Einfache Inhouse-Herstellung von Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen mit dem FlashPack-Ansatz

Zusammenfassung

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für das optimierte FlashPack Kapillarsäulenpackungsverfahren vor. Die Anwendung eines optimierten Protokolls auf ein gängiges 100-bar-Druckbomben-Setup ermöglicht ein 10-mal schnelleres Verpacken und Herstellen von langen Ultra-Hochleistungs-Kapillarsäulen.

Zusammenfassung

Die kapillare Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie (UHPLC) ist derzeit eine Methode der Wahl für den Probentrennschritt in der LC-MS-basierten Proteomik. Kapillarsäulen sind jedoch im Vergleich zu ihren Gegentypen mit höherem Durchfluss viel weniger robust. Aufgrund der leichten Kontamination und Blockierung müssen sie oft ersetzt werden. Das macht sie zu einem ausgesprochen teuren Teil der gesamten LC-MS-Analysekosten. Das Inhouse-Verpacken von UHPLC-Kapillarsäulen spart viel Geld und ermöglicht eine Anpassung. Das Standard-Packverfahren in der 100-bar-Druckbombe funktioniert jedoch nur für HPLC-Säulen gut, ist aber für UHPLC-Sorbentien zu langsam. Hier finden Sie eine Beschreibung eines optimierten FlashPack-Protokolls, das auf dasselbe 100-bar-Druckbomben-Setup angewendet wird. Das Verfahren basiert auf der Verpackung aus Aufschlämmung mit extrem hoher Sorptionskonzentration und wurde für die inhouse-Fertigung von UHPLC-Kapillarsäulen unbegrenzter Länge in angemessener Zeit entwickelt.

Einleitung

Die moderne Proteomik basiert auf der flüssigkeitschromatographisch gekoppelten Massenspektrometrie mit der ultrahochleistungsstarken Nano-Flow-Chromatographie (50-150 μm Säuleninnendurchmesser (ID)) Trennung, die die beste Analysegeschwindigkeit und Sensitivität bietet¹. Während zahlreiche kommerzielle UHPLC-Kapillarsäulen verfügbar sind, macht ihr Preis einen großen Teil der Verbrauchsmaterialkosten aus, insbesondere wenn mehrere verschiedene Projekte im Labor durchgeführt werden und projektspezifische Säulenkontaminationen ein häufiges Problem darstellen. Darüber hinaus ermöglicht die Verpackung von Säulen im eigenen Haus die Verwendung von kundenspezifischen experimentspezifischen Sorbentien (wie z.B. PolyCAT-A-Sorbens²) und Säuleneigenschaften, die nicht als fertige Säule zum Kauf angeboten werden.

Um das zu bewältigen, verpacken viele Labore Kapillarsäulen im eigenen Haus. Das übliche Packungsverfahren mit einer 100 bar Druckbombe (Druckinjektionszelle)³ ist jedoch aufgrund des hohen Gegendrucks von UHPLC-Sorbentien unter 2 μm, was zu einer dramatischen Verringerung der Packungsrate im Vergleich zu größeren HPLC-Sorbentien führt, für die UHPLC-Säulenpackung ungeeignet. Während kurze UHPLC-Säulen immer noch sehr langsam gepackt werden können, ist die Herstellung langer UHPLC-Säulen physikalisch unmöglich⁴.

Die Standard-Kapillarsäulenpackung erfolgt bei relativ niedrigen Drücken von bis zu 100 bar und mit einer sehr niedrigen Sorptionsschlammkonzentration. Daher stehen zwei mögliche Richtungen zur Beschleunigung des Prozesses zur Verfügung. Es ist möglich, den Packungsdruck⁵zu erhöhen. Dies erfordert jedoch eine spezielle Ausrüstung und praktisch die Installation einer neuen Methode im Labor. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Sorptionsschlammkonzentration zu erhöhen⁶. Die Packung mit hoher Sorptionsaufschlämmkonzentration wird in Einer früheren^{Veröffentlichung beschrieben 7}in Kombination mit einem ultrahohen Packungsdruck. Bei einem Druck von 100 bar, der in den meisten der vorhandenen Packbomben verwendet wird, führt eine höhere Sorptionsmittelkonzentration jedoch entweder zu einer Verlangsamung der Packungsrate oder zur vollständigen Beendigung der Packung. Es wurde kürzlich gezeigt, dass der Effekt auf die Sorptionsmittelbündelung am Säuleneingang zurückzuführen ist, und ein einfacher Trick der sorptionsfähigen Kuppeldestabilisierung durch Hämmern des Säuleneingangs mit einer Magnetstange in einem Sorptionsmittelfläschchen wurde vorgeschlagen⁴. Die resultierende Methode mit dem Namen FlashPack verwendet das gleiche 100-bar-Druckbombenpackungs-Setup. Gleichzeitig ermöglichen geringfügige, aber kritische Änderungen im Verpackungsverfahren das Verpacken aus einer sehr hohen Sorptionsschlammkonzentration und die Herstellung sehr langer UHPLC-Säulen (50 bis 70 cm und länger) in weniger als einer Stunde, während eine kurze Säule in wenigen Minuten hergestellt werden kann, wobei die Trennqualität den handelsüblichen Säulen der gleichen Parameter entspricht⁴. Der FlashPack-Ansatz wurde bereits in mehreren Proteomik-Projekten zur Herstellung sowohl der Umkehrphase (RP)^8,9,10,^11,12,13,14 als auch der hydrophilen Wechselwirkung (HILIC)² Kapillarsäulen erfolgreich eingesetzt.

Hier beschreiben wir im Detail die Modifikationen, die für die Anpassung des FlashPack-Ansatzes an das Standard-100-bar-Druckbombenpackverfahren erforderlich sind.

Protokoll

Das Packprotokoll besteht aus fünf Schritten(Abbildung 1):1) Vorbereitung der Packstation, 2) Kapillarvorbereitung, 3) Vorbereitung der Sorptionsschlämme, 4) Kapillarpackung in der Druckbombe und 5) Säulenaufpackung im HPLC-System, Schneiden auf die Größe und UHPLC-Verbindungsinstallation. Die FlashPack-Optimierung erfordert Anpassungen in den Abschnitten 3 und 4 im Vergleich zum gemeinsamen Protokoll.

1. Montage der Packstation

1. Bereiten Sie einen Gastank vor, der entweder mit Stickstoff, Helium oder Argon gefüllt ist und mit einem einstufigen Gasregler mit einem Ausgangsdruck > 50 bar ausgestattet ist. Der maximale Druck wird durch die Druckbombenkompatibilität begrenzt.
2. Schließen Sie den Regler an das Entlüftungsventil der Druckbombe an.
3. Wenn die Druckbombe nicht mit einem integrierten Magnetrührer ausgestattet ist, platzieren Sie die Bombe auf einem Magnetrührer.
4. Schließen Sie einen schmalen ID-Kunststoffschlauch (z. B. 0,13 mm) an den Entlüftungsauslass der Druckbombe an und legen Sie ihn in einen Behälter mit Wasser.

2. Kapillarpräparation

1. Bereiten Sie eine gefrittene Kapillare mit einer integrierten Glasfritte aus Kasil und Formamid¹⁵ oder einer gezogenen Emitterkapillare vor, die durch einen Laserzieher¹⁶hergestellt wird. Die Kapillare ist 10-15 cm länger als die vorgesehene Säulenlänge.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Erörterung möglicher Probleme im Zusammenhang mit verschiedenen Kapillargrößen und Frittentypen. Tabelle 2 enthält ein Beispiel für ein P2000-Laserzieherprogramm zur Herstellung von Pulled-Emitter-Kapillaren.
2. Schützen Sie ein gezogenes Emitterende mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze mit Gelbeladung.
   1. Schneiden Sie die Spitze so, dass sie eng um die 360 μm OD-Kapillare passt (sie kann entlang der Kapillare bewegt werden, erfordert jedoch einige Anstrengungen).
   2. Schieben Sie die geschnittene Pipettenspitze aus Richtung des Kapillarvorderendes auf die Kapillare und bewegen Sie sie bis zum Emitterende.
   3. Schieben Sie die Schutzspitze zurück, wenn die Säule sprüht. Schieben Sie die Spitze nach vorne, um das Emitterende in der Spitze zu haben, wenn die Säule nicht sprüht (auch wenn sich die Säule unter dem Durchfluss befindet, aber immer noch nicht sprüht).

3. Sorptionsschlämmbereitung

1. Bereiten Sie eine Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor: Geben Sie ~ 50 mg trockenes Sorptionsmittel in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Hier wird Reprosil Pur C18 als Beispiel verwendet.
2. 1 ml Methanol in das Sorptionsröhrchen geben.
3. Um es vollständig zu mischen, wirbeln Sie das Rohr für 10 s mit einem Wirbelmischer.
4. Beschallung in einem Beschallungsbad für 10 s.
5. Lassen Sie das Sorptionsmittel 20-30 min gründlich einweichen. Dann wirbeln Sie es noch einmal und beschallen Sie es.
6. Bereiten Sie eine funktionierende Durchstechflasche mit Sorptionsmittel vor. Verwenden Sie eine konische Bodenfläschchen, die in die Bombe passt.
   HINWEIS: Es kann sich entweder um ein weiteres 1,5-ml-Zentrifugenrohr oder ein anderes Fläschchen handeln, abhängig von der jeweiligen Druckbombenkonstruktion. Für dieses Experiment wird ein konisches unteres Schraubverschlussrohr verwendet, das auf die Höhe der Druckbombe zugeschnitten ist.
7. Resuspendieren Sie das Sorptionsmittel in der Durchstechflasche mit Sorptionsmittel und geben Sie 500 μL in die Arbeits-Sorptionsflasche mit einer Magnetstange von 2 x 3 mm Größe.
8. Methanol bis zu ~ 1 ml in die Arbeitsflasche geben.
9. Lassen Sie das Arbeitsfläschchen 10 Minuten auf dem Tisch stehen, damit sich das Sorptionsmittel durch Schwerkraft absetzt.
10. Wenn die Sorptionsschicht nach dem Absetzen unter 4 mm liegt, fügen Sie mehr von der Sorptionsschlämme hinzu und warten Sie, bis sich das Sorptionsmittel für weitere 10 minuten abgesetzt hat.
    ANMERKUNG: Die vorbereitete Arbeitsfläschchen ist für die Vorbereitung mehrerer Säulen über Monate bestimmt. Wenn die Arbeitssubstechflasche länger als 2 h ohne Rühren bleibt, muss sie 10 s lang gewirbelt, 10 s lang beschallt und durch Schwerkraft abgesetzt werden. Routinemäßig wird das Sorptionsmittel am Morgen vor dem Packen resuspendiert. Dann ist es gut für das Packen für den ganzen Tag, wenn es keine langen Pausen zwischen dem sequentiellen Spaltenpacken gibt. Wenn das Sorptionsmittel in der Arbeitsfläschchen austrocknet, fügen Sie Methanol hinzu und führen Sie das vollständige Sorptionsmittelvorbereitungsverfahren wie bei der Durchstechflasche mit Stammsorbens durch (Schritte 3.2-3.5).

4. Kapillarpackung in einer Druckbombe

ACHTUNG: Tragen Sie bei der Arbeit mit der Druckbombe immer eine Schutzbrille. Tragen Sie keine Handschuhe. Diese reduzieren den Tastsinn, der für den richtigen Umgang mit Kapillaren mit kleinem Durchmesser erforderlich ist, erheblich und führen zu Fehlern.

1. Legen Sie die Durchstechflasche in die Druckbombe und befestigen Sie alle Muttern fest.
2. Starten Sie die Rotation mit 60-100 U / min.
3. Führen Sie die gestreue oder gezogene Emitterkapillare in die Bombe ein: Drücken Sie sie bis zum Boden der Durchstechflasche, heben Sie sie dann 2-3 mm hoch und befestigen Sie die Mutter.
   HINWEIS: Wenden Sie eine minimal erforderliche Kraft an, um die Kapillare zu fixieren, um Kapillar- und Ferrulenschäden zu vermeiden. Das Beste ist das Anziehen von Hand. Wenn ein Sechskantschlüssel verwendet wird, wenden Sie einen minimalen ausreichenden Kraftaufwand für das Anziehen an.
4. Überprüfen Sie, ob die Kapillare richtig fixiert ist - es muss unmöglich sein, die Kapillare zu bewegen, indem Sie sie von Hand herausziehen.
5. Öffnen Sie das Druckbombenventil sehr langsam, während Sie das offene Ende der Kapillare vom Gesicht weg zeigen.
6. Beobachten Sie die ersten Schritte des Verpackungsprozesses.
   HINWEIS: Unmittelbar nach der Druckbeaufschlagung füllt das Sorptionsmittel die Kapillare und wird für die gesamte Länge undurchsichtig. Sobald sich das Sorptionsmittel im distalen Ende einzupacken beginnt, nimmt der Gegendruck zu, der Fluss verlangsamt sich und die gleichmäßige Sorptionsschlämme in der Kapillare bildet sich in mehrere Sorptionsmittelpakete um, die durch sorptionsmittelfreie Lücken getrennt sind. Bereits gepacktes Sorptionsmittel ist als dicht gefärbtes, kontinuierlich wachsendes Gebiet sichtbar.
7. Halten Sie die mit Sorptionsmittel gefüllten Bereiche während der gesamten Dauer des Verpackungsprozesses mindestens 70% der Kapillarlänge mit kleinen sorbentienfreien Lücken.
8. Es gibt mehrere häufige Probleme, die während des Verpackungsprozesses zu beachten sind, die eine Anpassung des Setups während des Fluges erfordern, um eine effiziente Sorptionsmittelabgabe in die Kapillare zu gewährleisten.
   ANMERKUNG: Weitere Einzelheiten zur Einstellung der Sorptionsmittelabgabeeffizienz sind in Tabelle 3 beschrieben.
   1. Problem 1: Wenn das neue Sorptionsmittel nicht mehr in die Kapillare gelangt, während sich das bereits im Inneren befindliche Sorptionsmittel weiter bewegt, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      HINWEIS: Dies ist das häufigste Problem. In den meisten Fällen wird der Kapillareingang durch selbstaggregierende Sorptionscluster blockiert. Wenden Sie die folgenden Schritte nacheinander an, bis der Sorptionsmittelfluss wiederhergestellt ist, und überspringen Sie dann die restlichen problembezogenen Schritte.
      1. Erhöhen Sie die Drehzahl auf 500 U / min und reduzieren Sie sie sofort wieder auf 60-100 U / min. Normalerweise stellt es den Sorptionsmittelfluss wieder her. Überprüfen Sie die Drehzahl für den Rest des Verpackungsprozesses auf mindestens 60 U / min.
      2. Wenn es nicht hilft, entlüften Sie die Packbombe kurz und setzen Sie sie sofort wieder unter Druck.
      3. Wenn es nicht hilft oder die Blockierung erneut auftritt, positionieren Sie die Kapillare innerhalb der Sorptionsschicht neu. Das Fehlen des Sorptionsmittels kann darauf zurückzuführen sein, dass das offene Kapillarende entweder zu hoch über der Magnetstange liegt, so dass das Säulenende es nicht berührt, oder dass die Kapillare in den Boden der Durchstechflasche einklebt. Entlüften Sie zuerst die Bombe vollständig, lösen Sie die Mutter, drücken Sie die Kapillare nach unten und ziehen Sie sie dann 2 mm zurück. Befestigen Sie die Mutter.
      4. Wenn die Blockierung anhält, entlüften Sie das System, nehmen Sie die Durchstechflasche und den Wirbel heraus und beschallen Sie es erneut. Überprüfen Sie das kapillare frontale Ende auf Beschädigungen unter dem Mikroskop und schneiden Sie bei Bedarf ~ 5 mm des vorderen Endes ab.
   2. Problem 2: Wenn das Sorptionsmittel nur einen kleinen Teil der Kapillare mit langen leeren Bereichen füllt, führen Sie die folgenden Schritte aus.
      1. Überprüfen Sie die Drehzahl. Wenn die Rotation zu langsam ist, ist der Kuppelbruch nicht effizient genug. Erhöhen Sie die Drehzahl auf ~150 U/min.
      2. Wenn die Rotation zu schnell ist, wird das Sorptionsmittel in das größere Fläschchenvolumen resuspendiert und die lokale Sorptionsmittelkonzentration um den Säuleneingang ist niedrig. Verlangsamen Sie die Drehzahl auf 60-100 U / min.
      3. Überprüfen Sie den Sorptionsmittelspiegel. Das gleiche Problem mit wenig Sorbens in der Kapillare wird beobachtet, wenn nicht genügend Sorptionsmittel in der Durchstechflasche vorhanden ist. Wenn das Sorptionsmittel aufgebraucht ist, füllen Sie die Durchstechflasche mit dem neuen Sorptionsmittel, um die Sorptionsschicht nach schwerkraftinduziertem Absetzen nicht weniger als 4 mm hoch zu halten.
9. Packen Sie die Säule weiter, bis die Zielsäulenlänge plus 5-7 cm erreicht ist.
10. Stoppen Sie die Rotation und verringern Sie die Bombe sehr langsam.
    1. Öffnen Sie das Bombenventil ein wenig und warten Sie, bis die Blase in der Wasserflasche platzt. Öffnen Sie dann das Ventil etwas weiter und warten Sie erneut, bis die Blase platzt.
    2. Geben Sie den Druck in Schritten ab, bis kein Gas mehr aus dem Ventil austritt.
       HINWEIS: Öffnen Sie das Ventil nicht ganz auf einmal - es führt zu einem Blubbern in der Kapillare und dem Sorptionsmittel, das zurück in die Durchstechflasche gelangt. Wenn das passiert, setzen Sie die Bombe unter Druck und warten Sie, bis die Säule wieder gepackt ist.
11. Wenn das Gas nicht mehr aus dem Entlüftungsventil kommt, nehmen Sie die gepackte Kapillare aus der Druckbombe.
    HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht austrocknen. Wenn sie nicht sofort zur weiteren Verpackung an das HPLC-System angeschlossen sind, lagern Sie die verpackte Kapillare ein, indem Sie sie vollständig in 10% ige EtOH-Lösung tauchen. Ein flüssigkeitsdichter Lebensmittelbehälter aus Polypropylen kann für die Kapillarlagerung verwendet werden. Getrennte HPLC-Säulen werden auf die gleiche Weise gespeichert.
12. Wenn keine weitere Verpackung geplant ist, nehmen Sie das Sorptionsmittel aus der Bombe heraus und verschließen Sie es fest. Bewahren Sie es für weitere Säulenverpackungen auf.

5. Verpackung in der HPLC-Säule

1. Verbinden Sie die gepackte Kapillare über eine HPLC-Verbindung mit dem HPLC-System.
2. Beginnen Sie den Durchfluss mit 95% Lösungsmittel B (80 oder 100% Acetonitril, 0,1% Ameisensäure (FA)) mit einem Druck von 250-300 bar. Für 40 cm gepackte Kapillare verwenden Sie die Durchflussrate von 200-300 nL / min.
   HINWEIS: Der Packungsdurchfluss beträgt 200 nL/min für eine 40-50 cm Säule mit 100 μm ID, verpackt mit 2 μm Sorbens. Einige andere Spaltengrößen sind in Tabelle 4aufgeführt. Durchflussraten für andere Säulenlängen und IDs werden aus der direkten Proportionalität zwischen dem Gegendruck und der Säulenlänge und dem Querschnitt geschätzt. Die genaue Durchflussmenge wird an die tatsächliche Packlänge angepasst, die standardmäßig länger ist als die angestrebte Spaltenlänge. Beachten Sie auch, dass der Druck von 300 bar auf die physikalische Druckgrenze der HPLC-Verbindung abzielt. Für Verbindungen mit höherem Druck sind höhere Durchflussmengen bis zur Anschlussdruckgrenze für ein schnelleres Packen zu verwenden.
3. Achten Sie darauf, dass das lose Sorbens in der Kapillare verpackt und zur Gesamtpacklänge hinzugefügt wird.
4. Ohne den Fluss zu stoppen, tauchen Sie den Säulenkörper zweimal in das Beschallungsbad ein.
   HINWEIS: Tauchen Sie Säulenenden und Kapillarverbindungen nicht ein - nur einen Teil des Säulenkörpers. Der Ultraschallschritt trägt zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Säulen bei, insbesondere bei extrem langen Säulen >50 cm Länge (unveröffentlichte Daten); Es fügt jedoch eine zufällige Chance hinzu, die sich selbst zusammensetzende Sorptionsköder fritte innerhalb des Emitterendes der gezogenen Emitterkapillare zu brechen und die Säule vollständig zu blockieren. Während die Beschallung universell auf jede glasbedeckte Säule angewendet werden kann, empfehlen wir, gezogene Emittersäulen nur für die Säulenlänge > 50 cm zu beschallen.
5. Wenn das Sorptionsbett aufhört zu schrumpfen, tauchen Sie den Säulenkörper noch zweimal in das Beschallungsbad ein, ohne den Fluss zu stoppen.
6. Führen Sie die Säule weitere 10 Minuten bei 300 Balken aus.
7. Stoppen Sie den Durchfluss, warten Sie, bis der Druck auf unter drei bar gesunken ist, und trennen Sie die Säule.
8. Überprüfen Sie die Säule visuell auf fehlende Lücken und Verfärbungen. Wenn welche gefunden werden, kann die Beschallung unter der Strömung wiederholt werden. Erwägen Sie für kritische Experimente, eine neue Spalte zu erstellen.
9. Schneiden Sie die Spalte auf die gewünschte Länge aus.
   HINWEIS: Richtig ausgeführtes Schneiden ist eine Voraussetzung für die Säuleneffizienz. Machen Sie eine Kerbe in Polyimidbeschichtung mit dem Schreiber, knacken Sie teilweise die Kapillare und ziehen Sie zwei Stücke auseinander.
10. Polieren Sie die Säulenfront auf einem Keramikwafer oder mit Läppfolie.
11. Schließen Sie die Säule über eine UHPLC-Verbindung wieder an das LC-System an.
12. Beginnen Sie die Arbeitsflussrate bei 2% B in Abhängigkeit von der Spalten-ID gemäß Tabelle 4. Warten Sie, bis sich der Druck ausgeglichen hat, und überprüfen Sie den Säulengegendruck.
    HINWEIS: Der Arbeitsdurchfluss wird entsprechend den Spaltenparametern angepasst. Beispielsweise wird eine 30 cm lange 100 μm ID-Säule mit 500 nL/min betrieben.
13. Stellen Sie sicher, dass der Gegendruck innerhalb von 5 % des erwarteten Wertes liegt (siehe Tabelle 5),um zu bestätigen, dass die Spalte ordnungsgemäß gepackt und einsatzbereit ist.
    HINWEIS: Der Säulengegendruck ist der Gesamtdruck im Gradientenkanal des HPLC-Systems mit angeschlossener Säule abzüglich des Gegendrucks der Kapillaren vor der Säule. Gleichzeitig sind die Werte in Tabelle 5 willkürlich (sie geben eine beliebige Skala dessen an, was zu erwarten ist). Die laborinterne Ähnlichkeit des Gegendrucks von Säule zu Säule ist ein wichtigerer Indikator dafür, dass alles richtig funktioniert. Der tatsächliche absolute Gegendruck hängt von vielen Parametern ab, wie z.B. der Sorptionsmittelgröße und -eigenschaften, der Kapillar-ID, Hersteller und Charge, der Form des gezogenen Emitterendes oder der Dichte und Länge der Glasfritte, den Lösungsmitteleigenschaften und der Umgebungstemperatur im Raum usw. Wenn der Gegendruck zu hoch ist, siehe Tabelle 1 für mögliche Probleme.

Ergebnisse

Der FlashPack-Ansatz basiert auf dem Standardverpackungsaufbau und folgt der gleichen Verpackungspipeline. Die Verpackung erfolgt in Standard-Fritt- oder Pulled-Emitter-Kapillaren. Die Hauptoptimierung liegt in der Sorptionsschlammkonzentration: Die Standardmethode ist mit einer hochkonzentrierten Sorptionsmittelsuspension, die in FlashPack verwendet wird, unvereinbar. Das Ergebnis ist ein schnelles Herstellungsverfahren für lange UHPLC-Säulen, beispielsweise eine Säule, die für 50 cm Länge mit 1,9 μm Sorptionsmittel in weniger als 1 h verpackt ist (Abbildung 2).

Um die Anwendung des FlashPack-Ansatzes zu demonstrieren, wurde eine 30 cm 100 μm ID-Kapillarsäule hergestellt (Tabelle 6). Die Verpackung des ReprosilPur C18 1,9 μm Sorptionsmittels erfolgte bei 60 bar in eine 50 cm lange 100 μm ID gezogene Emitterkapillar, die von einem P2000 Laserzieher hergestellt wurde. Die Kapillare wurde in 40 Minuten auf ~ 40 cm gepackt, wobei etwas mehr loses Sorptionsmittel in der Kapillare verbleibt. Die verpackte Kapillare wurde an ein HPLC-System angeschlossen und mit 300 nL/min mit Lösungsmittel B (80% Acetonitril, 0,1% FA) betrieben. Nach zwei Runden à 5 s Beschallung betrug die endgültige Packlänge 43 cm. Die Säule wurde abgeschaltet, auf 30 cm zugeschnitten und über einen UHPLC-Anschluss mit dem HPLC-System verbunden. Wir verwenden routinemäßig 360 μm ärmellose PEEK-Mutter-Ferrule und 360 μm Edelstahlunion. Diese Kombination hält bei starker Straffung mindestens bis zu 700 Stangen. Die hergestellte Säule hat einen Gegendruck von 520 bar bei 2% Lösungsmittel B bei 500 nL/min, was mit dem Erwartungswertbereich übereinstimmt (Tabelle 5).

Als Demonstration der Säuleneffizienz verwendeten wir die hergestellte 30 cm Säule, um 50 fmol eines tryptischen Digests von Cytochrom C-Protein in einem 15-minütigen Gradienten von 2% bis 50% B zu trennen. Die durchschnittliche FWHM lag bei etwa 3 s (Abbildung 3).

Tabelle 1: Fehlerbehebung bei hohem Arbeitsgegendruck der Spalte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: P2000/F Laserabziehprogramm. P2000/F Laser-Puller-Programm zur Herstellung von gezogenen Emitterkapillaren aus 360 μm OD 100 μm ID Quarzglas-Polyimid-beschichtete Kapillaren ohne Innenbeschichtung bei Raumtemperaturen 23-25 °C. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: FlashPack-spezifische Verpackungsprobleme und Kontrollpunkte, die während des Verpackungsprozesses zu kontrollieren sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Beispielhafte Packungs- und Arbeitsstromraten für verschiedene Spalten-IDs und Längen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 5: Erwarteter Gegendruck für eine Säule, die mit 2 μm kugelförmigen Sorbentien gefüllt ist und mit der Arbeitsflussrate (gemäß der Spalten-ID) im RP-Lösungsmittelsystem bei RT betrieben wird.

Tabelle 6: Beispielhafte Verpackung der 30 cm UHPLC-Säule. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 1: Packungsschema der Kapillarsäule. Die Stufen 1 bis 3 sind vorbereitend, gefolgt von der Druckbombenverpackung und der HPLC-Verpackung. Die Stufen 3 und 4 sind für das hocheffiziente FlashPack-Protokoll modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Packrate für eine gefrittene Kapillare 100 μm ID mit ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm bei 100 bar Methanol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Extrahierte Ionenchromatogramme von tryptischen Peptiden von Cytochrom C. Extrahierte Ionenchromatogramme von tryptischen Peptiden von Cytochrom C nach Abtrennung von 50 fmol in 30 cm langen 100 mm ID zogen emitterkapillare Säule gepackt mit ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm in einem Gradienten von Puffer B (80% Acetonitril, 0,1% FA) und in Puffer A (2% Acetonitril, 0,1% FA) von 2% auf 40% B in 15 min bei 500 nL/min bei RT. Der Nachweis erfolgte mit einem Massenspektrometer. Absolute Intensitäten und extrahierte m/z-Bereiche für jedes Peptid sind rechts neben den Spektren dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Die hauseigene Kapillarsäulenpackung ist in großen Labors, die an mehreren unabhängigen Projekten arbeiten, sehr beliebt. Eine übliche Packungsmethode aus einer niedrig konzentrierten Sorptionsmittelsuspension hat jedoch große Einschränkungen in der Geschwindigkeit und ist nicht in der Lage, lange UHPLC-Säulen herzustellen.

FlashPack ist eine Modifikation des Standardverpackungsverfahrens, die das Verpacken ab einer sehr hohen Sorptionsmittelkonzentration ermöglicht. Die theoretische Grundlage der Methode liegt in der kontinuierlichen Sorptionsmittelkuppeldestabilisierung am Säuleneingang über die gesamte Packdauer. Letzteres wird technisch dadurch erreicht, dass der Säuleneingang kontinuierlich mit einer Magnetstange getroffen wird. Die Methode der Kuppeldestabilisierung wurde absichtlich entwickelt, um den Verpackungsaufbau dem üblichen Verpackungsprozess völlig ähnlich zu machen, aber der Trick von FlashPack liegt in den Details der Sorptionsschlammvorbereitung, der Kapillarpositionierung und der Magnetstabverwendung während des Verpackungsprozesses.

Die Sorptionsschlämme wird als Sedimentsorptionsschicht in einem großen Lösungsmittelvolumen hergestellt. Es ist interessant, dass die druckbombenbasierte Packung nicht die gleichen Packungsbedingungen für Kolonne zu Kolonne erfordert. In FlashPack kennen wir nie die genaue Sorptionsschlammkonzentration um den Säuleneingang. Es ist unmöglich, genau zu messen und zu kontrollieren, da es sich auch während des Verpackungsprozesses ändert. Die letzten Säulen sind jedoch immer noch sehr reproduzierbar^4, unabhängig davon, wie die Packung erreicht wurde.

Die Basis für die schnelle Verpackung liegt in der effizienten Sorptionsmittelkuppeldestabilisierung. Aus diesem Grund ist es wichtig, das eindringende Sorptionsmittel in die Kapillare zu kontrollieren und die optimalen Kuppeldestabilisierungsbedingungen während der gesamten Packungsdauer aufrechtzuerhalten. Es gibt mehrere mögliche Probleme, die eine effiziente Sorptionsmittelabgabe verhindern können. Einige Beispiele hierfür sind die Resuspension der Sorptionsschicht durch schnelle Magnetstabrotation, eine ineffiziente Kuppeldestabilisierung aufgrund einer falschen relativen Kapillarpositionierung zur Magnetstabpositionierung oder eine zu langsame Magnetstabrotation. Die Probleme selbst und wie sie angegangen werden sollen, werden im Protokollabschnitt ausführlich diskutiert.

Nachdem die Spalte gepackt wurde, ist der wichtigste zu überprüfende Spaltenparameter der Spaltenrückdruck. Die in Tabelle 5 aufgeführten Druckwerte bieten einen Bezugspunkt zu dem, was für eines der beliebten Sorptionsmittel reproSil PUR C18 AQ (1,9 μm) unter 2 μm der Perlengröße erwartet wird. Gleichzeitig kann zusätzlicher Gegendruck durch die Fritte oder einen zu eng gezogenen Emitter hinzugefügt werden, und darauf sollte man ständig achten. Wenn das Packen in einen gezogenen Emitter erfolgt, empfehlen wir dennoch, den erwarteten Säulengegendruck für das jeweilige verwendete Sorptionsmittel zu messen, indem zuerst gefrittene Kapillaren verpackt werden und dann zu sehen, ob die selbstorganisierende Fritte zu viel hinzufügt. Verwenden Sie bei Hochdruckproblemen die Richtlinien in Tabelle 1, um das Problem zu ermitteln.

Nach unserer Erfahrung funktioniert eine gepackte Säule ohne Verfärbungen, Lücken und mit dem richtigen Gegendruck in 100% der Fälle und gibt die Trennqualität nahe an dem, was von der Säulenlänge und den Sorptionseigenschaften erwartet werden kann. Eine Säule mit Verfärbungen funktioniert nicht garantiert richtig, kann aber dennoch zufriedenstellende Ergebnisse liefern.

Wenn es Probleme mit der Trennqualität gibt, kommen sie meistens nicht von der Säule selbst, sondern von anderen Teilen des Trennsystems, nämlich Pumpen, Lösungsmitteln oder Anschlüssen. Besonders potenziell schädlich sind alle Post-Spalten-Verbindungen. Eine schlechte Verbindung mit einem toten Volumen zwischen dem Emitter und der gefrittenen Säule führt aufgrund sehr niedriger Durchflussraten in der Kapillarchromatographie zu einer starken Peakverbreiterung und Tailing.

Ein weiteres wichtiges Problem, das für den FlashPack-Ansatz spezifisch ist, ist, dass es viele teure Sorbentien in einem funktionierenden Sorptionsschlammfläschchen verwendet. Bitte beachten Sie, dass die Sorptionsschlämme in FlashPack für den Mehrfachgebrauch vorgesehen ist. Achten Sie auf das Sorptionsmittel. Vermeiden Sie unnötiges Rühren der Magnetstange, um das Schleifen von Sorptionsmitteln zu reduzieren - denken Sie daran, die Rotation zu stoppen, sobald die Verpackung fertig ist. Und lassen Sie das offene Sorptionsmittelfläschchen nicht in der Druckbombe, um eine Sorptionstrocknung zu vermeiden. Obwohl das Sorptionsmittel danach noch verwendet werden kann, braucht es Zeit, um die Sorptionsschlämme neu zu machen.

Die Methode funktioniert sowohl für gefrittene Kapillaren als auch für Pulled-Emitter-Kapillaren gleichermaßen gut. Das FlashPack-Prinzip erhöht die Packungsrate für Kapillar-IDs von 20 auf 250 μm (kleinere und größere wurden nicht getestet). Es ist auch auf alle Sorbentien anwendbar, sowohl vollständig als auch oberflächlich porös, die wir testen könnten (was zeigt, dass die Sorptionsmittelkuppelbildung in hoher Sorptionsschlammkonzentration nicht speziell auf RP-Sorbentien beschränkt ist). Außerdem beeinflussen Lösungsmittelparameter die Verpackung eindeutig entsprechend ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften. Zum Beispiel ergibt weniger viskoses Aceton eine noch höhere Packungsrate als Methanol bei gleichem Packungsdruck. Es ist jedoch auch weniger polar als Methanol und reduziert Sorptionspartikel, die aneinander haften. Der Effekt allein verhindert die Bildung von Sorptionskapulen zu Beginn der Packung, wenn die Durchflussrate noch hoch ist. Die Verringerung der Wechselwirkung mit Sorptionspartikeln führt jedoch auch zu einer weniger zuverlässigen selbstorganisierenden Frittenbildung und einer häufigeren Pulled-End-Blockierung während der Packung. Während Aceton also besser zum Verpacken von gesrittenen Kapillaren geeignet ist, ist es weniger für Pulled-Emitter-Kapillaren geeignet, wobei das Methanol als Güllelösungsmittel langsamer, aber für beide Arten von Enden geeignet ist. Packungen aus Hexan oder Dichlormethan (DCM) sind extreme Fälle der Umstellung auf Aceton von Methanol: Sie sind noch weniger polar, so dass sie die Bildung von Sorptionskapolen vollständig verhindern, jedoch überhaupt nicht für die Pulled-Emitter-Packung geeignet sind. Außerdem wurde festgestellt, dass eine extrem niedrige DCM-Polarität dazu führt, dass Sorptionspartikel an der inneren Kapillarwand haften bleiben und eine dicke Schicht darauf bilden. Die Schichtdicke wächst allmählich und es bilden sich zufällige lokale Blöcke, was dazu führt, dass die Säule in mehreren Teilen verpackt ist, die durch Regionen ohne Sorptionsmittel getrennt sind. Ein solcher Effekt wurde für das C18-Peptid-Aeris-Sorbens beobachtet.

Ein weiteres beobachtetes Problem war, dass das YMC Triart C18-Sorptionsmittel nicht richtig in Methanol suspendiert wurde, sondern eine Art Flocken bildete. Das hindert es jedoch nicht daran, mit dem FlashPack vollgepackt zu werden und eine sehr anständige Trenneffizienz (unveröffentlichte Daten) zu erzielen. Obwohl Methanol für einige Fälle nicht optimal war, war es das universellste Lösungsmittel, das für alle getesteten Sorbentien und Säulen geeignet war. Es ist notwendig zu erwähnen, dass wir noch nicht analysiert haben, wie sich verschiedene Schlammlösungsmittel auf die Säulenabscheideeffizienz auswirken. Gleichzeitig ist der Wirkungsgrad von aus Methanol gepackten Säulen bereits völlig gleichbedeutend mit handelsüblichen Säulen für die gleichen Sorbentien⁴.

FlashPack ist nicht der einzige bestehende Ansatz zur Verbesserung der Packrate von UHPLC-Säulen. Eine schnelle Packung aus hoher Sorptionsschlammkonzentration ist auch mit der Verwendung der Ultrahochdruckpackung⁷möglich. Der Vorteil von FlashPack ist, dass es viel einfacher ist, da es keine speziellen Ultrahochdruckpumpen und Druckbomben für die Sorptionsmittelabgabe und Kapillarverbindungen benötigt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass die säulen, die bei extremen Drücken gepackt sind, eine höhere Abscheideleistung aufweisen können als kolonsierte Kolonnen mit niedrigerem Druck¹⁷. Und während FlashPack Spalten produziert, die mit den im Vergleich⁴verwendeten Spalten identisch sind, für die wir die Verpackungsmethode nicht kennen, wurde noch nicht getestet, wie FlashPack-Säulen gegen Ultrahochdruck-Packsäulen bestehen.

Zusammenfassend lässt sich die beschriebene FlashPack-Methode mit einigen Anpassungen am Protokoll leicht an das bestehende Packprotokoll im Labor anpassen, während das Setup völlig gleich bleibt. Es beschleunigt die Packung der HPLC-Kapillarsäule auf Minuten und ermöglicht die Herstellung langer UHP-Kapillarsäulen, was mit dem Standardverpackungsverfahren schlichtweg unmöglich ist. Die Gesamtwirtschaftlichkeit in Zeit und Geld für das Labor durch die Anwendung des FlashPack-Ansatzes kann in Zehntausenden von Euro pro Jahr gezählt werden. Darüber hinaus eröffnet die Fähigkeit, UHP-Kapillarsäulen lokal herzustellen, die Möglichkeiten der Experimentanpassung, die mit den verfügbaren kommerziellen Produkten unmöglich sind.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid	Merck	1.59002
centrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer	Restek	20116	any ceramic wafer is suitable for capillary polishing
Diamond-chip bladed scribe	NewObjective	Diamond-chip bladed scribe	recommended for capillary cutting
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD	CM Scientific	TSP100375
GELoader tips	Eppendorf	30001222
HPLC system	ThermoScientific	Ultimate3000 RSLCnano
laser puller	Sutter	P2000/F
magnet bar 2x5 mm	Merck	Z283819
MeOH	Merck	1.06018
microspatula	Merck	Z193216
PEEK ferrule 360 mm	VICI	JR-C360NFPK	use to connect the column to UPLC union
pipette tip, 1000 uL	Merck	Z740095
pipette, 1000 uL	Gilson	Pipetman L P1000L
pressure bomb	NextAdvance	PC-77 MAG
regulator	GCE	Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm	Dr. Maisch	r13.aq.0001
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL	Merck	AXYST050SS
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL	Merck	AXYST150SS
Screw caps with O-rings	Merck	AXYSCOC
sonication bath	Elma	Elmasonic S30 H
union HPLC	VICI	JR-C360RU1PK6	HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
union UPLC	VICI	JR-C360RU1FS6	UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
vortex	BioSan	V-1plus
Water with 0.1% (v/v) Formic acid	Merck	1.59013