Bewertung von L-DOPA-induzierten Dyskinesien im einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Zusammenfassung

Nagetiermodelle von L-DOPA-induzierten Dyskinesien sind unschätzbare Werkzeuge, um therapeutische Interventionen zu identifizieren, um die Entwicklung abzuschwächen oder die Manifestationen zu lindern, die aufgrund der wiederholten Verabreichung von L-DOPA auftreten. Dieses Protokoll zeigt, wie dyskinetische Bewegungen im einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell der Parkinson-Krankheit induziert und analysiert werden können.

Zusammenfassung

L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LIDs) beziehen sich auf motorische Komplikationen, die durch eine längere L-DOPA-Verabreichung an Patienten mit Parkinson-Krankheit (PD) entstehen. Das häufigste Muster, das in der Klinik beobachtet wird, ist die Spitzendosis-Dyskinesie, die aus klinischen Manifestationen von choreiformen, dystonischen und ballistischen Bewegungen besteht. Das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) Rattenmodell von PD ahmt mehrere Eigenschaften von LIDs nach. Nach wiederholter L-DOPA-Verabreichung zeigen 6-OHDA-läsionierte Ratten dyskinetische Bewegungen (z. B. abnormale unwillkürliche Bewegungen, AIMs). Dieses Protokoll zeigt, wie AIMs bei 6-OHDA-läsionierten Ratten mit 90%-95% dopaminerger Depletion im nigrostriatalen Signalweg induziert und analysiert werden können. Wiederholte Verabreichung (3 Wochen) von L-DOPA (5 mg/kg, kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) kann die Entwicklung von AIM induzieren. Die Zeitverlaufsanalyse zeigt einen signifikanten Anstieg der AIMs nach 30-90 min (Peak-Dose-Dyskinesie). Nagetiermodelle von LIDs sind ein wichtiges präklinisches Instrument, um wirksame antidyskinetische Interventionen zu identifizieren.

Einleitung

Die Dopamin-Vorstufe L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) stellt die wirksamste Behandlung der motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD)¹ dar. Die L-DOPA-Therapie kann motorische Symptome im Zusammenhang mit PD lindern, verliert jedoch mit der Zeit an Wirksamkeit. Motorische Schwankungen wie "Abnutzungsschwankung" oder "Verschlechterung am Ende der Dosis" manifestieren sich klinisch als verkürzte Wirkungsdauer einzelner L-DOPA-Dosen². In anderen Fällen bestehen klinische Manifestationen aus langsamen Drehbewegungen und abnormalen Körperhaltungen (Dystonie)³ und treten auf, wenn der Dopaminspiegel niedrig ist (Off-Period-Dystonie)⁴. Auf der anderen Seite treten L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LIDs) auf, wenn der Dopaminspiegel im Plasma und im Gehirn hoch ist⁵.

LIDs erzeugen schwächende Nebenwirkungen, darunter motorische Komplikationen wie choreiforme, dystonische und ballistische^6-Bewegungen. Einmal etabliert, treten LIDs nach jeder L-DOPA-Verabreichung auf. Motorische Komplikationen treten bei 40% -50% der PD-Patienten auf, die sich 5 Jahre lang einer L-DOPA-Therapie unterziehen, und die Inzidenz steigt im Laufe der Jahre⁷. Obwohl die pathophysiologischen Mechanismen, die an der Entwicklung von LIDs bei Parkinson-Patienten beteiligt sind, noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sind das Ausmaß der dopaminergen Denervierung, die pulsatile L-DOPA-Verabreichung, nachgeschaltete Veränderungen in striatalen Proteinen und Genen sowie Anomalien in Nicht-Dopamin-Transmittersystemen Faktoren, die zur Entwicklung dieser unerwünschten Nebenwirkungen beitragen 6,8,9,10.

Das Neurotoxin 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) ist ein gut charakterisiertes Werkzeug zur Untersuchung von PD bei Nagetieren^11,12,13,14. Da 6-OHDA die Blut-Hirn-Schranke nicht überschreitet, muss es direkt in den nigrostriatalen Weg injiziert werden. 6-OHDA-induzierte dopaminerge Depletion ist konzentrations- und standortabhängig¹⁵. Die einseitige Verabreichung von 6-OHDA am medialen Vorderhirnbündel (MFB) kann bei Nagetieren schwere (>90%) nigrostriatale Schäden verursachen^16,17,18,19. Die chronische Verabreichung von L-DOPA an schwere einseitig 6-OHDA-läsionierte Nagetiere verursacht das Auftreten dyskinetischer Bewegungen, die als abnormale unwillkürliche Bewegungen (AIMs) bezeichnet werden. Dyskinetische Bewegungen bei Nagetieren haben ähnliche molekulare, funktionelle und pharmakologische Mechanismen im Zusammenhang mit LIDs bei Parkinson-Patienten⁵. Daher sind 6-OHDA-läsionierte Ratten²⁰ und Mäuse²¹ wertvolle präklinische Modelle zur Untersuchung von LIDs. Bei chronischer Behandlung (7-21 Tage) mit therapeutischen Dosen von L-DOPA (5-20 mg/kg) zeigen einseitig 6-OHDA-läsionierte Ratten und Mäuse eine allmähliche Entwicklung von AIMs, die die Vordergliedmaßen, den Rumpf und die orofazialen Muskeln kontralateral zur Läsion betreffen 17,18,19,20,22,23,24 . Diese Bewegungen zeigen sich in einem Zeitverlauf, der L-DOPA-induzierten Spitzendosis-Dyskinesien bei PD-Patienten²⁵ ähnelt und sind durch hyperkinetische Bewegungen und Dystonie^{gekennzeichnet 5}. AIMs werden normalerweise basierend auf ihrem Schweregrad (z. B. wenn ein bestimmtes AIM vorhanden ist) und ihrer Amplitude (z. B. gekennzeichnet durch die Amplitude jeder ^Bewegung) bewertet5,23,25.

6-OHDA-läsionierte Nagetiermodelle von LIDs zeigen Gesichtsvalidität (d.h. das Modell hat mehrere Merkmale, die dem menschlichen Zustand ähneln)5,11,26,27,28. Nagetier-AIMs, ähnlich wie bei Parkinson-Patienten, werden als hyperkinetische (Vordergliedmaßen und orolinguale) und dystone (axiale) Bewegungen angesehen²⁹ und ahmen Dyskinesie mit höchster Dosis nach. Auf molekularer und funktioneller Ebene teilen Nagetiermodelle viele pathologische Merkmale mit PD-Patienten⁵, wie z.B. die Hochregulierung von FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 und Serotonintransporter (SERT)^34,35 . In Bezug auf die prädiktive Validität zeigen Medikamente, die LIDs bei Parkinson-Patienten reduzieren (z. B. der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptorantagonist Amantadin), eine antidyskinetische Wirksamkeit im Nagetiermodell 22,36,37,38,39.

Die Bewertungsskala für Nagetier-AIM wurde basierend auf vier AIMs-Subtypen erstellt, darunter AIMs, die Kopf, Hals und Rumpf betreffen (axiale AIMs), hyperkinetische Vorderbeinbewegungen (Gliedmaßen-AIMs) und dyskinetisch-ähnliche orolinguale Bewegungen (orolinguale AIMs). Obwohl die kontralaterale Rotation (Lokomotiv-AIMs) auch bei einseitig läsionierten Nagetieren 20,22,23,25,40 vorhanden ist, wurde sie nicht als dyskinetische Bewegung bewertet, da sie möglicherweise kein spezifisches Maß für LIDs ^22,37,41 darstellt.

Hier werden wir beschreiben, wie dyskinetische Bewegungen (axiale, gliedmaßenartige und orolinguale AIMs) im schweren (>90%) einseitig 6-OHDA-läsionierten Rattenmodell von PD induziert und analysiert werden können. Wir haben unser Protokoll auf der Grundlage der bisherigen Literatur und unseres Laborfachwissens organisiert.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Fakultät für Philosophie, Naturwissenschaften und Literatur von Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5) durchgeführt.

1. 6-OHDA-Läsion

1. Verwenden Sie zu Beginn der Experimente (6 Wochen) männliche Ratten von Sprague-Dawley mit einem Gewicht von 200-250 g. Unterbringung der Tiere (2-3 pro Käfig) unter Standardlaborbedingungen (12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Licht an um 06:00 Uhr, temperaturgeführte Einrichtungen (22-24 °C), mit Futter und Wasser ad libitum.
   ANMERKUNG: Eine vollständige Beschreibung der Erzeugung schwerer 6-OHDA-läsionierter Ratten ist an anderer Stelle^{beschrieben 42}.
2. Akklimatisieren Sie die Tiere vor Beginn eines Versuchsverfahrens in geeigneter Weise.
3. Verabreichen (intraperitoneal, i.p.) den Noradrenalin-Transporterhemmer Imipramin (20 mg/kg, gelöst in 0,9%iger Kochsalzlösung) 30 min vor der Operation.
   HINWEIS: Die Verabreichung von Imipramin erhöht die 6-OHDA-Selektivität für dopaminerge Neuronen.
4. Ketamin / Xylazin (70/10 mg / kg) intraperitoneal verabreichen.
5. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch die mangelnde Reaktion auf die Zehenklemmung tief betäubt und in Bauchlage im stereotaktischen Apparat auf der Oberseite eines Heizkissens positioniert ist.
6. Entfernen Sie das Fell auf dem Kopf und desinfizieren Sie den Operationsbereich 3 mal, abwechselnd zwischen einem jodbasierten Peeling und Alkohol.
7. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt (ca. 1 cm) in der Region zu machen, in der die Mikroinjektion stattfinden wird.
8. Reinigen Sie die Schädelregion mit Wattestäbchen und stellen Sie sicher, dass Bregma und Lambda freiliegen.
9. Stellen Sie sicher, dass die stereotaktischen MFB-Koordinaten von Bregma^43,44,45 stammen: -4,3 mm vorder, 1,6 mm lateral (rechte Seite) und ^8,3 mm ventral (von der Dura mater).
10. Das 6-OHDA wird mit einer Rate von 0,4 μL/min (10 μg in 4 μl Kochsalzlösung mit 0,1% Ascorbinsäure) einseitig in das rechte mediale Vorderhirnbündel (MFB) mit einer 50-μL-Hamilton-Glasspritze verabreicht.
11. Am Ende der Operation vernähen Sie den Kopfhautschnitt und rehydrieren Sie das Tier mit warmer (~37 °C) steriler 0,9% Kochsalzlösung (~10 ml/kg, s.c.).
12. Nehmen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in einen erwärmten Erholungskäfig. Überwachen Sie, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist.
13. Beurteilen Sie die Wirksamkeit der dopaminergen Läsion 4 Wochen nach der Läsion mit einem Stepping-Test^46,47.
    HINWEIS: In diesem Test wird die Akinesie der Vordergliedmaße kontralateral zur Läsion durch die Anzahl der Anpassungsschritte mit der Vorderpfote kontralateral zur Läsion beurteilt. Ratten, die drei oder weniger Anpassungsschritte mit der kontralateralen Vorderbein aufweisen, werden in die Studie als mutmaßlich schwere 6-OHDA-läsionierte Ratten eingeschlossen⁴⁸.

2. L-DOPA chronische Behandlung

1. Beginnen Sie die chronische Behandlung am Montag, 4 Wochen nach der 6-OHDA-Läsion.
   HINWEIS: Da AIMs an 3 aufeinanderfolgenden Tagen pro Woche (Mittwoch, Donnerstag und Freitag) für 3 Wochen auf Video aufgezeichnet werden, wird empfohlen, die Behandlung am Montag zu beginnen.
2. Behandeln Sie die Ratten mit frisch zubereitetem L-DOPA (über subkutan (s.c.), 1 ml/kg) plus Benzerazidhydrochlorid (5 mg/kg bzw. 12,5 mg/kg) für 3 Wochen, einmal täglich von Montag bis Freitag⁴⁵.
   HINWEIS: Sobald AIMs eingerichtet sind, manifestieren sie sich bei jeder Verabreichung von L-DOPA. Daher ist die L-DOPA-Verabreichung 2-4 mal pro Woche nach der 3-wöchigen Induktionsphase ausreichend, um eine stabile Expression von AIM⁴⁸ aufrechtzuerhalten.

3. AIMs Aufzeichnung und Bewertung

1. Führen Sie Experimente zwischen 09:00 Uhr und 17:00 Uhr durch. Stellen Sie sicher, dass der Prüfer die Identität und die pharmakologische Behandlung der Ratten überhaupt nicht kennt.
2. Legen Sie die Ratte vorsichtig in einen transparenten Zylinder (20 cm Durchmesser x 40 cm hoch) und lassen Sie sie mindestens 15 Minuten akklimatisieren. Stellen Sie sicher, dass der Boden mit dem Bettzeug bedeckt ist. Spiegel müssen hinter dem Zylinder positioniert werden, damit der Experimentator das Tier aus allen möglichen Winkeln beobachten kann.
   HINWEIS: Wenn es mehr als eine Ratte pro Versuch gibt, verwenden Sie einen Zylinder für jede Ratte. Die Manipulation der Tiere zwischen den Sitzungen kann die Verhaltensanalyse beeinträchtigen.
3. Positionieren Sie eine hochauflösende Videokamera so, dass die Anzeige von axialen, gliedmaßenartigen und orolingualen AIMs begünstigt wird. Da unter diesen experimentellen Bedingungen ein Rotationsverhalten vorhanden ist, ermöglichen die Spiegel hinter dem Zylinder die Verfolgung von AIM in einem 360°-Winkel. Verwenden Sie ein Stativ oder befestigen Sie die Kamera direkt an der Bank.
   HINWEIS: Orolinguale AIMs können schwierig zu bewerten sein, insbesondere wenn es eine hohe Inzidenz von Rotationsverhalten gibt. Die Aufnahme von Videos mit der Kamera, die etwas unterhalb des Flugzeugs positioniert ist, in dem sich die Tiere in einem Winkel von 15 ° befinden, hilft, diesen Bewegungssubtyp zu beobachten.
4. Nehmen Sie das Tier vorsichtig aus dem Zylinder und verabreichen Sie L-DOPA (5 mg/kg kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid, s.c.).
5. Setzen Sie das Tier wieder in den Zylinder und starten Sie einen Timer, um AIMs nach der L-DOPA-Injektion zu verfolgen. Verwenden Sie eine Videokamera, um AIMs für 180 Minuten nach der Injektion von L-DOPA aufzuzeichnen. Obwohl die Analyse durch direkte Beobachtung des Tieres durchgeführt werden kann, wird das Offline-Scoring bevorzugt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Timer auch auf Video aufgezeichnet wird, damit AIMs zu genauen Zeiten nach der L-DOPA-Verabreichung bewertet werden können.
6. Score AIMs in 30-Minuten-Intervallen bis zu 180 Minuten nach L-DOPA-Injektion (Definitionen siehe Tabelle 1), wie ursprünglich beschrieben^20,23. Die Ergebnisse müssen über 1-2 Minuten Epochen angegeben und als axial, gliedmaßen- oder orolingual klassifiziert werden (Abbildung 1).
7. Beobachten Sie sorgfältig alle AIM- und Attributwerte für Schweregrad und Amplitude. Anweisungen finden Sie in Tabelle 1 . Nehmen Sie keine normalen Verhaltensweisen wie Aufzucht, Schnüffeln, Pflege und Nagen in die Bewertung auf. Es wird insgesamt sechs Beobachtungsperioden geben (30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten).

SUBTYPEN

Axial: Torsion von Kopf, Hals und Rumpf

Extremität: unwillkürliche Bewegungen sowohl des distalen als auch des proximalen Vorderbeins

Orolingual: unwillkürliche Bewegungen der orofazialen Muskulatur

STRENGE

0: Nicht vorhanden

1: Gelegentlich (mit Unterbrechungen, in weniger als der Hälfte der Beobachtungszeit)

2: Häufig (mit Unterbrechungen, aber in mehr als der Hälfte der Beobachtungszeit vorhanden)

3: Kontinuierlich, aber unterbrochen durch äußere Sinnesreize

4: Kontinuierlich und nicht unterbrochen durch äußere Sinnesreize

AMPLITUDE

Axial

1: Torsion von Kopf und Hals in ca. 30° Winkel

2: Torsion von Kopf und Hals bei ca. 30° < Winkel ≤ 60°

3: Torsion von Kopf, Hals und oberem Rumpf bei ca. 60° < Winkel ≤ 90°

4: Torsion von Kopf, Hals und Rumpf in > 90°-Winkel, wodurch die Ratte oft das Gleichgewicht verliert

Glied

1: Kleine unwillkürliche Bewegungen des distalen Vorderbeins

2: Bewegungen mit niedriger Amplitude, die eine Translokation sowohl der distalen als auch der proximalen Vorderbeine verursachen

3: Unwillkürliche Bewegungen der gesamten Extremität, einschließlich der Schultermuskulatur

4: Starke Gliedmaßen- und Schulterbewegungen, oft ähnlich wie Ballismus

Orolingual

1: Kleine unwillkürliche Bewegungen der orofazialen Muskulatur

2: Orofaziale Bewegungen hoher Amplitude mit Zungenvorsprung

Tabelle 1: AIMS-Definition und Bewertungskriterien.

Abbildung 1: Sequenz von Fotos, die jeden AIM-Subtyp zeigen. (A bis A'") Axiales AIM mit dystonischen Bewegungen in verschiedenen Winkeln (A: 30° Winkel, A': 30° < Winkel ≤ 60°, A": 60° < Winkel ≤ 90° und A'": > 90° Winkel). (B bis B") Gliedmaße AIM (schwarze Pfeile), die unwillkürliche Bewegungen des distalen (B und B') und des gesamten Vorderbeins (einschließlich Schulter, B") zeigen. (C) Oringuales AIM (roter Pfeil) mit hoher Amplitude mit Zungenvorsprung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Datenanalyse

1. Berechnen Sie axiale, gliedrige oder orolinguale AIMs-Subtypen durch Multiplikation des Schweregrads und der Amplitudenwerte für jeden Beobachtungszeitraum nach der L-DOPA-Verabreichung (d. h. sechs Beobachtungsperioden), wie zuvor beschrieben²⁰. Die theoretische Höchstpunktzahl, die ein Tier in einer Testsitzung erreichen könnte, beträgt 240 (die maximale Punktzahl pro Beobachtungszeitraum beträgt 40, siehe Tabelle 1 für Details).
2. Zeichnen Sie AIMs-Werte für alle sechs Beobachtungszeiträume, die am Mittwoch, Donnerstag und Freitag über die 3 Wochen der chronischen L-DOPA-Verabreichung aufgezeichnet wurden (Abbildung 2). AIMs können summiert werden, um die maximale Punktzahl jedes Tieres an jedem Scoring-Tag (Abbildung 3) oder jede Woche (Abbildung 4) über die 3 Wochen der chronischen L-DOPA-Verabreichung anzugeben.
3. Überprüfen Sie, ob die Daten eine nahezu normale Verteilung aufweisen, bevor Sie den statistischen Analyseansatz auswählen.
   HINWEIS: AIMs Bewertungsskalen bestehen aus ordinalen Daten und können mit nichtparametrischen Statistiken analysiert werden. Parametrische Tests werden häufig verwendet, wenn AIM-Ergebnisse zwischen experimentellen Gruppen nach wiederholten Testsitzungen verglichen^{werden 40}.

Ergebnisse

Obwohl die bei Ratten beobachteten AIM-Muster im Vergleich zu denen bei Menschen und nichtmenschlichen Primaten einfacher und begrenzter sind, reproduziert dieses Modell sowohl hyperkinetische als auch dystonische Bewegungen, die durch chronische L-DOPA-Verabreichung induziert werden. Hier präsentieren wir Daten aus einer Gruppe (n = 10) von einseitig 6-OHDA-läsionierten Ratten, die 3 Wochen lang (Montag bis Freitag) chronisch mit L-DOPA (5 mg/kg kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) behandelt wurden. Beachten Sie, das...

Diskussion

Dieses Protokoll zeigt, wie AIMs im Rattenmodell von PD induziert und analysiert werden können, die durch einseitige Mikroinjektion von 6-OHDA in das MFB induziert werden. Die chronische tägliche Verabreichung niedriger Dosen von L-DOPA (5 mg/kg, kombiniert mit 12,5 mg/kg Benserazid) führte zur Entwicklung von AIM über die 3 Behandlungswochen. Die zeitliche Analyse ergab einen signifikanten Anstieg der AIMs, und die Dyskinesie mit der höchsten Dosis wird zwischen 30 und 90 Minuten nach der Verabreichung von L-DOPA b...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide	Sigma-Aldrich, USA	H6507	Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride	Sigma	B7283	Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B	HIKVISION	DS-2CE16C0T-IRP	Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride	Alfa Aesar	J63723	Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride	Ceva Animal Health		Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)	Cayman Chemical Company	16149	Dopamine precursor
Mirrors			Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm	PrecisionGlide		Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl)	Samtec		Salt
Syringes 1 ml Sterile	BD Plastipak		Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders			Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride	Ceva Animal Health		Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention