändiger Prozess, der in der Regel auf der manuellen Eingabe des Benutzers^9,10,11beruht. Typischerweise werden Ziele durch visuelle Inspektion des abgebildeten Rasters identifiziert und anschließend für die automatisierte Datenerfassung eingerichtet. Die Effizienz des Benutzers bei der Identifizierung von Erfassungspunkten wird oft von der Art der Probe beeinflusst, was bei der Analyse gereinigter Makromoleküle mit suboptimaler Konzentration oder bei seltenen Ereignissen in überfüllten zellulären Umgebungen besonders schwierig wird, was die Verwendung korrelativer Ansätze impliziert¹². Darüber hinaus erfordern aktuelle Workflows die Erfassung von Bildern während des Aufbaus mit verschiedenen Vergrößerungen, die später für die präzise Lokalisierung und Zentrierung des Ziels während der automatisierten Erfassung verwendet werden^11,13,14. Diese hochpräzisen Re-Alignment-Schritte sind entscheidend für hochauflösende Anwendungen, die eine hohe Vergrößerung der Bildgebung erfordern und genaue Zentrierungsschritte erfordern, um den interessierenden Bereich innerhalb des resultierenden kleinen Sichtfelds zu halten. Insgesamt werden mehrere Stunden jeder Datenerfassungssitzung für diesen zeitaufwändigen Vorgang festgelegt, bei dem das TEM nicht an der Erfassung von Neigungsreihen beteiligt ist. Abhängig von der Menge der erforderlichen Neigungsreihen kann die Identifizierung und Einrichtung von Erfassungspunkten daher einen erheblichen Einfluss auf die Mikroskopzeit haben, die für die Datenerfassung während einer KryoET-Sitzung zur Verfügung steht.

Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das auf dem SerialEM-Softwarepaket¹⁵ und der neuesten Version der PyEM-Software¹⁶ basiert, um Raster zu kartieren, Rasterquadrate abzubilden, Ziele auszuwählen und automatisierte Datenerfassung für die Erfassung großflächiger Neigungsserien einzurichten. Das Schlüsselkonzept dieses Ansatzes besteht darin, SerialEM für jedes Erfassungselement rechnerisch generierte Bilder von PyEM zur Verfügung zu stellen, die als virtuelle Karten bezeichnet werden, um das Ziel genau zu lokalisieren und zu zentrieren. Um die tatsächliche Erfassungszeit zu gewinnen, erfolgt die Auswahl der Ziele sowie die Erstellung der virtuellen Karten offline mit einer zweiten Dummy-Instanz von SerialEM, wodurch der Auswahlprozess der Erfassungsziele von TEM-Operationen entkoppelt wird. Obwohl nicht darauf^eingeht,wie die Datenqualität¹³,¹⁷ oder die Geschwindigkeit der Erfassung der Tilt-Serie^18,19erhöht werden kann, konzentriert sich dieses Protokoll in erster Linie auf Strategien zur Optimierung der Zeiteffizienz der Einrichtung großer automatisierter KryoET-Sitzungen. Daher ist die Implementierung des vorgestellten Protokolls für diejenigen Wissenschaftler gedacht, die KryoET-Datenerfassungs-Workflows einrichten, die die Ausbeute der automatisierten Datenerfassung maximieren möchten, indem sie die für die Erfassung von Neigungsreihen verfügbare Mikroskopzeit erhöhen.

Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll ist Teil eines umfassenderen Dokuments, das von der EMBL CryoEM Service Platform erstellt wurde und gründliche Schritt-für-Schritt-Anleitungen und Screenshots enthält, die den gesamten Ablauf einer typischen KryoET-Sitzung veranschaulichen, einschließlich Probenladung, Grid-Mapping, Mikroskop-Tuning, Einrichtung von Erfassungspunkten und automatisierter Datenerfassung. Das vollständige Protokoll kann unter folgendem Link heruntergeladen werden: https://oc.embl.de/index.php/s/9OuTl8AazDkCNq0/download

1. Voraussetzungen

1. Installieren Sie SerialEM Version 3.8 und richten Sie die Steuerung des Mikroskops und des Detektors ein (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/betaHlp/html/setting_up_serialem.htm).
2. Installieren Sie eine Dummy-Instanz von SerialEMversion 3.8 (https://sphinx-emdocs.readthedocs.io/en/latest/serialEM-note-setup-dummy.html).
3. Installieren Sie PyEM (https://git.embl.de/schorb/pyem).

2. Grid-Mapping

1. Laden Sie eine Kassette mit Gittern in den Autoloader des Mikroskops.
2. Richten Sie Bildbedingungen ein, die für die Abbildung des gesamten Rasters geeignet sind. Tun Sie dies bei möglichst geringer Vergrößerung unter Berücksichtigung des Sichtfeldes des verwendeten Detektors (EFTEM SA 2250x). Speichern Sie die Imaging-Bedingungen als SerialEM Imaging-Status, um die Dinge für die spätere Verwendung bequem zu machen.
3. Vollständige Montage einrichten
   1. Öffnen Sie das Menü SerialEM Navigator.
   2. Wählen Sie Montaging & Grids.
   3. Wählen Sie Vollständige Montage einrichtenaus.
4. Starten Sie das Skript Grid_Mapping. Lassen Sie das Skript warten, bis der Autoloader abgekühlt ist. Führen Sie eine Inventur durch und ordnen Sie dann jedes Raster zu, das die Inventurprozedur gefunden hat. Geben Sie eine E-Mail über das Tilt Series-Menü ein, damit das Skript bequem eine E-Mail senden kann, wenn es fertig ist.
5. Navigatorspeichern .
6. Überprüfen Sie alle Rasterzuordnungen aus dem SerialEM Navigator und wählen Sie aus, welches Raster bei höherer Vergrößerung weiter zugeordnet werden soll.
   HINWEIS: Viele TEMs, die mit einem Autoloader-System ausgestattet sind, zeigen beim Nachladen eine Rotation des Rasters an. Es ist am besten, jedes Raster nach dem neu laden neu zuzuordnen. Alternative Systeme erleiden in der Regel nur einige Verschiebungen, die in SerialEM mit einem Shift To Marker-Verfahren korrigiert werden können.

3. Richten Sie die Niedrige Dosis SerialEM ein

1. Stellen Sie die Vergrößerung der SerialEM-Modi "Low Dose View" und "Preview" ein (dies ist für Schritt 6 erforderlich).
2. Erfassen Sie ein Ansichtsbild, und speichern Sie es als Karte im Navigator.
3. Erfassen Sie ein Vorschaubild, und speichern Sie es als Karte im Navigator.
   1. Stellen Sie beide Modi auf das gleiche Binning ein (Binning 4 wird empfohlen). Dadurch können die beiden Karten in einem Bildstapel gespeichert werden.
   2. Ändern Sie im Fenster SerialEM Navigator die Beschriftung der Ansichtskarte in Ansicht und die Beschriftung der Vorschaukarte in Vorschau.
   3. Speichern und schließen Sie die Navigatordatei.
      HINWEIS: Für die ersten View- und Preview-Bilder wird kein Ziel benötigt, PyEM verwendet lediglich deren Imaging-Einstellungen.

4. Rasterquadrat-Mapping

1. Richten Sie die Abbildungsbedingungen ein, um Rasterquadrate zuzuordnen. Es ist von großer Bedeutung, die interessierenswerte Stichprobe und die treuhänderische Perlenverteilung sehen zu können. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um einen optimalen Kontrast für Rasterquadratkarten sicherzustellen.
   1. Setzen Sie eine Objektivblende ein.
   2. Setzen Sie ggf. den Energiefilterspalt ein.
   3. Verwenden Sie einen Defokussieren von -100 μm.
2. Bildschirm für gute Rasterquadrate, die für die weitere Kartierung geeignet sind. Nach der visuellen Inspektion der Quadrate aus der Rasterkarte nehmen Sie Testbilder des Quadrats mit den Bildbedingungen auf, die für Rasterquadratkarten verwendet werden sollen.
3. Wenn ein gutes Quadrat identifiziert wurde, markieren Sie seine Mitte im Rasterkartenbild mithilfe der Funktion Punkte hinzufügen des SerialEM Navigators.
4. Sobald alle Punkte hinzugefügt wurden, drücken Sie im SerialEM Navigator umschalt + A am ersten Punkt und dann Umschalt + A am letzten Punkt.
   HINWEIS: Alle hinzugefügten Punkte sind jetzt mit einem A gekennzeichnet, d.h. sie sind alle Erfassungspunkte.
5. Drücken Sie UMSCHALT + N (Erstellen Sie eine neue Datei am Element) für den ersten Punkt und dann erneut für den letzten Punkt. Wählen Sie im angezeigten Dialogfeld Montaged Images aus.
6. Wenn das Montagedialogfeld angezeigt wird, richten Sie eine Montagegröße ein, die ein Rasterquadrat abdeckt. Dies hängt von der Vergrößerung und der Maschenweite der verwendeten Gitter ab und erfordert typischerweise 2 x 2 bis 4 x 4 Montagen. Geben Sie ihm einen Namen mit einer Nummer (z. B. squaremap_01.mrc), damit der SerialEM alle Dateien bequem automatisch pro Rasterquadrat nummerieren kann.
7. Starten Sie das Grid-Mapping, indem Sie das SerialEM Navigator-Menü öffnen und auf Acquire At Itemsklicken.
8. Wählen Sie im Popupmenü die folgenden Optionen aus.
   1. Wählen Sie Grobe Euzentrizitätaus.
   2. Wählen Sie Kartenbild erfassenaus.
   3. Wählen Sie Am Ende die Option Säulenventile schließenaus.
   4. Wählen Sie E-Mail am Ende sendenaus.

5. Auswahl der Ziele

1. Öffnen Sie eine SerialEM-Dummy-Instanz. Dies kann auf dem SerialEM-PC eingerichtet werden, der das Mikroskop steuert, oder auf einem anderen (Unterstützungs-) PC, wenn beide Computer eine Netzwerkverbindung verwenden.
2. Sobald das erste Rasterquadrat zugeordnet ist, verwenden Sie die SerialEM Navigator-Menüoption Zusammenführen, um die Montage in der SerialEM-Dummy-Instanz anzuzeigen.
3. Doppelklicken Sie auf das Navigator-Fenster, um die quadratische Rasterkarte zu öffnen.
4. Durchsuchen Sie die Karte und verwenden Sie die Dummy SerialEM Navigator-Option Punkte hinzufügen, um Bilderfassungspunkte auf dem gewünschten Ziel hinzuzufügen.
5. Wenn Sie fertig sind und nachdem Sie die neuen Quadrate zugeordnet haben, speichern Sie die Navigator-Datei und führen Sie den Navigator erneut zusammen. Fahren Sie fort, bis alle Rasterquadrate zugeordnet sind.

6. Virtuelle Karten generieren

1. Führen Sie die Navigator-Datei erneut mit der Dummy SerialEM-Instanz zusammen.
2. Führen Sie pyEM Virtual maps script aus dem Dummy SerialEM Menü, Tools und wählen Sie Virtual Anchor Maps. Dies kann je nach Größe und Menge der Rasterquadratkarten und dem Binning der Ansichts- und Vorschaukarten einige Zeit in Anspruch nehmen.
   HINWEIS: PyEM startet ein Befehlsfenster, das sich automatisch schließt, wenn es fertig ist, dann kann die neue Navigator-Datei geöffnet werden. Pro montagierter Karte, die ausgewählte Punkte enthält, schreibt PyEM eine einzelne zusammengeführte Karte und alle ihre Ansichts- und Vorschaukarten. Schließlich schreibt es eine neue Navigator-Datei namens <navigatorfilename>_automaps.nav.

7. Mikroskop-Tuning

1. Überprüfen Sie die Mikroskopabstimmung. Um die richtige Mikroskopleistung zu gewährleisten, verwenden Sie die gleiche Vergrößerung und Strahlgröße für die Datenerfassung in der folgenden Reihenfolge.
   1. Führen Sie SeriaLEM Coma-free Alignment per CTF (Zemlin tableau) aus.
   2. Setzen Sie eine Objektivblende ein und zentrieren Sie sie.
   3. Führen Sie SerialEM Correct Astigmatism by CTF (auto-stigmate) aus.
   4. Führen Sie GIF Quick Tune aus (d. h. nur Schlitzfokus).
      HINWEIS: Da die Schritte 7.1.1, 7.1.3 und 7.1.4 möglicherweise mehr Dosisleistung erfordern, sollte nur die Spotgröße geändert werden. Die Strahlgröße sollte nicht geändert werden, da dies zu einer Strahlneigung führt, wodurch die Stimmungen falsch sind. Die Schritte 7.1.1, 7.1.2 und 7.1.3 sind in diesem öffentlich verfügbaren Skript halbautomatisiert (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).

8. Navigator einrichten

1. Öffnen Sie in SerialEM die neue Navigatordatei mit dem Namen _automaps.nav.
   HINWEIS: V_yyyy sind die Karten anzeigen und P_yyyy die Vorschaukarten. Die Vorschaukarten werden als Erfassungspunkte festgelegt.
2. Heben Sie im Fenster SerialEM Navigator die Auswahl aller A-Punkte auf, wählen Sie die erste V_yyyy Karte aus, wählen Sie Reduzierenaus, klicken Sie zweimal auf A und deaktivieren Sie Reduzieren.
3. Wählen Sie die erste V_yyyy Position aus, drücken Sie Umschalt + T, wählen Sie dann die letzte V_yyyy Position aus, und drücken Sie erneut Umschalt + T.
4. Wählen Sie Einzelbildbilder in den Eigenschaften der zu öffnenden Datei aus.
5. Wählen Sie im nächsten Dialogfeld Dateieigenschaften die gewünschten Parameter entsprechend den Bildgebungsanforderungen und der Geräteeinrichtung aus.
6. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie einen Namen mit einer Nummer ein (z. B. TS_001.mrc) und klicken Sie auf Speichern.
   HINWEIS: SerialEM nummeriert automatisch die Dateinamen für alle Neigeserien.
7. Richten Sie den Controller der Tilt-Serie für die erste TS-Position ein. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK, um diese Parameter für alle Neigungsserien nach diesem Erfassungselement festzulegen. Alle Vorschaukarten sind jetzt als TS (Tilt Series) mit nummeriertem Dateinamen TS_xxx.mrcausgewählt.
   HINWEIS: Man kann die Parameter später manuell mit der Navigator TSparams-Funktion ändern; Änderungen werden für alle Elemente unten in der Liste angewendet. Der Benutzer hat die Möglichkeit, anstelle der Neigungsreihe ein benutzerdefiniertes Skript auszuführen.

9. Stellen Sie die Fokus-/Spurpositionen ein

1. Stellen Sie bei Bedarf den Fokus/die Spurentfernung für jedes Ziel ein (stellen Sie sicher, dass SerialEM Low Dose eingeschaltet ist).
2. Doppelklicken Sie auf die Ansichtskarte, um sie zu laden.
3. Wählen Sie in der Liste Navigator die Vorschaukarte aus.
4. Wählen Sie im Navigatorfenster Fokus bearbeiten aus.
5. Deaktivieren Sie im Bedienfeld "Low Dose Control" die Option "Zwischenbereichsachse drehen, um Trial" und "Fokus" entlang der Neigungsachse der Bühne zu positionieren.
6. Klicken Sie auf den gewünschten Bereich in der geladenen Ansichtskarte, um die Fokus-/Versuchsposition für diese Neigungsserie festzulegen.
7. Stellen Sie sicher, dass für das Navigatorelement TSP jetzt festgelegt ist. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Elemente.
   HINWEIS: Fokus-/Spurpositionen werden im Navigator automatisch nach unten kopiert. Wenn sich die Fokus-/Spurposition für das vorherige Element auf der richtigen Seite und im richtigen Abstand befindet, muss sie daher nicht für das aktuelle Element geändert werden.

10. Zusätzliche Skripte einrichten

1. Zwei Skripte behandeln den Fokusbereich: pretomo und duringtomo. Das pretomo-Skript wird vor jeder Tilt-Serie und das duringtomo-Skript während jeder Tilt ausgeführt.
2. Bearbeiten Sie den Fokusbereich im Skript pretomo.
3. Aktivieren Sie im Menü SerialEM Tilt Series die Option Skript in TS ausführen und wählen Sie die Skriptnummer des duringtomo-Skripts aus.

11. Ausführen

1. Überprüfen Sie den Füllstand des Stickstofftanks.
2. Überprüfen Sie, ob der Autoloader-Turbo ausgeschaltet ist.
3. Überprüfen Sie den freien Speicherplatz im Datenspeicher.
4. Deaktivieren Sie im Menü SerialEM-Datei die Option Kontinuierliches Speichern für die Protokolldatei, und schließen Sie alle derzeit geöffneten Protokolldateien. Jede Tilt-Serie erhält eine eigene Protokolldatei.
5. Klicken Sie im Navigator-Menü auf Acquire at Items.
6. Führen Sie das Skript PreTomoaus.
7. Wählen Sie Primäre Aufgabe Neigungsreihe erfassen.
8. Wählen Sie Skript nach PostTomo ausführen.
9. Wählen Sie Am Ende Säulenventile schließenaus.
10. Wählen Sie E-Mail am Ende sendenaus.
11. Klicken Sie auf GO.
    HINWEIS: SerialEM sendet eine E-Mail pro Tilt-Serie, entweder erfolgreich oder fehlerfrei; Fehler kann aber auch bedeuten, dass der volle Neigungsbereich nicht erreicht wurde.

Ergebnisse

Dieses Verfahren wurde verwendet, um die in Turonova et al. 2020²⁰beschriebene Sars-Cov-2-Neigungsserie zu erwerben; Der gesamte Datensatz wurde mit drei verschiedenen Rastern in drei Mikroskopiesitzungen am EMBL Heidelberg erstellt. Die aktuelle Studie wird sich auf den ersten 3-tägigen (~ 72 h) Sitzungslauf mit dem ersten Grid konzentrieren und diesen beschreiben.

Nachdem das gesamte Raster bei geringer Vergrößerung (~10 min, siehe Schritt 2) abgebildet wurde, wurden 71 geeignete Quadrate auf der Rasterkarte ausgewählt und Karten mit mittlerer Vergrößerung(quadratische Karten)mit Einstellungen (Vergrößerung, Belichtung, Defokussierung) erfasst, die eine direkte Visualisierung und Identifizierung der interessierenden Probe, in diesem Fall Coronaviren, ermöglichen (siehe Schritt 4) (Abbildung 1A). Die Erfassungszeit betrug ~3 min pro Quadrat, 3 h 45 min insgesamt.

Sobald die erste quadratische Karte erstellt wurde, wurde eine Dummy-SerialEM-Instanz (ohne Steuerung an Kamera oder Mikroskop) auf einem separaten Computer geöffnet, um die quadratische Karte zu visualisieren und Punkte auf Zielen hinzuzufügen, die für die Erfassung von Neigungsreihen geeignet sind (siehe Schritt 5) (Abbildung 1B). Neu erworbene quadratische Karten wurden durch Zusammenführen des aktuellen Dummy-SerialEM-Navigators mit dem Navigator aus der übernehmenden SerialEM-Instanz abgerufen. Nach ~2 h Rasterquadraterfassung und -auswahl konnten 50 erste Ziele identifiziert werden.

Nachdem die quadratischen Kartenaufnahmen abgeschlossen waren, wurde SerialEM Low-Dose eingerichtet und Referenzansichts- und Vorschaubilder aufgenommen und als Karten gespeichert (siehe Schritt 3). Letztere Maps könnten dann sofort auf der Dummy SerialEM-Instanz verwendet werden, um aus den entsprechenden quadratischen Kartenbildern die Virtual View (Abbildung 1C) und Virtual Preview (Abbildung 1D) Karten der 50 ausgewählten Ziele mit der PyEM Software Suite für eine Verarbeitungszeit von ~ 30 min zu generieren (siehe Schritt 6). Diese Verarbeitungszeit auf der Dummy SerialEM-Sitzung wurde genutzt, um die letzten Vorbereitungen des Mikroskops für die Erfassung durchzuführen: Energiefilter-Tuning, neue Kameraverstärkungsreferenzbilderfassung, astigmatismus- und komafreie Ausrichtung des Objektivs.

Nachdem die Mikroskopabstimmung abgeschlossen und virtuelle Karten aus den 50 ersten Zielen generiert wurden, wurde der eigentliche SerialEM-Navigator für die Erfassung eingerichtet (siehe Schritt 8), Fokus- und Spurpositionen festgelegt (Schritt 9) und die Erfassung der Neigungsreihe konnte gestartet werden (siehe Schritte 10 und 11). Die Virtual View Maps ( Abbildung1C) wurden für eine anfängliche Zentrierung des Ziels ( Abbildung1E) verwendet, gefolgt von einer abschließenden Zentrierung, die bei der tatsächlichen Neigungsreihenerfassungsvergrößerung (Abbildung 1F) unter Verwendung der Virtuellen Vorschaukarte (Abbildung 1D) durchgeführt wurde.

Beginnend mit der Grid-Kartierung um 9:30 Uhr morgens begann gegen 15:00Uhr die Erfassung der Tilt-Serie für die 50 ersten Ziele. Mit den Einstellungen, die für die tomographische Erfassung verwendet wurden (siehe Referenz für Details), dauerte die Erfassung einer Neigungsserie ~ 20 Minuten, wobei genügend Ziele dann die ganze Nacht durchlaufen wurden. Während der Erfassung konnte der Rest der quadratischen Karten inspiziert und weitere Ziele hinzugefügt werden, immer noch offline über die Dummy-SerialEM-Instanz. 121 weitere Ziele wurden unter den verbleibenden quadratischen Karten ausgewählt und dem Erfassungs-SerialEM-Navigator hinzugefügt, nachdem virtuelle Karten für diese neuen Ziele erstellt worden waren, genug, um bis zum Abschluss der 72-Stunden-Sitzung ausgeführt zu werden.

Dieses Verfahren (zusammengefasst in Abbildung 2) ermöglichte an einem einzigen Arbeitstag die Einrichtung von 171 Targets für automatisierte tomographische Erfassungen für eine 72 h (3 Tage) Mikroskopsitzung.

Abbildung 1: Beispiel einer quadratischen Karte mit repräsentativen virtuellen Karten und entsprechenden Erfassungen nach zentrierung. (A) Repräsentative quadratische Karte eines Sars-Cov-2-KryoEM-Gitters, das in Turonova et al.²⁰verwendet wird. Vier interessante Regionen sind mit einem roten Kreuz gekennzeichnet. Die Mikroskopvergrößerung beträgt das 2.250-fache. (B) Schneiden Sie aus der quadratischen Karte aus und markieren Sie die Bereiche, die zum Generieren der Karten Virtual View (orange) und Virtual Preview (gelb) für das ausgewählte Ziel (rotes Kreuz)(C)Virtual View Map verwendet wurden. (D) Virtuelle Vorschaukarte. (E) Ist-View-Erfassung nach Zentrierung unter Verwendung der Virtual View-Karte als Referenz. Die Mikroskopvergrößerung beträgt das 11.500-fache. (F) 0° Neigungserfassung aus der Neigungsreihe nach zentrierung unter Verwendung der Virtual Preview-Karte als Referenz. Die Mikroskopvergrößerung beträgt das 64.000-fache. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: CryoET-Sitzungsworkflow mit SerialEM mit PyEM-Tools. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Von einer Nischentechnik ist CryoET nun zu einer weit verbreiteten Methode gereift, um Strukturstudien auf zellulärer und molekularer Ebene mit beispiellos erreichbarer Auflösung^21,22durchzuführen. Die ständig steigende Nachfrage nach KryoEM-Bildgebung hat die begrenzten Ressourcen, die für den Zugang zu dieser Technologie zur Verfügung stehen, belastet. Trotz der Eröffnung einer Reihe nationaler KryoEM-Einrichtungen und der Bemühungen wissenschaftlicher Institute, ihre TEM-Kapazität zu erhöhen, um die Bedürfnisse der Gemeinschaft weltweit zu unterstützen, ist der Zugang zu KryoEM-Instrumenten immer noch begrenzt und die für die Datenerhebung verfügbare Zeit muss daher von den Benutzern effizient genutzt werden, um den Ertrag jeder Mikroskopiesitzung zu maximieren. Die Notwendigkeit, Hunderte von Tilt-Serien in Kombination mit der begrenzten Zeit für die Datenerfassung zu erwerben, erforderte neuartige Bilderfassungsroutinen, um einen besseren Durchsatz zu erzielen, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen. Jüngste Entwicklungen in Hardware- und Imaging-Workflows haben die Geschwindigkeit der Tilt-Series-Erfassung¹⁸,¹⁹erheblich^erhöht,was zu einer dramatischen Verschiebung des Verhältnisses zwischen der Zeit, die für die Einrichtung eines Erfassungspunkts aufgewendet wird, und der Zeit, die für die eigentliche Tilt-Series-Erfassung benötigt wird, geführt hat. Insgesamt wird das Verfahren zur Einrichtung von Erfassungspunkten zu einem der größten Engpässe für den erreichbaren Durchsatz von KryoET-Sitzungen.

Das hier vorgestellte optimierte Protokoll ermöglichte es uns, im Offline-Modus 171 Positionen für die automatisierte tomographische Erfassung innerhalb des ersten Tages einer KryoET-Sitzung einzurichten, während das Mikroskop aktiv an anderen Operationen beteiligt war (z. B. Quadratische Kartierung, Tuning und automatisierte Neigungsreihenerfassung), ohne die für die Datenerfassung verfügbare Mikroskopzeit zu beeinträchtigen. Neben der Maximierung des Durchsatzes einer KryoET-Sitzung reduziert diese Pipeline den Zeitaufwand des Benutzers in der Vorbereitungsphase einer automatisierten Datenerfassungssitzung drastisch. Im beschriebenen Protokoll wird der Benutzer aufgefordert, die abgebildeten Rasterquadrate zu durchsuchen, um geeignete Bereiche von Interesse zu identifizieren und sie dem Serial EM Navigator als Erfassungspunkte hinzuzufügen. Alle Ziele werden dann automatisch im Batch innerhalb von SerialEM vom PyEM-Tool für die Erstellung der virtuellen Karten¹⁶verarbeitet. Der vorgestellte Berechnungsansatz ist daher wesentlich schneller als die Erfassung echter Verankerungskarten, indem die Wartezeiten eliminiert werden, die mit Bühnenbewegung, Bildaufnahme, Änderung der Bildgebungsbedingungen zwischen Ansicht und Vorschau verbunden sind, und durch die eventuelle Wiederholung dieser Schritte bei zentrierung bei hoher Vergrößerung. Da jedes aufgenommene Bild zur Anhäufung der Elektronendosis auf dem Objekt von Interesse²³führt, reduziert die Verwendung virtueller Karten zur präzisen Neuausrichtung der Ziele die Strahlungsschäden, die in der Vorbereitungsphase einer KryoET-Sitzung vor der eigentlichen Neigungsreihenerfassung entstehen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet sowohl virtuelle Karten mit mittlerer als auch mit hoher Vergrößerung (Vorschau bzw. Ansicht) für die Neuausrichtung des Ziels vor der Erfassung der Neigungsreihe. Dieses Verfahren kann leicht dadurch modifiziert werden, dass nur das Bild mit mittlerer Vergrößerung verwendet wird, wenn die Ausrichtungsgenauigkeit von geringerer Bedeutung ist, z. B. bei großen Strukturen, bei denen die endgültige Zielgenauigkeit weniger wichtig ist¹⁰ oder bei Einzelpartikelanalyseproben, die schlecht auf dem Kryogitter verteilt sind und die manuelle Auswahl jedes Erfassungspunkts durch den Benutzer^{erfordern 24. ( 25}) DER PRÄSIDENT. - Nach der 25 Schließlich erleichtert ein Ansatz, der auf der Offline-Verwendung einer Dummy-SerialEM-Instanz basiert, auch die Einrichtung von Erfassungspunkten durch Remote-Verbindung, indem die Notwendigkeit der physischen Anwesenheit des Benutzers am Mikroskop minimiert wird, wodurch mehr Flexibilität in Bezug auf die Betriebsorganisation der Anlage ermöglicht wird.

Die jüngsten Fortschritte in Technologie und Methoden für KryoET haben die Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit automatisierter Datenerfassungssitzungen drastisch verbessert. Es sind jedoch weitere Entwicklungen erforderlich, um die verbleibenden ratenbegrenzenden Schritte dieser Methode anzugehen. Vor allem der erste Schritt des Grid- und Square-Mappings wird nun zu einem der größten Engpässe des Sitzungsaufbaus, wodurch die Notwendigkeit von Hardwareverbesserungen entsteht, die darauf abzielen, die Geschwindigkeit der Mikroskop-Bühnenbewegungen und der Bildaufnahme durch die direkten Elektronendetektoren zu erhöhen. Darüber hinaus wird die Entwicklung von Maschinellen Lernansätzen zur vollständigen Automatisierung des Prozesses der Zielidentifikation von entscheidender Bedeutung sein, um die notwendigkeit der visuellen Inspektion der Benutzer für die Auswahl der interessierenden Regionen zu eliminieren, ein zeitaufwendiges Verfahren, das auf dem Fachwissen der Benutzer beruht.

Materialien

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