Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll und einen Workflow zur Durchführung der Zweifarb-Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET) vor, um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen. Im zweifarbigen FCCS, bei dem die Fluktuationen der Fluoreszenzintensität den dynamischen "Fingerabdruck" des jeweiligen fluoreszierenden Biomoleküls darstellen, können wir die Co-Diffusion oder Bindung der Rezeptoren untersuchen. FRET mit seiner hohen Empfindlichkeit gegenüber molekularen Abständen dient als bekannter "Nanoruler" zur Überwachung intramolekularer Veränderungen. Zusammengenommen werden Konformationsänderungen und Schlüsselparameter wie lokale Rezeptorkonzentrationen und Mobilitätskonstanten in zellulären Umgebungen zugänglich.

Quantitative Fluoreszenzansätze sind in Zellen aufgrund des hohen Rauschpegels und der Anfälligkeit der Probe eine Herausforderung. Hier zeigen wir, wie dieses Experiment durchgeführt werden kann, einschließlich der Kalibrierungsschritte mit zweifarbig markierten β2-adrenergen Rezeptor (β₂AR), die mit eGFP und SNAP-tag-TAMRA markiert sind. Ein Schritt-für-Schritt-Datenanalyseverfahren wird mit Open-Source-Software und Vorlagen bereitgestellt, die einfach anzupassen sind.

Unsere Leitlinie ermöglicht es Forschern, molekulare Wechselwirkungen von Biomolekülen in lebenden Zellen in situ mit hoher Zuverlässigkeit zu entschlüsseln, trotz der begrenzten Signal-Rausch-Werte in Lebendzellexperimenten. Das Betriebsfenster von FRET und insbesondere FCCS bei niedrigen Konzentrationen ermöglicht eine quantitative Analyse unter nahezu physiologischen Bedingungen.

Einleitung

Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine der wichtigsten Methoden zur Quantifizierung der Proteindynamik und der Protein-Protein-Wechselwirkungen mit minimaler Störung im zellulären Kontext. Die konfokale Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine der leistungsfähigen Methoden zur Analyse der Molekulardynamik, da sie einzelmolekülempfindlich, hochselektiv und lebendzellkompatibel ist¹. Im Vergleich zu anderen dynamikorientierten Ansätzen hat FCS einen breiteren messbaren Zeitbereich, der von ~ ns bis ~ s reicht und vor allem die schnellen Zeitskalen abdeckt, die für bildgebende Verfahren oft nicht zugänglich sind. Darüber hinaus bietet es auch räumliche Selektivität, so dass die Membran-, Zytoplasma- und Kernmoleküldynamik leicht unterschieden werden kann ². So können molekulares Blinken, die mittlere lokale Konzentration und der Diffusionskoeffizient quantitativ mit FCS analysiert werden. Intermolekulare Dynamik wie Bindung wird leicht zugänglich, wenn die Kodiffusion von zwei molekularen Spezies in der Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) -Analyse^3,4,5 in^einem zweifarbigen Ansatz untersucht wird.

Das Hauptprinzip der Korrelationsspektroskopie ist die statistische Analyse von Intensitätsschwankungen, die von fluoreszenzmarkierten Biomolekülen emittiert werden, die in einen Laserfokus ein- und ausdringen (Abbildung 1A). Die resultierenden Auto- oder Kreuzkorrelationsfunktionen können dann durch Kurvenanpassung weiter analysiert werden, um schließlich die Zinskonstanten von Interesse abzuleiten. Mit anderen Worten, die statistischen Methoden FCS und FCCS liefern keine Einzelmolekülspuren wie bei der Einzelpartikelverfolgung, sondern ein dynamisches Muster oder einen "Fingerabdruck" einer untersuchten Probe mit hoher zeitlicher Auflösung. In Kombination mit dem Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) können intramolekulare Dynamiken wie Konformationsänderungen gleichzeitig in einem gemeinsamen konfokalen Aufbau^5,6überwacht werden. FRET untersucht den Abstand von zwei Fluorophoren und wird oft als molekularer "Nanoruler" bezeichnet. Energietransfer findet nur statt, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähe befinden (< 10 nm), das Emissionsspektrum des Donors sich signifikant mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptormoleküls überschneidet und die Dipolorientierung von Donor und Akzeptor (ausreichend) parallel ist. Somit bietet die Kombination von FRET und FCCS eine Technik mit sehr hoher räumlich-zeitlicher Auflösung. Wenn räumliche Selektivität, Empfindlichkeit sowie Lebendzellkompatibilität erforderlich sind, hat FRET-FCCS einen offensichtlichen Vorteil gegenüber anderen Methoden wie der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC)^7,der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)⁸oder der Kernspinresonanz (NMR)^9,10 zur Messung der Proteindynamik und -wechselwirkungen.

Trotz der Fähigkeiten und des Versprechens der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (dc-FCCS) ist die Durchführung von dc-FCCS in lebenden Zellen aufgrund des spektralen Durchblutens oder Übersprechens zwischen den Kanälen^3,4, des Unterschieds in den konfokalen Volumina aufgrund der spektral unterschiedlichen Laserlinien 3^,4,11, Hintergrundsignal und Rauschen oder begrenzter Photostabilität der Proben technisch anspruchsvoll^{12. 13,14,15}. Die Einführung der pulsverschachtelten Anregung (PIE) in FCCS war eine wichtige Optimierung, um die verschiedenen Laseranregungen zeitlich zu entkoppeln, um das spektrale Übersprechen zwischen den Kanälen zu reduzieren¹⁶. Andere Korrekturmethoden zur Bekämpfung der spektralen Durchblutung^17,18,19 und Hintergrundkorrekturen wurden ebenfalls gut akzeptiert^17,18,19. Für Details und Grundlagen zu FCS, PIE oder FRET wird auf die folgenden Referenzen^{verwiesen 2,4,6,16,20,21,22,23,24}.

Hier werden alle notwendigen Kalibrierexperimente und Analysen zusammen mit den experimentellen Ergebnissen eines prototypischen G-Protein-gekoppelten Rezeptors, β 2-adrenergen Rezeptor (β₂AR), für drei verschiedene Szenarien vorgestellt: (1) einfach markierte Moleküle, die entweder eine "grüne" (eGFP) oder eine "rote" (SNAP-Tag-basierte Markierung)²⁵ Fluorophor tragen; (2) ein doppelt markiertes Konstrukt, das einen N-terminalen SNAP-Tag und intrazelluläres eGFP (NT-SNAP) trägt [in diesem Fall befinden sich beide Markierungen am selben Protein. Somit wird 100% Co-Diffusion erwartet]; und (3) eine doppelt markierte Probe, bei der sich beide Fluorophore auf derselben Seite der Zellmembran befinden (CT-SNAP). Es trägt einen C-terminalen SNAP-Tag und ein intrazelluläres eGFP. Auch hier sind beide Markierungen am selben Protein mit wiederum 100% Co-Diffusion zu erwarten. Da beide Markierungen sehr nahe beieinander liegen, auf der gleichen Seite der Zellmembran, zeigt es das Potenzial, FRET und antikorreliertes Verhalten zu beobachten. Alle Konstrukte wurden in Zellen des chinesischen Hamsterovary (CHO) transfiziert und später mit einem rot fluoreszierenden Substrat markiert, das für das NT-SNAP-Konstrukt membranundurchlässig und für das CT-SNAP-Konstrukt membrandurchlässig ist. Schließlich veranschaulichen simulierte Daten den Einfluss experimenteller Parameter auf die FRET-induzierte Antikorrelation und die Wirkung von Protein-Protein-Interaktionen auf die Co-Diffusionsamplitude.

Somit bietet dieses Protokoll eine vollständige Anleitung zur Durchführung des kombinierten FRET-FCCS in lebenden Zellen, um die Proteindynamik und die Protein-Protein-Interaktionen zu verstehen und gleichzeitig auf technische/physikalische Artefakte, Herausforderungen und mögliche Lösungen aufmerksam zu machen.

Protokoll

1. Versuchsprotokoll

1. Probenvorbereitung
   HINWEIS: Führen Sie die Zellsaat und Transfektion unter sterilen Bedingungen durch.
   1. Legen Sie einen gereinigten Deckglas pro Vertiefung in eine 6-Well-Kulturplatte und waschen Sie ihn dreimal mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
      ANMERKUNG: Das Deckglasreinigungsprotokoll ist in der Ergänzenden Anmerkung 1 beschrieben.
   2. Zu jeder Vertiefung werden 2 ml des gesamten Zellkulturmediums mit Phenolrot (ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) gegeben und die Platte beiseite gehalten.
   3. Kultivieren Sie die CHO-Zellen in demselben Medium, das Phenolrot bei 37 °C und 5%_{CO2 enthält.} Waschen Sie die Zellen mit 5 ml PBS, um die toten Zellen zu entfernen.
   4. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
   5. Verdünnen Sie die abgelösten Zellen mit 8 ml phenolrothaltigem Medium und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
   6. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer und säen Sie mit einer Dichte von 1,5 x 10⁵ Zellen/Well in der 6-Well-Zellkulturplatte, die die Deckgläser enthält (hergestellt in Schritt 1.1.1-1.1.2).
   7. Lassen Sie die Zellen 24 h in einem Inkubator (37 °C,_5%CO2) wachsen, um eine Konfluenz von ca. 80% zu erreichen.
   8. Verdünnen Sie 2 μg der gewünschten Vektor-DNA (z. B. CT-SNAP oder NT-SNAP) und 6 μL des Transfektionsreagenzes in zwei separaten Röhrchen, die jeweils 500 μl des reduzierten Serummediums für jede Vertiefung enthalten, und inkubieren Sie für 5 min bei RT.
   9. Mischen Sie die beiden Lösungen miteinander, um die Transfektionsmischung zu erhalten, und inkubieren Sie sie für 20 minuten bei RT.
   10. Waschen Sie in der Zwischenzeit die ausgesäten CHO-Zellen einmalig mit sterilem PBS.
   11. Ersetzen Sie das PBS durch 1 ml / Well phenolrotfreies Medium, das mit 10% FBS ohne Antibiotika ergänzt wird.
   12. Die gesamte 1 ml Transfektionsmischung tropfenweise in jede Vertiefung geben und die Zellen über Nacht bei 37 °C in 5%_CO2inkubieren.
   13. Zur Markierung des SNAP-Konstrukts verdünnen Sie die geeignete SNAP-Substratstammlösung in 1 mL des Mediums, ergänzt mit 10% FBS, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erhalten.
   14. Waschen Sie die transfizierten Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 1 ml pro Vertiefung 1 μM SNAP-Substratlösung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 min bei 37 °C in 5%_CO2.
   15. Waschen Sie die Zellen dreimal mit phenolrotfreiem Medium und fügen Sie 2 ml pro Well phenolrotfreies Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 °C in 5%_CO2.
   16. Die Deckgläser aller Proben anschließend in die Bildgebungskammer überführen und mit 500 μL Bildpuffer waschen. Fügen Sie 500 μL Imaging-Puffer hinzu, bevor Sie zum FRET-FCS-Setup wechseln.
2. Kalibriermessungen
   HINWEIS: Das FRET-FCS-Setup ist mit einem konfokalen Mikroskop-Wasserobjektiv, zwei Laserlinien, einem TCSPC-System (Time-Correlated Single Photon Counting), zwei hybriden Photomultiplierröhren (PMT) und zwei Avalanche-Photodioden (APD) für die Photonensammlung und die Datenerfassungssoftware ausgestattet. Es ist sehr wichtig, den Aufbau jedes Mal vor den Messungen mit lebenden Zellen auszurichten. Die detaillierte Aufbaubeschreibung finden Sie in Ergänzende Anmerkung 2. Sowohl Laser als auch alle Detektoren (zwei PMTs und zwei APDs) sind während der Messungen immer eingeschaltet, da alle Messungen unter identischen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Verwenden Sie für die Kalibrierungsmessungen einen Deckglas aus derselben Partie, auf der die Zellen ausgesät wurden, dies verringert die Variation der Kragenringkorrektur.
   1. Zur Einstellung der Fokus-, Loch- und Kragenringposition legen Sie 2 nM grüne Kalibrierlösung auf einen Glasdeckglas und schalten den 485 nm und 560 nm Laser ein. Betreiben Sie den Laser im PIE-Modus (Pulsed Interleaved Excitation)¹⁶.
   2. Konzentrieren Sie sich auf die Lösung und stellen Sie die Loch- und Kragenringposition so ein, dass die höchste Zählrate und das kleinste konfokale Volumen erhalten werden, um die maximale molekulare Helligkeit zu erhalten.
   3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die roten Kanäle mit 10 nM roter Kalibrierlösung und einer Mischung aus grüner und roter Kalibrierlösung.
   4. Legen Sie die 10 nM-DNA-Lösung auf einen Glasdeckglas und passen Sie die Fokus-, Loch- und Kragenringposition so an, dass die Kreuzkorrelation zwischen den grünen und roten Detektionskanälen am höchsten ist, d.h. die höchste Amplitude zeigt.
      HINWEIS: Die Schritte 1.2.1 und 1.2.4 müssen möglicherweise hin und her wiederholt werden, um die optimale Ausrichtung zu finden. Nehmen Sie 3-5 Messungen von jeder Kalibrierlösung für 30 s - 120 s vor, nachdem die Fokus-, Loch- und Kragenringposition optimal auf die grünen und roten Detektionskanäle und das konfokale Überlappungsvolumen ausgerichtet wurde.
   5. Messen Sie einen Tropfen von ddH₂O, dem Bildmedium und einer nicht transfizierten Zelle jeweils 3-5 Mal für 30 s - 120 s, um die Hintergrundzählraten zu bestimmen.
   6. Sammeln Sie die Instrumentenreaktionsfunktion mit 3-5 Messungen für 30 s - 120 s. Dies ist optional, wird aber dringend empfohlen.
3. Lebendzellmessungen
   1. Finden Sie eine geeignete Zelle, indem Sie mit der Quecksilberlampe beleuchten und durch das Okular beobachten.
      HINWEIS: Geeignete Zellen sind lebendig und zeigen die typische Morphologie der jeweiligen adhärenten Zelllinie. Die Fluoreszenz des interessierenden Proteins, hier ein Oberflächenrezeptor, ist überall auf der Oberfläche sichtbar. Weniger helle Zellen sind aufgrund des besseren Kontrasts in FCS besser geeignet als hellere, wenn eine geringe Anzahl von Molekülen im Fokus ist.
   2. Schalten Sie beide Laser im PIE-Modus ein und fokussieren Sie sich auf die Membran, indem Sie die maximale Anzahl pro Sekunde betrachten.
      HINWEIS: Die Laserleistung muss möglicherweise für die Zellproben reduziert werden (weniger als 5 μW am Objektiv). Dies hängt von den verwendeten Fluorophoren und dem Aufbau ab.
   3. Beobachten Sie in der Online-Vorschau der Datenerfassungssoftware die Auto- und Kreuzkorrelationskurven des eGFP oder des beschrifteten SNAP-Tags am β₂AR und sammeln Sie mehrere kurzmessungen (~2 -10) mit einer Erfassungszeit zwischen 60 -180 s.
      HINWEIS: Erregen Sie die Zellen nicht für längere Zeit kontinuierlich, da die Fluorophore bleichen können. Es hängt jedoch von der Helligkeit jeder Zelle ab, wie lange die Messungen dauern können und wie viele Messungen insgesamt durchgeführt werden können.

2. Datenanalyse

1. Datenexport
   1. Exportieren Sie die Korrelationskurven, G(t_c),und die Zählraten, CR, aus allen Messungen.
   2. Achten Sie darauf, die Zeitfenster "Prompt" und "Delay" korrekt zu definieren und verwenden Sie die Option "Microtime Gating" in der Datenkorrelationssoftware.
      HINWEIS: Insgesamt sind drei verschiedene Korrelationen erforderlich: (1) Autokorrelation des grünen Kanals im Eingabeaufforderungszeitfenster (ACF_gp), (2) Autokorrelation der roten Kanäle im Verzögerungszeitfenster (ACF_rd) und schließlich (3) die Kreuzkorrelation des grünen Kanalsignals im Eingabeaufforderungszeitfenster mit dem roten Kanalsignal im Verzögerungszeitfenster (CCF_PIE). Der Datenexport wird Schritt für Schritt für verschiedene Software in Ergänzende Anmerkung 3 dargestellt.
2. Kalibriermessungen
   1. Verwenden Sie die Autokorrelationsfunktionen der grünen (ACF_gp) und roten (ACF_rd) Fluorophorlösungen und passen Sie sie bei Bedarf an ein 3D-Diffusionsmodell mit einem zusätzlichen Triplettterm an (Gl. 1), um die Form und Größe des konfokalen Detektionsvolumens für die beiden verwendeten Farbkanäle zu kalibrieren:
      Gleichung 1
      Dabei ist b die Basislinie der Kurve, N die Anzahl der fokussierten Moleküle, t_D die Diffusionszeit (in ms) und s = z₀/w₀ der Formfaktor des konfokalen Volumenelements. Das Triplett blinkt oder andere Photophysik wird durch seine Amplitude a_R und Relaxationszeit t_Rbeschrieben.
      HINWEIS: Alle Variablen und Symbole, die innerhalb des Protokolls verwendet werden, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   2. Verwenden Sie die bekannten Diffusionskoeffizienten D für den grünen²⁶ und roten Kalibrierstandard²⁷ und die erhaltenen Formfaktoren s_grün und s_rot, um die Abmessungen (Breite w₀ und Höhe z₀₎und das Volumen V_eff des konfokalen Volumenelements (Eq. 2a-c) zu bestimmen.
      Gl. 2a
      Gl. 2b
      Gl. 2c
      HINWEIS: Vorlagen für die Berechnung des Kalibrierparameters werden als ergänzende Dateien (S7) zur Verfügung gestellt.
   3. Berechnen Sie das spektrale Übersprechen α des grünen Fluoreszenzsignals (gesammelt in den Kanälen 0 und 2) in die roten Detektionskanäle (Kanalnummer 1 und 3) als Verhältnis der hintergrundkorrigierten (BG) Signale (Gl. 3).
      
      Gl. 3
   4. Bestimmen Sie die direkte Anregung des Akzeptorfluorophors δ durch die Donoranregungswellenlänge durch das Verhältnis der hintergrundkorrigierten Zählrate der roten Kalibriermessungen im Zeitfenster "prompt" (Anregung durch grünen Laser) zur hintergrundkorrigierten Zählrate im Zeitfenster "Verzögerung" (Anregung durch roten Laser) (Vgl. 4).
      
      Gl. 4
   5. Berechnen Sie die molekulare Helligkeit B sowohl der grünen als auch der roten Fluorophore (Gl. 5a-b) basierend auf den hintergrundkorrigierten Zählraten und der erhaltenen Anzahl der Moleküle im Fokus, N, aus der 3D-Diffusionsanpassung (Eq. 1):
      Gl. 5a
      Gl. 5b
   6. Passen Sie sowohl ACF_gp und ACF_rd als auch CCF_PIE der doppelt markierten DNA an das 3D-Diffusionsmodell an (Gl. 1). Halten Sie die erhaltenen Formfaktoren, s_grün und s_rot, konstant für ACF_gp bzw. ACF_rd. Der Formfaktor für die CCF_PIE, s_PIE, liegt normalerweise zwischen diesen beiden Werten.
      HINWEIS: In einem idealen Setup hätten sowohl V_eff,grün als auch V_{eff, rot} die gleiche Größe und überlappen sich perfekt.
   7. Bestimmen Sie die Amplitude bei Null Korrelationszeit, G₀(t_c), basierend auf den gefundenen Werten der scheinbaren Anzahl von Molekülen im Fokus (N_grün, N_rot und N_PIE).
   8. Berechnen Sie das Amplitudenverhältnis r_GR und r_RG für eine Probe mit 100% Kodiffusion von grünen und roten Fluorophoren (Eq. 6). Beachten Sie, dass N_PIE nicht die Anzahl der doppelt markierten Moleküle im Fokus widerspiegelt, sondern nur die 1 /G₀(t_c).
      und Gl. 6
3. Experimente mit lebenden Zellen
   1. Passen Sie bei einfach beschrifteten Konstrukten die Zellproben an ein geeignetes Modell an. Für den gezeigten Membranrezeptor erfolgt die Diffusion bimodal mit einer kurzen und einer langen Diffusionszeit. Zusätzlich müssen die Photophysik und das Blinken der Fluorophore berücksichtigt werden:
      Gl. 7
      Dabei sind t_d1 und t_d2 die beiden erforderlichen Diffusionszeiten, und eine₁ ist der Bruchteil der ersten Diffusionszeit.
      HINWEIS: Im Gegensatz zu den Kalibriermessungen, bei denen die freien Farbstoffe und DNA-Stränge frei in alle Richtungen diffundieren, zeigt der Membranrezeptor nur eine 2D-Diffusion entlang der Zellmembranen. Dieser Unterschied zwischen 3D- und 2D-Diffusion spiegelt sich im modifizierten Diffusionsterm wider (vgl. Eq. 1), wobei t_D im 2D-Fall nicht vom Formfaktor s des konfokalen Volumenelements abhängt.
   2. Berechnen Sie die Konzentration c von grün oder rot markierten Proteinen aus dem jeweiligen N- und _V-Eff mit grundlegender Mathematik (Eq. 8):
      Gl. 8
      wobei N_A = Avogadro-Zahl
   3. Passen Sie für die N-terminale SNAP-Markierung und das intrazelluläre eGFP die beiden Autokorrelationen (ACF_gp und ACF_rd) der doppelt markierten Probe mit dem gleichen Modell an wie für die einfach markierten Konstrukte für die ACFs (Ziff. 7) und die CCF_PIE unter Verwendung eines bimodalen Diffusionsmodells (Gl. 9):
      Gl. 9
      HINWEIS: Für eine globale Beschreibung des Systems müssen alle drei Kurven zusammenpassen: Der Diffusionsterm ist für alle drei Kurven identisch und die einzige Differenz ist der Relaxationsterm für den CCF_PIE. Da die Photophysik von zwei Fluorophoren in der Regel nicht zusammenhängt, ist kein Korrelationsbegriff erforderlich. Dieses Fehlen von Relaxationstermen führt zu einem flachen CCF_PIE bei kurzen Korrelationszeiten. Übersprechen und direkte Anregung des Akzeptors aufgrund des Donorfluorophors können jedoch falsch-positive Amplituden aufweisen und sollten sorgfältig auf die Verwendung der Kalibriermessungen überprüft werden.
   4. Berechnen Sie die Konzentration c von grün oder rot markierten Proteinen aus dem jeweiligen N- und _V-eff mit Gleichung 8.
   5. Schätzen Sie den Anteil oder die Konzentration , c_GR oder c_RG, von interagierenden grün und rot markierten Proteinen aus den Zellproben unter Verwendung der aus den DNA-Proben erhaltenen Korrekturfaktoren, der Amplitudenverhältnisse r_GR und r_RG der Zellprobe und ihrer jeweils erhaltenen Konzentrationen (Eq. 10).
      und Gl. 10
   6. Passen Sie für die C-terminale SNAP-Markierung und das intrazelluläre eGFP die beiden Autokorrelationen (ACF_gp und ACF_rd) der FRET-Probe als single-labeled samples (Gleichung 7) und des CCF_FRET an ein bimodales Diffusionsmodell an, das einen Antikorrelationsterm enthält (Gleichung 11)
      Gl. 11
      wobei a_f die Amplitude der gesamten Antikorrelation und a_R und t_R die jeweilige Amplitude und Relaxationszeit widerspiegelt.
      HINWEIS: Im Falle von antikorrelierten Fluoreszenzänderungen aufgrund von FRET können ein oder mehrere Antikorrelationsterme erforderlich sein (Gl. 11), was zu einem "Rückgang" der _CCF-FRET zu Zeiten niedriger Korrelation führt, die mit einem Anstieg der beiden Autokorrelationen (ACF_gp und ACF_rd) zusammenfallen. Beachten Sie jedoch, dass Photophysik wie Triplett-Blinzeln den Anti-Korrelationsterm maskieren kann, indem sie die FRET-induzierte Anti-Korrelation dämpft. Eine gemeinsame Analyse, ergänzt durch gefilterte FCS-Methoden, könnte helfen, den Anti-Korrelations-Term zu entlarven. Zusätzlich sollten technische Artefakte, die aus Totenzeiten in der Zählelektronik im Nanosekundenbereich stammen, ausgeschlossen werden¹⁶. Ein detaillierteres Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Durchführung der Analyse in ChiSurf²⁸ und Vorlagen für die Berechnung des konfokalen Volumens oder der molekularen Helligkeit werden im Github-Repository (https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS) und als ergänzende Dateien (Ergänzende Anmerkung 4 und Ergänzende Anmerkung 6) bereitgestellt. Zusätzlich finden Sie dort die Python-Skripte für den Batch-Export von Daten, die mit der Symphotime-Software im .ptu-Format erfasst wurden.

Ergebnisse

Exemplarische Ergebnisse der Kalibrierung und der Lebendzellmessungen werden im Folgenden diskutiert. Zusätzlich wird die Wirkung von FRET auf die Kreuzkorrelationskurven anhand simulierter Daten neben der Wirkung der Protein-Protein-Interaktion, die die _{CCF-PIE-Amplitude} erhöht, demonstriert.

PIE-basierter FCS-Datenexport
In PIE-Experimenten werden Daten im time-tag time-resolved mode (TTTR)^29,30gesammelt. Abbildung 1B zeigt die Photonen-Ankunftszeit-Histogramme einer PIE-Messung eines doppelt markierten DNA-Strangs auf dem beschriebenen Aufbau (Ergänzende Anmerkung 1). Das Setup verfügt über vier Erkennungskanäle. Die Fluoreszenzemission wird zunächst durch Polarisation in "S" - und "P" -Richtungen aufgeteilt (bezogen auf die senkrechte und parallele Ebene, in der das elektrische Feld einer Lichtwelle oszilliert). Zweitens wird jede Polarisationsrichtung vor der Detektion in zwei Farbkanäle (grün, rot) aufgeteilt, was zu vier Kanälen (S-grün, S-rot, P-grün, P-rot) führt. Im "prompten" Zeitfenster wird der grüne Fluorophor angeregt, und das Signal wird aufgrund von FRET sowohl im grünen als auch im roten Kanal detektiert. Im Verzögerungszeitfenster ist nur das rote Fluorophor (im roten Kanal) sichtbar. Basierend auf den Detektionskanälen und "Prompt"- versus "Delayed"-Zeitfenstern können mindestens fünf verschiedene Korrelationskurven (3 Autokorrelationskurven (ACFs) und 2 Kreuzkorrelationskurven (CCFs)) erhalten werden (Abbildung 1C-D): (1) grünes Signal im Prompt-Zeitfenster (ACF_gp), (2) rotes Signal im Prompt-Zeitfenster (im Falle von FRET, ACF_rp), und (3) rotes Signal im Verzögerungszeitfenster (ACF_rd). Diese ACFs berichten über die Proteinmobilität, Photophysik (z.B. Triplett-Blinzeln) und andere zeitkorrelierte Helligkeitsänderungen in den Fluorophoren (z.B. durch FRET). (4) Die PIE-basierte Kreuzkorrelation CCF_PIE des grünen Signals im Zeitfenster mit dem roten Signal im Verzögerungszeitfenster erlaubt es, den Anteil der Kodiffusion des grünen und roten Fluorophors¹⁶zu bestimmen. (5) Die FRET-basierte Kreuzkorrelation CCF_FRET des grünen mit dem roten Signal im Zeitfenster der Aufforderung bezieht sich auf FRET-induzierte, antikorrelierte Helligkeitsänderungen in den grünen und roten Signalen^31,32,33.

Abbildung 1: Gepulste interleaved Anregung (PIE) basierende Fluoreszenz(Kreuz)Korrelationsspektroskopie (F(C)CS). (A) In FCS diffundieren fluoreszenzmarkierte Moleküle frei in und aus einem (beugungsbegrenzten) Brennvolumen, das von einem fokussierten Laserstrahl geformt wird, der Fluoreszenz innerhalb dieses winzigen Volumens induziert. Die daraus resultierenden Intensitätsschwankungen von Molekülen, die in das Volumen ein- und austreten, werden korreliert und geben Aufschluss über die Beweglichkeit der Moleküle. (B) In PIE werden zwei verschiedene Laserlinien ("prompt" und "delay") verwendet, um die mit zwei verschiedenen Fluorophoren ("grün" und "rot") markierte Probe anzuregen. Die Zeitdifferenz zwischen beiden Anregungsimpulsen wird an die Fluoreszenzlebensdauer der jeweiligen Fluorophore angepasst, so dass einer zerfallen ist, bevor der andere angeregt wird. In der gezeigten doppelt markierten Probe sind beide Fluorophore nahe genug, um einen Förster Resonance Energy Transfer (FRET) vom "grünen" Donorfluorophor zum "roten" Akzeptorfluorophor zu durchlaufen. So kann die rote Fluoreszenzemission im "prompten" Zeitfenster bei Anregung des grünen Donors nachgewiesen werden. Im verwendeten Aufbau (Ergänzende Anmerkung 2) werden für jede Farbe zwei Detektoren verwendet, einer parallel zur Anregungsstrahlorientierung (bezeichnet mit "p") und der zweite senkrecht (bezeichnet mit "s"). (C) In einem PIE-Experiment können drei verschiedene Autokorrelationsfunktionen bestimmt werden: Korrelation der i) grünen Kanalsignale im Eingabeaufforderungszeitfenster (ACF_gp), ii) rote Kanalsignale im Eingabeaufforderungszeitfenster (ACF_rp) und iii) rote Kanalsignale im Verzögerungszeitfenster (ACF_rd). (D) Zwei verschiedene Kreuzkorrelationsfunktionen können bestimmt werden: iv) Die "PIE"-Kreuzkorrelation (CCF_PIE) mit grünen Kanalsignalen im Eingabeaufforderungszeitfenster korreliert mit den roten Kanalsignalen im Verzögerungsfenster, wobei die Amplitude dieser Kurve mit der Kodiffusion von Fluorophoren zusammenhängt; und v) die "FRET"-Kreuzkorrelation (CCF_FRET) mit den grünen Kanalsignalen im Eingabeaufforderungszeitfenster korreliert mit den roten Kanalsignalen im selben Eingabeaufforderungsfenster; hier hängt die Form dieser Kurve zeitweise schneller als die Diffusion mit den FRET-induzierten Intensitätsänderungen zusammen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kalibrierung
Abbildung 2A-B zeigt eine Kalibriermessung der einzeln diffundierenden grünen bzw. roten Fluorophore. Basierend auf einer Anpassung mit Gleichung 1 und dem bekannten Diffusionskoeffizienten D_grün²⁶ und D_rot²⁷ werden die Form (_z0 und w₀) und die Größe ( V_eff) des Detektionsvolumens anhand von Gleichung 2a-c berechnet. Die Fit-Ergebnisse aus dem ACF_gp aus dem grünen Fluorophor und ACF_rd aus dem roten Fluorophor sind in Abbildung 2Czusammengefasst. Beide Fluorophore zeigen eine zusätzliche Relaxationszeitkonstante von 8,6 μs (18%) bzw. 36 μs (15%). Die molekulare Helligkeit (Gl. 5a-b) des grünen und roten Fluorophors beträgt 12,5 kHz pro Molekül bzw. 2,7 kHz pro Molekül.

Für eine zuverlässige Abschätzung der konfokalen Volumengröße und -form sowie der Molekülhelligkeit wird empfohlen, 3-5 Messungen pro Kalibrierexperiment und eine gemeinsame (oder globale) Anpassung aller Wiederholungen durchzuführen.

Das Übersprechen α(Abbildung 2D,Gleichung 3) und die direkte Anregung des Akzeptors durch den grünen Laser δ (Figur 2E, Gleichung 4) für dieses Fluorophorpaar liegen bei ~ 15% bzw. ~ 38%.

Abbildung 2: Kalibriermessungen des frei streuenden grünen und roten Kalibrierstandards. (A-B) Repräsentative 60 s Messung einer 2 nM grünen (A) und einer 10 nM roten (B) Kalibrierstandardmessung, die an das 3D-Diffusionsmodell angepasst ist, einschließlich einer zusätzlichen Relaxationszeit (eq. 1). Die Tabelle in Panel (C) zeigt die Anpassungsergebnisse und den abgeleiteten Parameter basierend auf Gleichung 2a-c und Gleichung 5a-b. *Diffusionskoeffizienten wurden der Literatur^26,27entnommen. (D) Bestimmung des Übersprechens α des grünen Signals in die roten Kanäle (Eq. 3). Das Anregungsspektrum des grünen Standards ist in Cyan dargestellt, das Emissionsspektrum in grün. Die Anregungslaserlinien bei 485 nm (blau) und 561 nm (orange) sind als gestrichelte Linien dargestellt. Transparente grüne und magentafarbene Boxen zeigen den gesammelten Emissionsbereich an (Ergänzende Anmerkung 2). (E) Bestimmung der direkten Anregung δ des roten Fluorophors durch den 485 nm Laser (Gl. 4). Der Farbcode ist identisch mit (D), hell- und dunkelorange zeigen das Anregungs- bzw. Emissionsspektrum des roten Standards. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zur Bestimmung und Kalibrierung der Überlappung des grünen und roten Anregungsvolumens wird wie oben beschrieben ein doppelt markierter DNA-Doppelstrang verwendet (Abbildung 3A). Hier sind die Fluorophore 40 bp voneinander entfernt, so dass zwischen den grünen und roten Fluorophoren, die an den Enden der DNA-Doppelstränge befestigt sind, kein FRET auftreten kann. Abbildung 3B zeigt die Autokorrelationen beider Fluorophore in Grün (ACF_gp) und Magenta (ACF_rd) und die PIE-Kreuzkorrelation, CCF_PIE, in Cyan. Bitte beachten Sie, dass bei CCF_PIE das Signal in den grünen Kanälen im Eingabeaufforderungszeitfenster mit dem Signal in den roten Kanälen im Verzögerungszeitfenster¹⁶korreliert ist.

Dabei erhält man einen durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten für den DNA-Strang der _D-DNA = 77 μm²/s. Weitere Einzelheiten zur Berechnung finden Sie im Schritt-für-Schritt-Protokoll, Ergänzende Anmerkung 4. Dieser Wert erhält man, indem man die kalibrierte grüne und rote Nachweisvolumengröße (Abbildung 2) und die jeweiligen Diffusionszeiten von ACF_gp und ACF_rd des DNA-Strangs (Abbildung 3C) in Gleichung 2a einfügt. Als nächstes kann unter Verwendung der erhaltenen Korrekturwerte r_GR und r_RG und später unter Verwendung von Gleichung 6 die Menge der Co-Diffusion, d.h. doppelmarkierte Moleküle (oder Proteinkomplexe im Falle der Co-Transfektion zweier verschiedener Proteine) aus den Zellproben bestimmt werden.

Abbildung 3: Kalibrierung des grün-roten Überlappungsvolumens unter Verwendung einer DNA-Probe. (A) Der für die Kalibrierung verwendete DNA-Strang trägt ein grünes und ein rotes Kalibrierfluorophor mit einem Abstand von 40 bp dazwischen. Der Abstand zwischen den beiden Beiden muss groß genug sein, um FRET zwischen den Fluorophoren auszuschließen. (B) Repräsentative 60 s Messung einer 10 nM DNA-Lösung. Autokorrelationen aus beiden Fluorophoren in grün (ACF_gp, grüner Standard) und Magenta (ACF_rd, roter Standard) und der PIE-Kreuzkorrelation, CCF_PIE, in blau. Die Tabelle in Panel (C) zeigt die Anpassungsergebnisse basierend auf dem 3D-Diffusionsmodell einschließlich eines zusätzlichen Relaxationsterms (Eq. 1) und des abgeleiteten Parameters Diffusionskoeffizienten der DNA, D_DNA (eq. 2a), der Größe und Form des Überlappungsvolumens (eq. 2a-c) und der Korrekturverhältnisse r_GR und r_RG (eq. 6 ). Bitte beachten Sie, dass die Werte für das grüne und rote Nachweisvolumen (mit * gekennzeichnet) aus der Anpassung der einzelnen Fluorophore in Abbildung 2entnommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Lebendzell-Experimente
Im folgenden Abschnitt wird die Analyse von Lebendzellexperimenten für verschiedene β_{2 AR-Konstrukte}vorgestellt. Da β₂AR ein Membranprotein ist, beschränkt sich seine Diffusion weitgehend auf eine zweidimensionale Diffusion (Abbildung 4A) entlang der Zellmembran (mit Ausnahme von Transport- oder Recyclingprozessen zur oder von der ^{Membran) 2}. Mit der Beschränkung auf die 2D-Diffusion wird der Formfaktor s = z₀/w₀ in Gleichung 1 obsolet, was zu einem vereinfachten Diffusionsmodell führt (Ziff. 9).

Single-Label-Konstrukte: β₂AR-IL3-eGFP und NT-SNAP-β₂AR
Abbildung 4 zeigt exemplarische Messungen des Single-Label-Konstrukts β₂AR-IL3-eGFP (Abbildung 4B), wobei eGFP in die intrazelluläre Schleife 3 eingefügt wird, und des Konstrukts NT-SNAP-β₂AR (Abbildung 4C), bei dem das SNAP-Tag mit dem N-Terminus von β₂AR konjugiert ist. Der SNAP-Tag ist mit einem membranundurchlässigen SNAP-Oberflächensubstrat gekennzeichnet. Die repräsentativen Kurven zeigen den Durchschnitt von 4-6 wiederholten Messungen mit Erfassungszeiten von jeweils 120 - 200 s. Die jeweiligen Autokorrelationen ACF_gp und ACF_rd des eGFP- und SNAP-Signals sind an ein bimodales, zweidimensionales Diffusionsmodell (Eq. 9) angepasst. In Bezug auf die schnelle Dynamik zeigt eGFP nur das erwartete Triplett-Blinken bei t_R1 ~ 9 μs, während das SNAP-Signal zwei Relaxationszeiten erfordert, eine bei der typischen Triplett-Blinkzeit von t_R1 ~ 5 μs und eine zweite bei t_R2 ~ 180 μs.

Die molekulare Helligkeit der Fluorophore in lebenden Zellen beträgt 0,8 KHz (eGFP) und 1,7 kHz (SNAP) pro Molekül unter den gegebenen Anregungsbedingungen (eqs. 5a-b). Die Konzentration der markierten β₂AR-Konstrukte, die in die Zellmembran eingebaut sind, sollte im nanomolaren Bereich liegen und kann durch die durchschnittliche Anzahl der Moleküle (Gl. 9, Abbildung 4C)und die Größe des jeweiligen konfokalen Volumens für den grünen und roten Kanal (Abbildung 2) unter Verwendung von Gleichung 8 bestimmt werden.

Abbildung 4: Repräsentative Messung von Single-Label-Konstrukten. (A) In dieser Studie wurde der Membranrezeptor β₂AR als Beispiel verwendet. Im Gegensatz zu den zur Kalibrierung verwendeten Fluorophoren und DNA-Strängen, die frei durch das Nachweisvolumen schweben könnten, diffundieren Membranproteine hauptsächlich seitlich entlang der Membran, was als 2-dimensionale Diffusion bezeichnet wird. (B, D) ACF_gp und ACF_rd der Single-Label-Konstrukte β₂AR-IL3-eGFP (B) und NT-SNAP-β₂AR (D). Gezeigt wird der Durchschnitt von 4-6 Messungen, die jeweils für 120 - 200 s gesammelt wurden. Die Tabelle in Panel (C) zeigt die Anpassungsergebnisse der Daten an das bimodale zweidimensionale Diffusionsmodell einschließlich zusätzlicher Relaxationsterme (Eq. 7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Doppelt beschriftetes Konstrukt: NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP
Im doppelt markierten Konstrukt NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (kurz NT-SNAP) wird eGFP in die intrazelluläre Schleife 3 eingefügt und das SNAP-Tag mit dem N-Terminus von β₂AR konjugiert (Abbildung 5A). In dieser Konfiguration befindet sich der eGFP auf der Innenseite der Membran und der SNAP auf der Außenseite mit zu großen Abständen für FRET. Im Idealfall würde dieses Konstrukt eine 100%ige Kodiffusion des grünen und roten Fluorophors und kein FRET-Signal zeigen. Abbildung 5B-D zeigt zwei Messungen des NT-SNAP in zwei Zellen an zwei verschiedenen Messtagen. Passt man die ACF_gp und ACF_rd der in Abbildung 5B mit Gleichung 7 und der CCF_PIE mit Gleichung 9 gezeigten "besseren" Messung an, so zeigt sich für die ACF_gp und ACF_rd50- 60 Moleküle im Fokus, während N_app, also 1/G₀(t_c) ~ 114 für die CCF_PIE (Abbildung 5C ). Die Konzentration der markierten Rezeptoren liegt im Bereich von ~100 nM, wie mit Gleichung 8 bestimmt. Um die durchschnittliche Konzentration von doppelt markierten Molekülen zu bestimmen, wird zunächst das Verhältnis von G₀(t_c)(dargestellt durch1/ N_(app)) des CCF_PIE zu ACF_gp bzw. ACF_rdberechnet (Gl. 6). Als nächstes werden diese Werte, r_GRcell= 0,43 und r_RGcell = 0,53, mit den Werten verglichen, die aus der DNA-Messung erhalten wurden (r_{GR, DNA}= 0,51 und r_{RG, DNA} = 0,79 an diesem Messtag). Nach der Proportionsregel wird ein r_GRcell= 0,43 aus dem ACF_gp des eGFP-Signals zu einem Bruchteil der Kodiffusion (r_GRcell/r_{GR, DNA}) von 0,84 reflektiert, wobei für den anderen Fall von ACF_rd des SNAP-Substratsignals dieser Wert 0,67 beträgt. Die mittlere Konzentration des doppelt markierten NT-SNAP-Konstrukts kann schließlich auf der Grundlage von Gleichung 10 berechnet werden. Im Gegensatz dazu ist in der in Abbildung 5D gezeigten Messung von einem anderen Tag die Konzentration der Rezeptoren recht niedrig und die Daten sehr verrauscht, so dass der Anpassungsbereich auf ~ 10 μs begrenzt ist. Darüber hinaus wird nur eine geringe Co-Diffusion beobachtet (15 - 26%).

Abbildung 5:Doppelt beschriftetes NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP-Konstrukt. (A) In dem doppelt beschrifteten Konstrukt wird das eGFP in die intrazelluläre Schleife 3 eingefügt und das SNAP-Tag an den N-Terminus von β₂AR (NT-SNAP) angehängt. (B, D) ACF_gp, ACF_rd und CCF_PIE von zwei Messungen des doppelt markierten Konstrukts. Die Daten passen zu einem bimodalen zweidimensionalen Diffusionsmodell (eq. 9, CCF_PIE) und enthalten zusätzliche Relaxationsterme (eq. 7, ACF_gp und ACF_rd). Die Tabelle in Panel (C) zeigt die Anpassungsergebnisse und die abgeleitete Parameterkonzentration (Gleichung 8), das Verhältnis der Korrelationsamplitude bei Null Korrelationszeit (G₀(t_c)) und des Anteils ko-diffundierender Moleküle (Eq. 10). Bitte beachten Sie, dass die Messungen an verschiedenen Tagen erfasst wurden, daher leicht unterschiedliche Faktoren für die Amplitudenkorrektur verwendet wurden (B: r_GR,DNA = 0,51 und r_RG,DNA = 0,79; D: r_GR,DNA = 0,51 und r_RG,DNA = 0,56). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Doppelt markiertes Konstrukt im FRET: β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
In dem doppelt markierten Konstrukt β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP (Abbildung 6A) wird das eGFP in die intrazelluläre Schleife 3 eingefügt, die mit dem NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP-Konstrukt identisch ist, wobei das SNAP-Tag an den C-Terminus angeschlossen ist. Hier befinden sich beide Markierungen auf der gleichen Seite der Plasmamembran der Zellen, so dass sich die Fluorophore in unmittelbarer Nähe befinden, so dass FRET wie durch die abgeschreckte eGFP-Lebensdauer angezeigt auftritt (Ergänzende Anmerkung 5). Unter Berücksichtigung der Flexibilität relativ unstrukturierter Proteinregionen wie des C-Terminus³⁴ und mindestens zweier verschiedener Proteinkonformationen von GPCRs^35,"high FRET" (HF) oder "low FRET" (LF) konnten dynamische Änderungen der FRET-Effizienz aufgrund von eGFP-SNAP-Entfernungsänderungen beobachtet und durch einen Antikorrelationsterm im CCF_FRET identifiziert werden (orange Kurve in Abbildung 6BB ). FRET-Fluktuationen haben sich als antikorreliert erwiesen, da sich der Rezeptor jeweils nur in einem Zustand befinden kann, entweder HF oder LF. Die gemeinsame (oder globale) Anpassung aller fünf Korrelationskurven (Abbildung 6B) zeigt ~ 70% der langsam diffundierenden Moleküle bei ~ 100 ms, während der Rest mit ~ 1 ms diffundiert. Alle Autokorrelationen und CCF_FRET zeigen Relaxationsterme bei 37 μs und 3 μs; Diese vom roten Signal dominierten Korrelationen (ACF_rp, ACF_rd und CCF_FRET) zeigen eine zusätzliche langsame Komponente ~ 50 ms (Abbildung 6C).

FRET-induzierte Änderungen am CCF_FRET unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung 6D) werden durch eine Reihe von Simulationen eines Zwei-Zustand-Systems mit einer Fluktuationszeit von 70 μs zwischen LF- und HF-Zuständen demonstriert. Beim Umschalten vom LF- in den HF-Zustand werden im Zeitfenster Änderungen des antikorrelierten Signals beobachtet: Das grüne Signal nimmt ab und das rote Signal nimmt zu (umgekehrt für die HF-> LF-Umschaltung). Erfolgt die HF-LF-Umschaltung auf Zeitskalen schneller als die Diffusionszeit, also während der Verweilzeit des Moleküls im Fokus, so lässt sich die Rate aus der Antikorrelation im CCF_FRET^{6,31,36 ableiten}. Bitte beachten Sie, dass dynamische Prozesse, die langsamer als die Diffusionszeit sind, in FCS nicht beobachtet werden können.

In dieser Demonstration wurden zwei verschiedene FRET-Szenarien angenommen, die entweder eine moderate oder maximale Änderung der FRET-Effizienz zwischen den beiden Zuständen zeigen. Die Simulationen wurden mit Burbulator³⁷ durchgeführt und berücksichtigen das Fehlen oder Vorhandensein von Triplett-Blinken und die zunehmende Menge an Donor-Crosstalk in die roten Kanäle. Der Diffusionsterm wurde als bimodale Verteilung modelliert, wobei 30% der schnell diffundierenden Moleküle bei t_D1 = 1 ms und der Rest der Moleküle langsam mit t_D2 = 100 ms diffundieren. Insgesamt wurden 10⁷ Photonen in einem 3D-Gauß-förmigen Volumen mit w 0 = _0,5 μm und z₀ = 1,5 μm, einer Kastengröße von 20 und N_FCS = 0,01 simuliert.

Abbildung 6E-F zeigt die Simulationsergebnisse für die FRET-induzierte Kreuzkorrelation CCF_FRET für moderaten (Abbildung 6E) und maximalen FRET-Kontrast ( Abbildung6F) in Abwesenheit (durchgezogene Linien) und Vorhandensein von Triplet-Blinken (gestrichelte Linien). Die FRET-induzierte Antikorrelation ist in Abbildung 6Fleicht zu sehen. Der "dämpfende" Effekt beim Hinzufügen eines zusätzlichen Triplettzustands verringert die Korrelationsamplitude (Abbildung 6E-F)^38,39.

Abbildung 6: Simulation einer doppelt markierten Probe mit dynamischem FRET. (A) Doppelt markierte β 2 AR mit_einemin die intrazelluläre Schleife 3 eingefügten eGFP und einem C-terminalen SNAP-Tag. Beide Fluorophore sind nahe genug, um FRET zu durchlaufen und zeigen Veränderungen in der FRET-Effizienz, wenn der Rezeptor eine Proteindynamik durchläuft. (B) Autokorrelation (ACF_gp, ACF_rp und ACF_rd, fit mit Gleichung 7) und Kreuzkorrelationskurven (CCF_FRET (Gl. 7) und CCF_PIE (Gl. 9)) einer Beispielmessung. Die Tabelle in Bedienfeld (C) zeigt die Anpassungsergebnisse. (D-F) Um den Einfluss des experimentellen Parameters auf den erwarteten, FRET-induzierten Antikorrelationsterm zu zeigen, wurden 12 Simulationen durchgeführt, in denen die Änderung der FRET-Effizienz (klein oder groß), die unterschiedliche Menge an Donor-Übersprechen in die Akzeptorkanäle (0%, 1% oder 10%) und das Fehlen und Vorhandensein von Triplett-Blinken modelliert wurden. Der Gleichgewichtsanteil beider FRET-Zustände wurde auf 50:50 angenommen und ihre Wechselkurse so angepasst, dass die erhaltene Relaxationszeit t_R = 70 μs ist. Weitere Details zu den Simulationen finden Sie im Text. (E) CCF_FRET der Simulationsergebnisse mit einem moderaten FRET-Kontrast und in Abwesenheit von Übersprechen (dunkelorange), 1% Übersprechen (orange) und 10% Übersprechen (hellorange). Durchgezogene Linien zeigen Ergebnisse in Abwesenheit von Triplett, gestrichelte Linien in Gegenwart von Triplett. (F) CCF_FRET der Simulationsergebnisse mit maximalem FRET-Kontrast. Der Farbcode ist identisch mit (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In der Simulation, die den experimentellen Bedingungen am ähnlichsten ist (α = 10%, 15% Triplet blinkend und moderater FRET-Kontrast, gestrichelte gelbe Linie in Abbildung 6E),ist der Antikorrelationsterm jedoch fast vermindert. Abbildung 7 zeigt das Ergebnis der Analyse dieser simulierten Daten unter Verwendung der in den Photonen ankunftszeithistogrammen kodierten Informationen (d.h. der Fluoreszenzlebensdauer) mittels Fluoreszenz-Lifetime-Korrelationsspektroskopie (FLCS)^17,19 oder speziesgefiltertem FCS (fFCS)¹⁸. Hierbei werden die Fluoreszenzlebensdauern der bekannten HF- und LF-Spezies (Abbildung 7A) verwendet, um Gewichte oder "Filter" (Abbildung 7B) zu erzeugen, die während des Korrelationsverfahrens angewendet werden. In den erhaltenen Spezies-Auto- und Kreuzkorrelationskurven (Abbildung 7C-D) kann die Antikorrelation deutlich beobachtet werden.

Abbildung 7: Lebensdauergefiltertes FCS kann helfen, die auf Proteindynamik basierenden Fluktuationen der FRET-Effizienz in Proben mit hohem Übersprechen, signifikantem Triplett-Blinken oder anderen photophysikalischen oder experimentellen Eigenschaften aufzudecken, die die FRET-induzierte Antikorrelation im _CCF-FRETmaskieren. Hier ist der Ansatz exemplarisch für die in Abbildung 6E gezeigten Daten für die Simulation mit 10% Übersprechen und 5% Triplettblinzeln dargestellt. (A) Normalisierte Zerfallsmuster der Fluoreszenzintensität für die beiden FRET-Spezies (hell- und dunkelgrün für hohe bzw. niedrige FRET) und die IRF (grau). Das Muster für den parallelen Detektionskanal wird in durchgezogenen Linien dargestellt, gestrichelte Linien für den senkrechten Detektionskanal. (B) Die Gewichtungsfunktion oder "Filter" wurde auf der Grundlage der in (A) gezeigten Muster generiert , der Farbcode ist identisch mit (A). Bitte beachten Sie, dass hier nur das Signal in den grünen Detektionskanälen und damit das FRET-induzierte Donor-Quenching berücksichtigt wird. (C) Es werden vier verschiedene speziesselektive Korrelationen erhalten: Spezies-Autokorrelationen des niedrigen FRET-Zustands (sACF_LF-LF, dunkelgrün) und des hohen FRET-Zustands (sACF_HF-HF, hellgrün) und die beiden Spezies-Kreuzkorrelationen zwischen dem niedrigen FRET- zum hohen FRET-Zustand (sCCF_LF-HF, dunkelorange) und umgekehrt (sCCF_HF-LF , orange). Die sCCF zeigt deutlich die Antikorrelation im μs-Bereich. Gestrichelte schwarze Linien zeigen die Passformen. sACF wurden mit Gleichung 9 und sCCF mit Gleichung 11ausgestattet. Tabelle im Bedienfeld (D) zeigt die Anpassungsergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

CCF PIE-Amplitude zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion (PPI)
Schließlich ist ein häufiger Anwendungsfall für PIE-basiertes FCS in lebenden Zellen die Untersuchung der Interaktion zwischen zwei verschiedenen Proteinen. Dabei ist der Ausleseparameter die Amplitude des CCF_PIE, genauer gesagt das Verhältnis der Autokorrelationsamplituden ACF_gp und ACF_rd zur Amplitude des CCF_PIE. Um den Effekt der zunehmenden Kodiffusion auf CCF_PIEzu zeigen, wurden Simulationen basierend auf den beiden einfach markierten Konstrukten β₂AR-IL3-eGFP und NT-SNAP-β₂AR durchgeführt (Abbildung 8A). Abbildung 8B zeigt, wie die Amplitude von CCF_PIE zunimmt, wenn sich der Anteil der co-diffundierenden Moleküle von 0% auf 100% ändert. Bitte beachten Sie, dass ein 1%iges Übersprechen des grünen Signals in die roten Kanäle im Verzögerungszeitfenster hinzugefügt wurde, wobei die Diffusionskomponenten ansonsten wie oben gezeigt modelliert wurden.

Abbildung 8: Mit dem CCF_PIE kann die Wechselwirkung zweier Proteine untersucht werden. (A) Hier wurde eine Co-Transfektionsstudie von β₂AR-IL3-eGFP mit NT-SNAP-β₂AR (mit einem "roten" SNAP-Label) simuliert. (B) Bei zunehmender Menge co-diffundierender Moleküle (0% (dunkelblau) -> 100% (hellblau)) nimmt die Amplitude G(t_c) zu. Der Diffusionsterm wurde erneut als bimodale Verteilung modelliert, wobei 30% der schnell diffundierenden Moleküle bei t_D1 = 1 ms und der Rest der Moleküle langsam mit t_D2 = 100 ms diffundieren. Zusätzlich wurde 1% Übersprechen des grünen Signals in das rote Verzögerungszeitfenster hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Symbol	Bedeutung (gemeinsame Einheit)
α	Übersprechen des grünen Fluorophors nach grüner Anregung in die roten Detektionskanäle (%)
a1	Anteil der ersten Diffusionskomponente im bimodalen Diffusionsmodell von Membranrezeptoren
af	Gesamtamplitude des Antikorrelationsterms
einR	Amplitude der Photophysik / Triplett-Blinken
b	Baseline / Offset einer Korrelationskurve
B	Molekülhelligkeit eines Fluorophors ((Kilo-)Zählt pro Molekül und Sekunde)
BG	Hintergrund (z.B. aus einer geeigneten Referenzprobe: ddH2O, Puffer, nicht transfizierte Zelle etc.)
c	Konzentration
CR	Zählrate (KHz oder (Kilo-) Zählungen pro Sekunde)
δ	direkte Anregung des roten Fluorophors nach grüner Anregung (%)
D	Diffusionskoeffizient (μm²/s)
G(tc)	Korrelationsfunktion
N	Anzahl der Moleküle im Fokus
NA	Avogadro-Zahl (6.022*1023 Mol-1)
rGR, rRG	Amplitudenverhältnis der grünen oder roten Autokorrelationsfunktion zur PIE-basierten Kreuzkorrelationsfunktion
s	Formfaktor des konfokalen Volumenelements
tc	Korrelationszeit (meist in Millisekunde)
TD	Diffusionszeit (in der Regel in Millisekunde oder Mikrosekunde)
tR	Entspannungszeit der Photophysik (meist in Mikrosekunde)
TT	Entspannungszeit des Triplet-Blinkens (normalerweise in Mikrosekunde)
w0	halbe Breite des konfokalen Volumenelements (μm)
z0	halbe Höhe des konfokalen Volumenelements (μm)

Tabelle 1: Liste der Variablen und Abkürzungen. Für die Verwendung von Symbolen und Definitionen in Fluoreszenz- und FRET-Experimenten werden die Richtlinien der FRET-Community⁴⁰ empfohlen.

ERGÄNZENDE DATEIEN:

SuppNote1_Coverslip Reinigung.docx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

SuppNote2_Confocal Setup.docx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

SuppNote3_Data exportieren.docx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

SuppNote4_FCCS Kalibrierungsanalyse mit ChiSurf.docx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

SuppNote5_Fluorescence Lebenslange Histogramme.docx Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

S6_Scripts.zip Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

S7_Excel_templates.zip Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

FCS-Techniken in GPCRs ermöglichen es, die Mobilität und Interaktionen von Rezeptoren in lebenden Zellen zu bewerten⁴¹. Der Vorteil der FRET-FCS-Technik besteht darin, dass neben der Mobilität auch die Konformationsdynamik von GPCRs untersucht werden kann. Die Durchführung von FRET-FCS in lebenden Zellen ist jedoch eine Herausforderung und erfordert Zellen, die eine geringe (oder maximal moderate) Expression des fluoreszierend markierten Proteins von Interesse zeigen, einen gut kalibrierten Aufbau und eine gute Pipeline zur Datenanalyse. Hier werden zunächst die kritischen Punkte der Probenvorbereitung und des experimentellen Vorgehens aus biologischer, spektroskopischer und technischer Sicht diskutiert.

Zu den kritischen experimentellen Schritten gehören die Minimierung des Hintergrunds und der Autofluoreszenz (durch die Verwendung von extensiv gereinigten Deckgläsern und phenolrotfreien Medien), die Optimierung der Transfektionsbedingungen (z. B. Menge an Plasmid-DNA und Zeit nach der Transfektion), um niedrige Expressionsniveaus und eine effiziente Markierung zu erreichen. Natürlich ist es auch wichtig sicherzustellen, dass die Funktion des markierten Proteins nicht beeinträchtigt wird. So wird in Lebendzellexperimenten die Entscheidung für die Markierungsstrategie und Markierungsposition häufig zugunsten fluoreszierender Proteine oder DES SNAP/CLIP-Tags getroffen, die an den flexiblen N- oder C-Terminus^42,43gebunden sind. Alternative Markierungsstrategien wie das Einfügen einer unnatürlichen Aminosäure mit einer reaktiven Seitenkette zur Markierung mit einem organischen Fluorophor sind in den letzten Jahren entstanden⁴⁴.

Für zweifarbige PIE-FCS, bei denen nur die Wechselwirkung zweier interessierender Moleküle untersucht werden soll, können die Fluorophore aus einer Vielzahl etablierter fluoreszierender Proteine oder SNAP/CLIP-Substrate ausgewählt werden. Hier sollte es in bezug auf die Spektroskopie das Ziel sein, ein Paar so auszuwählen, dass wenig Übersprechen oder direkte Akzeptoranregung auftritt. Zusätzlich sollten die ausgewählten Fluorophore photostabil sein und unter den gewählten experimentellen Bedingungen wenig oder gar keine Bleiche aufweisen. Es wird empfohlen, Fluorophore im roten Spektralbereich auszuwählen, da (1) der Autofluoreszenzhintergrund aus der Zelle reduziert wird und (2) das Anregungslicht von längerer Wellenlänge ist, also weniger phototoxisch¹⁴. Photobleichen können minimiert werden, indem zunächst eine sogenannte "Leistungsreihe" durchgeführt wird, bei der die Laserleistung schrittweise erhöht und die molekulare Helligkeit beobachtet wird. Der optimale Anregungsintensitätsbereich liegt im linearen Bereich der Ergebnisse⁴⁵.

Wenn die beiden Labels auch über die Proteinkonformationsdynamik durch FRET berichten sollen, ist die Auswahl an verfügbaren Fluorophoren eingeschränkter. Hier sollte der mögliche minimale/maximale Abstand zwischen den _beiden Fluorophoren vorher abgeschätzt werden, z.B. basierend auf verfügbaren Strukturen oder Molekülgrößen, und ein Fluorophorpaar mit einem vernünftigen Försterradius R0 ausgewählt werden, so dass FRET tatsächlich auftreten kann²⁰.

Hier wurden eGFP und ein SNAP-Tag für die Kennzeichnung ausgewählt, und der SNAP-Tag wurde entweder mit einem intrazellulären oder einem membranundurchlässigen Oberflächensubstrat gekennzeichnet. Die Spektren ähneln denen, die in Abbildung 2C-Dgezeigt sind. Diese Kombination von Fluorophoren zeigt ein hohes Übersprechen des eGFP in die roten Detektionskanäle und eine direkte Akzeptoranregung des SNAP-Substrats durch die grüne Anregung im Zeitfenster und führt zu einem signifikanten "falschen" Signal in den roten Kanälen im Zeitfenster. Idealerweise sollten beide Werte, Übersprechen und direkte Akzeptorerregung, 5%^5,6,38nicht überschreiten. Mit einem Försterradius von 57 Å eignet es sich jedoch ideal, um den Abstand zwischen den Etiketten im ar-IL3-CT-SNAP-Konstrukt β₂zu untersuchen, wie er aus der abgeschreckten eGFP-Lebensdauer ausgewertet werden kann (Ergänzende Anmerkung 5).

Technisch gesehen sollte das Gerät, wie bei jedem Fluoreszenzspektroskopie-Experiment, gut ausgerichtet sein und über geeignete Anregungsquellen, Emissionsfilter und empfindliche Detektoren verfügen. Um Artefakte durch Detektornachpulse auf der μs-Zeitskala zu vermeiden, sollten mindestens zwei Detektoren jeder Farbe vorhanden sein, die kreuzkorreliert werden können. In der modernen zeitkorrelierten Einzelphotonenzählelektronik spielt die Totzeit der Detektionskarte im ns-Zeitbereich aufgrund der unabhängigen Routing-Kanäle kaum eine Rolle, könnte jedoch wie von Müller et al ¹⁶ vorgeschlagen überprüft werden, sofern der interessierende Zeitbereich im Sub-μs/ns-Zeitbereich liegt. Zusätzlich sollte für noch höhere Zeitauflösungen im ps-Bereich jeder Detektionskanal verdoppelt werden, d.h. es sollten vier Detektoren pro Farbe verwendet werden, um auch Detektor-Totzeiten^2,15,29,46zu umgehen . Während die durchschnittliche Fluoreszenzlebensdauer mittels nicht polarisierter Fluoreszenzdetektion abgeschätzt werden kann, muss für die Analyse des Abstands (~Verteilung) zwischen den Fluorophoren die Emission polarisationsabhängig erfasst werden. Dies liegt daran, dass die Effizienz der Energieübertragung in FRET von der Ausrichtung der beiden Fluorophore abhängt. Genauere Informationen finden Sie hier^20,28,47. Schließlich ist in PIE-Experimenten der Abstand zwischen Prompt- und Verzögerungspuls kritisch und sollte so gewählt werden, dass die Fluoreszenzintensität der Fluorophore weitgehend zerfallen ist (Abbildung 1B). Eine gängige Regel ist, die beiden Pulse 5x der Fluoreszenzlebensdauer voneinander entfernt zu platzieren, d.h. für eGFP mit einer Fluoreszenzlebensdauer von 2,5 ns sollte der Abstand 12,5 ns bei mindestens²²betragen.

Nachdem alle Überlegungen für das experimentelle Verfahren detailliert beschrieben wurden, werden die Daten und ihre Analyse ausführlicher besprochen. Wie im Protokollabschnitt erwähnt, muss die Ausrichtung des Aufbaus täglich überprüft werden, einschließlich der Analyse der Kalibriermessungen. Die in Abbildung 2A-C dargestellten Daten zeigen z.B. eine zusätzliche Relaxationskomponente im Bereich von 8-40 μs. Es ist bekannt, dass ein typisches Triplett-Blinken des grünen Kalibrierfluorophors im Bereich von 2-10 μs^13,15,48auftritt. Die langsame Relaxationskomponente, die in allen Kurven der DNA-Probe erforderlich ist (Abbildung 3C), zu langsam für ein tatsächliches Triplett-Blinken, könnte von Wechselwirkungen der DNA mit den Fluorophoren³⁹herrühren. Diese Komponente wäre jedoch in CCF_PIEnicht zu erwarten und stammt höchstwahrscheinlich aus einem verbleibenden Übersprechen. Daher ist es sehr ratsam, die Analyse der Kalibrierproben direkt vor den Zellexperimenten durchzuführen, um die Qualität der Ausrichtung des Tages zu beurteilen.

Die richtige Kalibrierung des konfokalen Überlappungsvolumens erfordert eine Probe mit 100% Co-Diffusion der grünen und roten Markierung. Hier kommt fluoreszierend markierte doppelsträngige DNA zum Einsatz. Beide DNA-Stränge können so zugeschnitten werden, dass sie die gewünschten Fluorophore im erforderlichen Abstand zueinander haben. Die entworfenen Stränge können mit hoher Ausbeute geglüht werden. Die Gute Laborpraxis empfiehlt jedoch, die Integrität und den Markierungsgrad der DNA-Stränge durch Agarosegelelektrophorese zu überprüfen und das Absorptionsspektrum zu messen. Auch die Ausbeute der doppelsträngigen Baugruppe sollte überprüft werden, da diese Kalibrierungsmessung kritisch auf der Annahme beruht, dass es eine 100%ige Kodiffusion des Grüns mit dem roten Etikett gibt. Falls die Annahme nicht stichhaltig ist, müssen möglicherweise Korrekturfaktoren angewendet werden^16,22. In den in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigten Kalibriermessungen wurde ein Nachweisvolumen von 1,4 fL bzw. 1,9 fL im grünen bzw. roten Kanal erhalten. Dieser Größenunterschied wird für einen Aufbau mit nahezu beugungsbegrenzten Anregungsvolumina erwartet (Ergänzende Anmerkung 2). Unter dieser Bedingung skaliert die Größe des Anregungsvolumens mit der Anregungswellenlänge. Dies wiederum erklärt die unterschiedlichen Korrelationsamplituden, die in Abbildung 3Bbeobachtet wurden. Die abgeleiteten Korrekturfaktoren r_GR = 0,56 und r_RG = 0,72 korrigieren für diese Größendiskrepanz und mögliche nicht perfekte Überlappung der beiden Anregungsvolumina^3,4.

Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6und Abbildung 7 zeigen den Arbeitsablauf einer PIE-F(C)CS-basierten Studie, die darauf abzielt, die Konformationsproteindynamik zu verstehen. Zunächst dienen die_beideneinfach markierten Konstrukte β₂AR-IL3-eGFP und NT-SNAP-β 2 AR als Kontrollen, um die Fluorophoreigenschaften in Zellen in Abwesenheit des jeweils anderen Fluorophors zu charakterisieren (Abbildung 4). Als nächstes dient das doppelt markierte Konstrukt NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP, das ein SNAP-Tag trägt, das der Zelle außen zugewandt ist, und ein eGFP auf der zytoplasmatischen Seite als "100% Co-Diffusion" -Kontrolle (Abbildung 5). Das letzte Konstrukt, β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP, trägt beide Fluorophore auf der zytoplasmatischen Seite und nahe genug beieinander, um sich einer FRET zu unterziehen. Auch hier wäre eine 100%ige Co-Diffusion in Verbindung mit antikorrelierten Intensitätsschwankungen im grün- und roten Kanalsignal im zeitnahen Zeitfenster, d.h. nach Donoranregung, aufgrund der Proteindynamik, die den FRET-Wirkungsgrad beeinflusst, zu erwarten^31,32,33. Diese Dynamik könnte sich im CCF_FRET als Antikorrelation zeigen (Abbildung 6-7).

Alle GPCR-β_{2 AR-Konstrukte}zeigen eine bimodale Diffusion auf der Zellmembran (Abbildung 4A). Während der β₂AR-IL3-eGFP nur das erwartete Triplett blinkt (Abbildung 5B)^13,15, NT-SNAP-β₂AR eine zusätzliche langsame Relaxationszeit zeigt ( Abbildung5C-D). Es ist wahrscheinlich, dass t_R2 aus ungebundenem SNAP-Substrat stammen könnte. Dies könnte durch weitere Experimente aufgeklärt werden, z.B. indem auch die Diffusions- und photophysikalischen Eigenschaften des verwendeten SNAP-Substrats in einer wässrigen Lösung gemessen werden. Bemerkenswert ist, dass ein einfaches Experiment zur Unterscheidung zwischen Diffusions- und Relaxationszeiten darin besteht, das Loch des konfokalen Aufbaus zu ändern, d.h. das effektive Volumen zu erhöhen: Während die Diffusionszeiten mit zunehmenden effektiven Volumina zunehmen, sind die Relaxationsterme unverändert¹³. Beachten Sie bei der Bestimmung der Konzentration des fluoreszierenden Proteins (FP) auf der Grundlage der Fit-Ergebnisse, dass FPs im Allgemeinen einen Reifungsprozess durchlaufen, bei dem schließlich das Chromophor gebildet wird¹². Diese Reifezeit kann von FP zu FP abweichen, zusätzlich zur Photophysik, die von der lokalen chemischen Umgebung abhängt^13,15. Daher wird die tatsächliche Proteinkonzentration in der von FCS gemeldeten Probe in der Regel unterschätzt, was korrigiert werden kann, wenn der Anteil der nicht-fluoreszierenden FPs im Experiment bestimmt werden kann. Schließlich ist es ratsam, die Fluorophorspektren in lebenden Zellen zu überprüfen, um die Werte für α zu korrigieren und gegebenenfalls δ, da die meisten Fluorophore empfindlich auf ihre Umgebung reagieren^13,15,48. Der zu subtrahierende Hintergrund wird durch das signal bestimmt, das in nicht transfizierten Zellen gesammelt wird. Zusätzlich sollte die Autokorrelation des jeweils anderen Farbkanals und des CCF_PIE überprüft werden, um falsche Signale erkennen zu können (Ergänzende Anmerkung 4 - Abbildung 30).

Die beiden Messungen des NT-SNAP-β₂AR-IL3-eGFP (Abbildung 5D), bei denen sich die Fluorophore auf verschiedenen Seiten der Membran befinden, wurden an verschiedenen Tagen aufgenommen und zeigen die Bedeutung von Statistiken bei der zeitaufgelösten Einzelmolekülfluoreszenz. Hier können die unterschiedlichen Ergebnisse auf den unterschiedlichen Grad der Markierung zurückzuführen sein: In einer Zelle führte der höhere Grad der Markierung und Mittelung der Messungen zu relativ geringem Rauschen (Abbildung 5B), während von der anderen Zelle nur zwei Messungen gesammelt werden konnten (Abbildung 5A). Neben dem Sammeln einer ausreichenden Datenmenge ist es wichtig, die Ergebnisse rechtzeitig zu bewerten und möglicherweise die Etikettierungsstrategie zu optimieren. Bei der Gestaltung der Experimente ist es wichtig, daran zu denken, dass FRET empfindlich ist, aber auf Entfernungen bis zu 10 nm beschränkt und ansonsten "blind" ist. In unserem Fall wird diese "Blindheit" durch die unveränderte eGFP-Fluoreszenzlebensdauer angezeigt (Ergänzende Anmerkung 5). Im β₂AR-IL3-eGFP-CT-SNAP-Konstrukt (Abbildung 6A) kann FRET aus der abgeschreckten eGFP-Lebensdauer ermittelt werden (Ergänzende Anmerkung 5). Es wird jedoch kein Antikorrelationsterm beobachtet (Abbildung 6B), was bedeutet, dass FRET entweder nicht schwankt oder auf einer Zeitskala langsamer als die Diffusionszeit ist. Bis zu drei zusätzliche Entspannungsterme sind in ACF_gp, ACF_rp, ACF_rd und CCF_FRET erforderlich (Abbildung 6C). Die langsame Komponente in ACF_rp, ACF_rd und CCF_FRET kann auf akzeptorische Bleiche zurückzuführen sein und beeinflusst natürlich den erhaltenen Wert der langsamen Diffusion in diesen Kurven (~ 350 ms im Vergleich zu 117 ms in ACF_gp). t_D im roten Kanal soll aufgrund der unterschiedlich großen konfokalen Volumina etwas größer sein als im grünen Kanal (Abbildung 2) - allerdings nur um einen Mit dem Größenunterschied vergleichbaren Faktor. Die sehr schnelle Relaxationszeit von 3 μs spiegelt das Triplett-Blinken der Fluorophore^13,15,^48wider,während die langsamere Relaxationszeit von 37 μs auf FRET zurückzuführen sein könnte: Ähnlich wie FRET eine Antikorrelation im CCF_FRETinduziert , werden positive Korrelationen in den Autokorrelationen 31^,32,33erwartet . Das Vorhandensein dieses Begriffs als "positiv" in CCF_FRET und sein Vorhandensein in der ACF_rd könnte mit dem hohen Crosstalk erklärt werden und sollte weiter aufgeklärt werden. Beachten Sie, dass der CCF_PIE bei kurzen Korrelationszeiten wie erwartet flach ist.

Andererseits ist zu beachten, dass das Auftreten von FRET in einem interessierenden System zu nichtlinearen Effekten auf die Korrelationskurven führt⁶. Die molekulare Helligkeit z.B. eines Moleküls skaliert in die Korrelationsamplitude im Quadrat und jeder FRET-Zustand (und die immer vorhandenen Moleküle ohne aktiven Rezeptor) zeigt eine unterschiedliche molekulare Helligkeit. Tatsächlich verringert FRET die scheinbare Konzentration der nachgewiesenen grünen Moleküle (d.h. erhöht die ACF_{gp-Amplitude)} und die Anzahl der roten Moleküle (bestimmt aus rot-prompt) wird überschätzt⁵. Beide Effekte beeinflussen die Menge der Wechselwirkung, die sowohl von CCF_FRET als auch von CCF_PIEabgeleitet wird. Globale Analysen, wie sie z.B. für die intramolekulare Dynamik von Calmodulin ^31,32 oder Syntaxin³³ gezeigt werden, können jedoch die Proteindynamik aufdecken. Bei sorgfältiger Kalibrierung kann der durchschnittliche FRET-Wirkungsgrad aus den relativen _CCF-PIE- und ACF-Amplituden²²extrahiert werden, während die Grenzzustände aus der Analyse der Donorfluoreszenz-Lebensdauerverteilung³³bestimmt werden können.

In Anbetracht der Tatsache, dass in Lebendzellexperimenten mit großen Fluorophoren wie eGFP der FRET-Kontrast wahrscheinlich noch geringer ist als bei den in Abbildung 6 gezeigten Simulationen angenommen und dass die direkte Anregung des Akzeptors in der Simulation nicht hinzugefügt wurde, könnte erklären, warum die Identifizierung der Antikorrelation in Lebendzellexperimenten sehr schwierig ist. Eine vielversprechende Analysealternative beruht auf der Ernte der Informationen, die in den Photonen-Ankunftszeithistogrammen (Abbildung 1B) kodiert sind, die aufgrund der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählungsdatenerfassung zugänglich sind^29,30. Wenn die Fluoreszenzlebensdauer (~Muster) der beiden (oder mehr) (FRET) Spezies innerhalb der Probe bekannt sind (Abbildung 7A), können "Filter" oder Gewichte gewählt werden, die während des Korrelationsprozesses angewendet werden (Abbildung 7B)^17,18,19. Die so erhaltenen Korrelationskurven stellen nicht mehr die Korrelation von Detektionskanälen dar, sondern die Auto- oder Kreuzkorrelationen zwischen zwei verschiedenen (FRET) Arten, die daher in Spezies-ACF (sACF) oder Spezies-CCF (sCCF) umbenannt wurden. Wendet man diesen Ansatz auf die simulierten Daten mit moderatem FRET-Kontrast, hohem Übersprechen und Triplett-Blinken an, erhält man den Antikorrelationsterm zurück (Abbildung 7C-D). Es sollte jedoch beachtet werden, dass Relaxationszeiten erhalten werden können, aber die Beziehung zur Amplitude verloren geht¹⁸. Dieser Ansatz wurde zuvor in Lebendzellexperimenten angewendet, z.B. um die Wechselwirkung von EGFR mit seinem Antagonisten⁴⁹ zu untersuchen oder die Fluoreszenz von Proteinen zu trennen, die an eGFP-Varianten mit außergewöhnlich kurzen und langen Fluoreszenzlebensdauern gebunden sind⁵⁰.

Während PIE-basierte FRET-Messungen in gereinigten Proteinen weitgehend zur Untersuchung der Proteindynamik³⁶²²verwendet werden, konzentriert sie sich in lebenden Zellen auf das Verständnis von Protein-Protein-Interaktionen. Dieser Ansatz wurde angewendet, um die Regulation der MAP-Kinase-Aktivität in Hefe⁵¹ zu untersuchen oder die Wechselwirkung von Membranproteinen mit ihrem zytosolischen Bindungspartner aufzulösen, wie in diesem kürzlich erschienenen Artikel⁵²zusammengefasst. Hier können Komplikationen auftreten, wenn im Verzögerungszeitfenster der roten Kanäle noch ein signifikantes Übersprechen von grünen Fluorophoren oder im Zeitfenster ein rotes Signal in den grünen Kanälen vorhanden ist. Ersteres könnte durch eine unzureichende Verzögerung des roten Pulses in Bezug auf den grünen Puls verursacht werden, während beide Effekte auf zu stark überlappende Anregungs- und Emissionsspektren der gewählten Fluorophore zurückzuführen sind. Es wird empfohlen, die jeweiligen einzelnen markierten Konstrukte sorgfältig zu überprüfen und auf falsch positive CCF-PIE-Amplituden zu korrigieren, insbesondere in Zellen, in denen die Autofluoreszenz mit sehr kurzer Fluoreszenzlebensdauer ein weiterer komplizierender Faktor sein könnte²².

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene FRET-FCS-Ansatz ein großes Potenzial hat, Protein-Protein-Interaktionen und Proteindynamik in lebenden Zellen in nahezu physiologischen Konzentrationen zu verstehen. In diesem Protokoll wurde der Fokus auf die erforderlichen Kalibriermessungen und die notwendige quantitative Analyse gelegt, die während der Lebendzellmessungen durchgeführt werden muss. Dazu wurden verschiedene Lebendzellmessungen gezeigt, ergänzt durch Simulationen. Die Simulationen liefern hier das allgemeine Verständnis, da Parameter systematisch mit maßgeschneiderten Fit-Modellen variiert werden könnten, die die spezifische Mobilität und photophysikalischen Eigenschaften der jeweiligen Daten beschreiben. Die Analyse wurde mit Open-Source-Softwaretools mit einem umfangreichen Schritt-für-Schritt-Protokoll und einfach anzupassenden Vorlagen durchgeführt. Schließlich werden die technischen Fortschritte und damit die Verfügbarkeit von kauffertigen stabilen PIE-FCS-Systemen zusammen mit der Verbreitung von Open-Source-Software zur Datenanalyse diese Technik für eine größere Forschungsgemeinschaft immer zugänglicher machen, um schließlich die Proteininteraktion und -dynamik in lebenden Zellen mit höchster Empfindlichkeit zu entschlüsseln.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Telescope in 4f configuration with five lenses	Qioptiq, Rhyl, UK	G063126000	Optics
2x Band pass filters Brightline	AHF, Tübingen, Germany	HC 525/50 and HC 600/52	Filter
2x Dichroic beam splitter	AHF, Tübingen, Germany	HC BS F38-573	Filter
6-well culture plate Nunc	Thermo Scientific (Waltham, USA)	140675	Reagent
Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20000	Reagent
Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard)	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A20003	Reagent
ASI stage PZ-2000 XYZ	Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany	WK-XYB-PZ-IX71	Microscope Parts
Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for  25 mm round coverslips	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	A7816	Glass coverslip holder
Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14)	Laser Components GmbH, Olching, Germany	SPCM-AQR-14	Single photon counting detector
Beamsplitter	Newport, Darmstadt, Germany	10FC16PB.3	Filter
Biorender (Software)	Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada)	---	Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/
Chinese hamster ovary (CHO) cell line	ATCC	CCL-61	Cell lines
ChiSurf (Data analysis Software)	Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA	---	tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017)
Chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	472476-2.5L	Reagent
DMSO	AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany)	A3672,0250	Reagent
DNA strand (40 bp fluorophore distance)	IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany)	---	Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	P04-41250, P04-41650	Reagent
Ethanol (absolute)	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	34852-1L-M	Reagent
Erythrosin B,Dye content >=95 %	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	200964-5G	Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biochrom  (Berlin, Germany)	S 0615	Reagent
Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q	Excelitas Technologies, Ontario, Canada	XI120-Q-5060	Microscope Parts
Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9105S	Reagent
Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549	New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany)	S9112S	Reagent
Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	111640	Reagent
Laser Controller	Picoquant, Berlin, Germany	910020 (PDL 828-S "SEPIA II")	Optics
Laser lines (480 nm and 560 nm)	Picoquant, Berlin, Germany	912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560)	Optics
Lipofectamine 2000	Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA)	11668-019	Reagent
MFD suite (Software)	AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany	---	Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis
Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	AC254-150-A-ML	Second part of Beam expander
Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm)	Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany)	640110	Reagent
Olympus IX 71 stand	Olympus, Hamburg, Germany	IX2-ILL100	Microscope Parts
Opti-MEM (Reduced-Serum Medium)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	31985-047	Reagent
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	049M4857V	Reagent
Phosphate-buffered Saline (PBS)	GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA)	14190144	Reagent
Pinhole (50 µM)	Newport, Darmstadt, Germany	PNH-50	Pinhole
PMT Hybrid-40	Picoquant, Berlin, Germany	932200 (PMA Hybrid 40)	Single photon counting detector
Python scripts (Software)	Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany	---	Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS
Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1)	AHF, Tübingen, Germany	F73-421PH	Filter
Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator	Picoquant, Berlin, Germany	02126	Optics
Sodium Hydroxide (NaOH)	Carl Roth (Karlsruhe, Germany)	6771.1	Reagent
SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software)	Picoquant, Berlin, Germany	931073 (SPT64-1+2 single user )	Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400	Picoquant, Berlin, Germany	930010 (Hydraharp 400)	Optics
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)	T4299-100ml	Reagent
Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm	Thorlabs, Bergkirchen, Germany	ACN127-020-A	First part of Beam expander
Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W)	Olympus, Hamburg, Germany	UPLSAPO60XW	Objective