Erzeugung größerer bakterieller Biofilm-Biomasse mit PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Methodik zur Durchführung von Biofilmwachstums- und Biomassemessungen unter Verwendung von selbstmontierten Tiefbrunnen-PCR-Plattengeräten für ein statisches Biofilm-Screening mit 96-Well-Deckel mit hohem Durchsatz vor.

Zusammenfassung

Bakterielle Biofilme lassen sich mit herkömmlichen antimikrobiellen Eingriffen nur schwer von Oberflächen entfernen. Hochdurchsatz-96-Well-Mikroplattenmethoden werden häufig verwendet, um bakterielle Biofilme für schnelle antimikrobielle Suszeptibilitätstests zu kultivieren, um minimale Werte für die Biofilmeradikationskonzentration (MBEC) zu berechnen. Standard-Biofilmgeräte bestehen aus Polystyrol-Pegged-Deckeln, die an 96-Well-Mikrotiterplatten angebracht sind, und sind ideal für die Messung von Biofilm-Biomasse und MBEC-Werten, aber diese Geräte sind durch die verfügbare Peg-Oberfläche für die Ansammlung von Biomasse und die Kosten begrenzt. Hier skizzieren wir ein Protokoll zur Verwendung von selbst zusammengesetzten Polypropylen 96-Well Deep Well PCR-Plate Pegged-Lid-Gerät, um Escherichia coli BW25113 und Pseudomonas aeruginosa PAO1 Biofilme zu züchten. Es wird ein Vergleich von 24-Stunden-Biofilmen beschrieben, die von jeder Spezies auf Standard- und Tiefbrunnengeräten unter Verwendung von kristallvioletter Biomassefärbung und MBEC-Bestimmungsassays gebildet wurden. Die größere Oberfläche der Tiefbrunnengeräte erhöhte erwartungsgemäß die gesamte Biofilmbildung beider Spezies um das 2-4-fache. P. aeruginosa bildete im Vergleich zum Standardgerät signifikant mehr Biomasse^/mm2 an tiefen Bohrlochpflöcken. E. coli hatte eine größere Biomasse^/mm2 bei Standard-Polystyrol-Geräten im Vergleich zum Tiefbrunnengerät. Biofilm-Eradikationstests mit Desinfektionsmitteln wie Natriumhypochlorit (Bleichmittel) oder Benzalkoniumchlorid (BZK) zeigten, dass beide Verbindungen E. coli- und P. aeruginosa-Biofilme aus beiden Geräten eliminieren konnten, jedoch bei unterschiedlichen MBEC-Werten. Die BIZK-Biofilmeradikation führte zu variablen E. coli-MBEC-Werten zwischen den Geräten, jedoch zeigte Bleichmittel reproduzierbare MBEC-Werte sowohl für Spezies als auch für Geräte. Diese Studie bietet eine Hochdurchsatz-Tiefbrunnenmethode für das Züchten größerer Mengen von Biofilmen auf Polypropylen-Bauelementen für nachgelagerte Studien, die höhere Mengen an statischen Biofilmen erfordern.

Einleitung

Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli sind gramnegative Proteobakterien, die häufig auf ihre Fähigkeit untersucht werden, sessile, an die Oberfläche gebundene Zellgemeinschaften zu bilden, die als Biofilme bekannt ^sind1. Beide Spezies können, wenn sie als Biofilme wachsen, eine Matrix extrazellulärer polymerer Substanzen (EPS) absondern, die hauptsächlich aus verschiedenen Polysacchariden und Proteinen bestehen, die auch extrazelluläre DNA und/oder Lipide enthalten können, was zusätzlichen zellulären Schutz und ein verbessertes Überleben in rauen, nährstoffbegrenzten Umgebungen ^bietet2,3. Die Biofilmphysiologie und -bildung beider Arten ist von klinischer Bedeutung, da sie die fünf am häufigsten isolierten antimikrobiell resistenten Krankheitserreger aus Blut-, Harnwegs- und Lungeninfektionen von Krankenhauspatienten in Kanada ^{darstellen4,5}. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Biofilme schätzungsweise fast 80% aller chronischen und wiederkehrenden Infektionen ausmachen, die durch diese Bakterienarten verursacht ^werden6. Aufgrund der sezernierten EPS-Substanzen und der langsameren ^{Stoffwechselaktivität7,8} werden etablierte Biofilme schwieriger zu beseitigen, wenn sie sich auf Oberflächen wie implantierten medizinischen Geräten, Narbengewebe und in den Lungen von Mukoviszidose-Patienten ^bilden9,10 was zu ihrer antimikrobiellen Resistenz beiträgt.

Die widerspenstigen Wachstumseigenschaften bakterieller Biofilme machen sie oft resistenter gegen antimikrobielle Hemmung und/oder ^{Ausrottung2,9}. Daher ist die Etablierung von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der antimikrobiellen Eradikation von bakteriellen Biofilmen von größter Bedeutung für die Auswahl wirksamer Verbindungen zur Ausrottung von Infektionen, wenn sie sich auf medizinischen Kunststoffen (z. B. In-Dwelling-Kathetern) und medizinischen Implantaten bilden. Die meisten schnellen In-vitro-Biofilm-Kultivierungsmethoden zur antimikrobiellen Eradikation untersuchen das Biofilmwachstum als "statische" Biofilmkultur und nicht als "kontinuierliche" Kulturen, bei denen das statische Bakterienwachstum in frühen bis späten Stadien der Biofilmbildung über einen kurzen Zeitraum (24-96 h) im selben Wachstumsmedium überwacht wird. Kontinuierliche Biofilmmethoden sind für eine schnelle Analyse umständlich, da sie eine Beurteilung des Biofilmwachstums über längere Zeiträume erfordern, die in Kammern gezüchtet werden, die den kontinuierlichen Fluss und den Ersatz von Wachstumsmedien mit weniger Replikaten ^{ermöglichen11.} Aufgrund des Zeit- und Arbeitsaufwands, der für die Wartung und Etablierung kontinuierlicher Biofilme erforderlich ist, sind statische In-vitro-Biofilme am beliebtesten, da sie leicht für antimikrobielle Hochdurchsatz-Suszeptibilitätstests in Kunststoff-96-Well-Mikrotiterplatten und nicht für ausgeklügelte Durchflusskammersysteme geeignet sind, die die Anzahl der gleichzeitig getesteten Kulturen begrenzen ^12,13 . Die einfachsten statischen "In-Well"-Biofilm-Mikrotiterplatten-Assays verwenden Standard-Mikrotiterplatten aus Polystyrol oder Vinyl (Kapazität von 300 μL), um die Biofilmbildung an den Seiten und Böden jedes Bohrlochs und oft als Ringe an der Luft-Flüssigkeits-Oberflächenschnittstelle zu messen. Die bakterielle Biofilmbildung wird gemessen, indem die abgelagerte Biomasse, die an den Vertiefungen haftet, gefärbt wird, nachdem die Wachstumsmediumflüssigkeit entfernt und die Biofilme gewaschen ^wurden12,13. Diese Assays sind wirtschaftlich beliebt, haben aber aufgrund ihres inhärenten Designs oft Reproduzierbarkeitsprobleme, da abgelagerte Biofilme während des Spülens für Zellgewinnungs- und Biomassefärbungsverfahren anfällig für Schäden oder ^{Verluste sind11,14.}

Um Biofilmverluste zu reduzieren, haben handelsübliche Biofilmgeräte die In-Well-Biofilm-Mikroplattendesigns verbessert, indem dem Standard-96-In-Well-Plattendesign, das hierin als "Standard-Biofilm-Gerät" bezeichnet wird, ein einführbarer 96-Well-gebundener Polystyroldeckel hinzugefügt wurde. Das Hinzufügen eines gebundenen Deckels erweitert die verfügbare Oberfläche in jeder Mikrotiterplattenvertiefung, was eine verbesserte Oberflächenhaftung und Biofilm-Biomassebildung ^{ermöglicht15,16}. Standard-Biofilm-gebundene Deckelgeräte ermöglichen eine bessere Wiederherstellung, Entfernung und Spülung von Biofilmen für nachfolgende antimikrobielle Biofilm-Empfindlichkeits- und Eradikationstests, wenn gefixte Lider in neue Mikrotiterplatten eingeführt werden, die Arzneimittel- oder Wachstumsprobleme enthalten. Ähnlich wie bei In-Well-Biofilm-Mikroplattentechniken ermöglichen die gewonnenen Materialien aus den entfernten und gewaschenen Deckelvorrichtungen Zellüberlebenstests und Biofilm-Biomassefärbungen, typischerweise mit kristallvioletten (CV) Farbstoffformulierungen ^17,18,19. Standard-Biofilmgeräte sind auch optimal für das Screening antimikrobieller Empfindlichkeiten von Biofilmen. Diese Assays überwachen die Hemmung des Biofilmwachstums auf zwei Arten: 1) Wenn den Zellen zu Beginn des Wachstums antimikrobielle Mittel zugesetzt werden, kann dies den minimalen Wert der Biofilmhemmungskonzentration (MBIC) bestimmen. 2) Wenn sich nach 24 Stunden etablierte Biofilme an den Heringen bilden und dann antimikrobiellen Mitteln ausgesetzt werden, kann der minimale ^MBEC-Wert (Biofilm Eradication Concentration) ^{von 17,20} bestimmt werden. Ähnlich wie In-Well-Biofilm-Mikroplattengeräte haben Standard-Biofilmgeräte einige bemerkenswerte Einschränkungen, wie z. B. ihre hohen Kosten pro Gerät, sie sind nicht autoklavierbar und aufgrund des verwendeten Polystyrolplattenmaterials weniger haltbar für chemische Lösungsmittel. Standard-Biofilmgeräte haben auch ein niedriges Verhältnis von Oberfläche zu Peg, wodurch das maximale Arbeitsvolumen in jedem Vertiefungsraum auf 200 μL begrenzt wird. Diese Faktoren können die Verwendung von Standard-Biofilmgeräten für Studien, die größere Mengen an Biofilm in einem Hochdurchsatzformat erfordern, schwieriger machen.

Hier beschreiben wir eine statische Biofilm-Pegged-Lid-96-Well-Methode, die in unserem Labor unter Verwendung kommerziell erhältlicher Polypropylen-Semiskirted-0,5-ml-96-Well-PCR-Platten entwickelt wurde, die an 96-Well-Mikrotiterplatten angebracht sind, deren Vertiefungen tiefer als die Standardplatte sind (Tabelle der Materialien). Diese zusammengesetzten Geräte haben ein maximales Arbeitsvolumen von 750 μL, wenn sie für den Anbau von Biofilm verwendet werden (hierin als "Deep Well Biofilm Device" bezeichnet). Die Vorteile der Verwendung dieser Tiefbrunnen-Biofilmgeräte sind ihre niedrigeren Kosten im Vergleich zu Standard-Biofilmgeräten, sie können durch Autoklavieren sterilisiert werden und sie vergrößern die Oberfläche für die Biofilmbildung auf der größeren externen PCR-Platte "Tube / Pegs". Mit dieser Methode zeigen wir die Anwendungen dieser Geräte zur Züchtung und Charakterisierung von Biofilmbiomasse, die von Escherichia coli BW25113 und P. aeruginosa PAO1 gebildet wird. Methoden zur Bestimmung der MBEC-Werte unter Verwendung von Biofilm-Eradikationsassays werden unter Verwendung des quartären Ammoniumverbindungsdesinfektionsmittels Benzalkoniumchlorid (BZK) und der Natriumhypochlorit (Bleichmittel) antimikrobiellen Mittel beschrieben. Das Antiseptikum/Desinfektionsmittel BZK wurde ausgewählt, da diese Verbindung häufig zur Hemmung von Biofilmen von kontaminierten Oberflächen verwendet wird, aber Berichten zufolge bei der Ausrottung etablierter Biofilme weniger wirksam ^ist21. Bleichmittel ist eine hochwirksame Chemikalie zur Ausrottung etablierter Biofilme und eine tragende Säule der chemischen Desinfektion ²². Beide Desinfektionsmittel bieten einen nützlichen Vergleich der MBEC-Werte für jedes ^{Biofilmgerät21}. Ein Protokoll für diese Biofilm-Gerätebewertung unter Verwendung von CV-Färbe- und Biofilm-Eradikationsassays für die MBEC-Bestimmung ist in diesem Artikel zusammengefasst. Für eine vereinfachte Übersicht über den Workflow für diese Methoden wurde ein Protokollflussdiagramm eingefügt (Abbildung 1).

Protokoll

1. Aseptische Kulturvorbereitung für das Biofilmwachstum (Tage 0-1)

1. Streichen Sie am Tag 0 die gewünschten Bakterienstämme zum Testen aus einem kryokonservierten Stamm (in Glycerin oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) direkt auf eine Nährstoffagarplatte mit antimikrobieller Selektion, je nach Sorte. Inkubieren Sie Agarplatten bei der optimalen Temperatur (37 °C) und Zeit (18-22 h) für das Stammwachstum.
2. Beimpfen Sie am folgenden Tag (Tag 1) eine Kolonie aus der Agarplatte in 5 ml Wachstumsmedien bei optimalen Wachstumsbedingungen. Diese Kulturen werden als Tag 2-Startimpfstoffe für Biofilmgeräte verwendet (siehe Schritt 2.2; Abbildung 1).
   HINWEIS: Für diese Studie wurden E. coli K-12 BW21153 und P. aeruginosa PAO1 in Luria-Bertani (LB) Medium bei 37 °C für 18 h mit Schütteln bei 160 Umdrehungen pro Minute (U/min) gezüchtet.
   1. Bereiten Sie mindestens 3 unabhängig voneinander kultivierte Stämme vor, um biologische Replikate für die Biofilmmessung aufgrund der statistischen Variabilität der Biofilm-Biomassebildung auf den gebundenen Deckelgeräten zu erzeugen.

2. Vorbereitung und Impfung der Platten (Tag 2)

1. Füllen Sie die äußeren Vertiefungen einer autoklavierten Polypropylenplatte mit 96 Wells, 1,1 ml/Well mit sterilem Wasser aus 750 μL/Well (Abbildung 2A). Füllen Sie die Negativkontrollvertiefungen (ungeimpfte Medienvertiefungen; Spalte B) mit 750 μL Wachstumsmedien und die restlichen Vertiefungen mit 675 μL Wachstumsmedien.
   HINWEIS: Schritt 2.1 oben und Schritte unten listen geeignete Volumina für das Tiefbrunnen-Biofilmgerät auf. Bei Verwendung des Standard-Biofilmgeräts sind die Volumina wie folgt zu ändern: 75 μL Inokulumkultur auf 20 μL; 675 μL Wachstumsmedien bis 180 μL; 750 μL steriles Wasser/Wachstumsmedien bis 200 μL; 800 μL CV-Flecken/Essigsäure/Spüllösungen bis 210 μL. Darüber hinaus kann für Schritt 3.6 unten die Absorption bei 500nm (_{A550 nm}) direkt in der Polystyrol-Mikroplatte nach dem Mischen bei Verwendung der Standard-Biofilm-Mikrotiterplatte abgelesen werden.
2. Standardisieren Sie die Kulturen mit Tag-1-Kulturen über Nacht auf eine optische Dichte bei 600 nm (_OD600nm) = 1,0 oder auf einen McFarland-Standard von 0,5-1-Einheiten.
3. Erstellen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung jeder standardisierten Kultur in Reagenzgläsern oder einer 96-Well-Tiefbrunnen-Mikrotiterplatte, bis eine ^{10-3-Verdünnung} erreicht ist.
4. Beimpfen Sie die Medien, die Vertiefungen enthalten, wie in Abbildung 2B gezeigt, mit 75 μL der 1 x 10-3 verdünnten Kultur, um eine endgültige bakterielle Verdünnung von ^10-4 in der Vertiefung zu erhalten.
5. Führen Sie vorsichtig eine autoklavierte PCR-Platte (Pegged Lid) in die geimpfte Tiefbrunnenplatte ein. Inkubieren Sie Platten bei optimalen Dehnungsbedingungen (37 °C) mit Schütteln (maximal 160 U/min) in einem Inkubator mit 50-60% Luftfeuchtigkeit für 24 h.

3. Biofilm-Biomassebestimmung aus Geräten mit CV-Färbung (Tag 3)

1. Entfernen Sie den Biofilm-gebundenen Deckel aseptisch von jedem Gerät und spülen Sie ihn ab, indem Sie ihn in eine autoklavierte Tiefbrunnenplatte einführen, die mit 800 μL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) / Well für 30 s vorbereitet wurde, um Planktonzellen zu entfernen.
2. Für die Biomasse-CV-Färbung wird der gebundene PCR-Plattendeckel in eine neue Platte mit 800 μL/Well 0,1% (w/v) CV in _dH2O gegeben und 5 Minuten lang gefärbt.
3. Entfernen Sie überschüssige Flecken, indem Sie den befestigten Deckel in einer tiefen Well-Platte spülen, die mit 800 μL / Well sterilem PBS vorbereitet wurde. Lassen Sie die Platten 10 Minuten in einer Biosicherheitskabine mit Stiften nach oben trocknen.
4. Den getrockneten PCR-Plattendeckel auf eine Platte mit 800 μL/Well 30% (v/v) Essigsäure geben und den Deckel 5 Minuten lang entfärben lassen.
5. Entfernen Sie den fleckigen PCR-Stiftdeckel und mischen Sie die Lösung gründlich durch Pipettieren. Übertragen Sie 200 μL von den Tiefseeplatten auf eine Standard-96-Well-Mikroplatte und messen Sie die Absorption der Entfärbungslösung bei einer Wellenlänge von 550 nm (_A550nm) in einem Mikroplattenleser im ultravioletten (UV) / sichtbaren (Vis) Bereich.
6. Subtrahieren Sie unter Verwendung der gemessenen A550nm-Werte den durchschnittlichen Leerwert (Negativkontrolle) _A550nm von jedem Biofilm-Probenwert. Durchschnittlich wird jeder leer subtrahierte _{A550nm-Biofilm-Probenwert} angegeben, der biologische Replikate der Probe darstellt.

4. Anspruchsvolle Biofilme mit antimikrobiellen Mitteln, um ihren 24 h antimikrobiellen MBEC-Wert zu berechnen (Tag 3)

1. Bereiten Sie eine antimikrobielle Stammlösung in Wasser vor, die zweimal (2x) der zu testenden Konzentration der gewünschten höchsten antimikrobiellen Konzentration entspricht.
2. Erstellen Sie eine zweifache Verdünnungsreihe der antimikrobiellen Stammlösung in 2x konzentrierten Wachstumsmedien, so dass 8 antimikrobielle Konzentrationen vorhanden sind.
3. Wie in Abbildung 2B gezeigt, füllen Sie die äußeren Vertiefungen einer autoklavierten Tiefbrunnenplatte mit 750 μL/gut sterilem Wasser. Füllen Sie die Spalten B (Negativkontrolle; keine Bakterien) und C (Positivkontrolle; keine antimikrobielle Exposition) der Platte mit 750 μL/Well Wachstumsmedien. Füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit 750 μL/Vertiefung der antimikrobiellen Verdünnungsreihe, wie in Abbildung 2B dargestellt.
4. Entfernen und spülen Sie den gebundenen Deckel wie in Schritt 3.1 beschrieben aus und geben Sie ihn in die antimikrobielle Challenge-Platte.
5. Inkubieren Sie Platten mit Schütteln (max. 160 U / min) unter geeigneten Dehnungsbedingungen und für den gewünschten Belichtungszeitraum.

5. Rückgewinnung von Biofilm-Biomasse aus gebundenen Deckeln (Tag 4)

1. Entfernen Sie antimikrobiell exponierte Deckel und spülen Sie sie wie in Schritt 3.1 beschrieben ab. Überführen Sie den gebundenen Deckel auf eine Tieflochplatte mit 750 μL/Well-Rückgewinnungsmedien in den inneren Vertiefungen und 750 μL/Well sterilem _dH2O in den äußeren Vertiefungen.
   1. Um 70 ml Rückgewinnungsmedien herzustellen, kombinieren Sie 35 ml 2x konzentriertes LB, 0,7 ml 100% Tween-20, 3,5 ml 20x universelle Neutralisationslösung und 30,8 ml steriles _dH2O in einer sterilen Flasche.
   2. Um eine 20-fach konzentrierte universelle Neutralisationslösung herzustellen, fügen Sie 1,0 g L-Histidin, 1,0 g L-Cystein und 2,0 g reduziertes Glutathion zu einem Endvolumen von 20 ml _dH2O hinzu. Filter sterilisieren die Lösung durch einen 0,2 μm Filter und lagern bei 4 °C.
2. Legen Sie das Gerät aus Schritt 5.1 in einen sekundären Behälter, der in einem Beschallungswasserbad angebracht ist. Beschallen Sie die Geräte 30 Minuten lang, um den Biofilm von den Heringen in das Wiederherstellungsmedium zu entfernen.
3. Entfernen Sie nach der Beschallung den befestigten Deckel und legen Sie einen sterilen flachen Plattendeckel auf die Tiefbrunnen-Rückgewinnungsmedienplatte. Der gebundene Deckel kann entsorgt werden.
4. Inkubieren Sie Platten mit Rückgewinnungsmedien aus Schritt 5.3 bei optimalen Dehnungswachstumsbedingungen über Nacht (16-18 h).

6. Bestimmung der Geräte-MBEC-Werte (Tag 5)

1. Am folgenden Tag werden 200 μL von jeder Vertiefung der inkubierten Tiefbrunnenplatte von Schritt 5.4 auf eine neue 96-Well-Mikrotiterplatte übertragen. Lesen Sie den _OD600nm jedes Vertiefungslochs mit einem Mikroplattenleser im UV/Vis-Bereich.
2. Subtrahieren Sie die _{OD600nm-Werte} der Negativkontrolle (nicht geimpftes Blanko) von jedem Biofilm, der die Probe enthält.
3. Berechnen Sie den MBEC-Wert für jede Probe unter Verwendung von OD600nm-Werten, wobei der MBEC-Wert die niedrigste antimikrobielle Konzentration ist, die zum niedrigsten _OD600nm-Wert (nicht von der nicht ininfizierten Kontrolle zu unterscheiden) für eine bestimmte antimikrobiell behandelte Spezies/Stammprobe geführt hat.

Ergebnisse

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Durchführung von statischen Biofilmmessungen mit größerem Volumen und hohem Durchsatz (96-Well) unter Verwendung von Tiefbrunnen-Biofilmgeräten bereitzustellen. Hier verglichen wir eine selbstmontierte Semi-Skirted-PCR-Platte, die in eine Tiefbrunnen-Mikroplatte eingeführt wurde, die als Tiefbrunnengerät bekannt ist, mit einem häufig verwendeten Standard-Biofilm-Pegged-Lid-Gerät, um ihre Fähigkeiten zur Bildung statischer Biofilme zu untersuchen. CV-gefärbte Biomasse- und Biofilm-Eradikationsassays (MBEC) wurden verwendet, um die Biofilmbildung durch beide Geräte zu bewerten.

Um die Biofilmbildung durch verschiedene Spezies auf jedem Gerät zu vergleichen, bewerteten wir Biofilmbiomassen, die von E. coli BW25113 und P. aeruginosa PAO1 gebildet wurden, unter Verwendung des Biofilm-CV-Färbeprotokolls17. Obwohl die CV-Färbung im Allgemeinen als A550nm-Werte angegeben wird, haben wir aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsvolumina jedes Geräts und ihrer verfügbaren Oberflächen CV-Fleckenwerte _A550nm in molare CV-Konzentrationen in Lösung umgewandelt. Die molaren CV-Konzentrationen machten die Volumenunterschiede jedes Geräts aus und ermöglichten einen Vergleich der CV-Konzentrationen, die Biomassen darstellen, die aus jedem Gerät gewonnen wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Arten auf Tiefbrunnen-Biofilmgeräten (2,1-faches E. coli; 4,1-faches P. aeruginosa) im Vergleich zum Standard-Biofilmgerät signifikant mehr Biomasse produzierten (Abbildung 3A-B). Dieses Ergebnis wurde angesichts der größeren Oberfläche des Tiefbrunnen-PCR-Pegs (320,4 mm2) im Vergleich zur Standard-Gerätepeg-Oberfläche (108,9 ^mm2) erwartet. Dieser Befund steht auch im Einklang mit den erhöhten Volumina (750 μL), die im Tiefbrunnen-Biofilmgerät im Vergleich zu den Standard-Gerätevertiefungen (200 μL) verwendet werden. Daher erhöhten Tiefbrunnengeräte die Biofilm-Biomasseakkumulation auf PCR-Röhrenpegs im Vergleich zu kleineren Pegs mit Standard-Biofilmgeräten.

Beide Biofilmgeräte bildeten reproduzierbare Biofilme, wenn wir biologisch replizierte Biofilme verglichen, die von E. coli und P. aeruginosa gebildet wurden (Abbildung 3A-B). Trotz der Beobachtung einer größeren Variabilität bei den technisch replizierten CV-gefärbten M _{A550nm-Werten} für beide auf dem Tiefbrunnengerät gezüchteten Stämme gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede, wenn wir die medianen CV M-Werte für die biologischen Replikate jeder Spezies auf dem Tiefbrunnen oder Standardgeräten mit paarweiser Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) oder Student's T-Tests (beide p > 0,05). Dieser Befund zeigt, dass die Biofilmbildung durch Tiefbrunnen und Standardgeräte reproduzierbare Biofilme bilden. Die Ergebnisse der CV-Färbung zeigten jedoch auch, dass die Biofilm-Biomassebildung durch E. coli und P. aeruginosa statistisch signifikante Unterschiede in der Biomasseakkumulation zeigte, wenn wir die Unterschiede in der Peg-Oberfläche auf jedem Gerät berücksichtigten (Tabelle 1). Die Berechnung der mittleren CV-gefärbten Biomasse (M) pro Peg-Oberfläche in mm2 (CV M/^mm2) für E. coli zeigte, dass die Biofilmbildung bei Polypropylen-Tiefbrunnengeräten im Vergleich zur Standard-Biofilmvorrichtung 1,5-fach niedriger war (Tabelle 1). Das gegenteilige Ergebnis wurde jedoch für P. aeruginosa erzielt, das einen 1,4-fach höheren CV M/^mm2 auf Polypropylen-Tiefbrunnengeräten im Vergleich zu Standard-Biofilmgeräten zeigte (Tabelle 1). Trotz der beobachteten speziesspezifischen Unterschiede in der Biofilm-Biomasseakkumulation mit jedem Gerät zeigte das Tiefbrunnengerät immer noch eine größere Gesamtbildung (2-4-fache Erhöhung) Biofilm-Biomassebildung durch jede Art (Abbildung 3).

Um die antimikrobiellen Suszeptibilitätstestanwendungen des Tiefbrunnen-Biofilmgeräts zu bestimmen, verglichen wir zwei häufig verwendete Desinfektionsmittel, BZK und Bleichmittel, auf ihr Biofilm-Ausrottungspotenzial. Beide Chemikalien werden häufig verwendet, um bakterielle Biofilme in klinischen und industriellen Anwendungen zu verhindern (BZK) und/oder auszurotten (Bleichmittel)^21,22,23. Jede Verbindung wurde in steigenden 2-fachen Konzentrationen zu Biofilmen gegeben, die von E. coli und P. aeruginosa auf den Standard- und Tiefbrunnen-Biofilmgeräten22,23 gebildet wurden (Abbildungen 1^{, 2B}). Die niedrigste Konzentration von BZK oder Bleichmittel, die zu _{OD600nm-Werten} führte, die nicht von negativen Kontrollbohrungen zu unterscheiden waren, wurde als MBEC-Wert definiert. Die Behandlung von Biofilmen, die auf Standard-Biofilmgeräten mit Bleichmittel gebildet wurden, ergab die gleichen Bleichmittel-MBEC-Werte von 0,625% für E. coli und P. aeruginosa (Tabelle 1, Abbildung 4A-B). Bleichmittel-MBEC-Werte, die für E. coli und P. aeruginosa-Biofilm, die auf Tiefbrunnengeräten gebildet wurden, bestimmt wurden, zeigten 2-4-fach niedrigere MBEC-Werte bei beiden Spezies (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) im Vergleich zu Standardgeräten (Tabelle 1). Ein 2-facher Unterschied in den Bleichmittel-MBEC-Werten zwischen den Arten wurde für das Tiefbrunnengerät festgestellt, bei dem P. aeruginosa im Vergleich zu E. coli eine 2-fach höhere Bleichmittelkonzentration benötigte, um Biofilme auszurotten (Abbildung 4A-B, Tabelle 1). Der 2-fache Bleichmittel-MBEC-Unterschied zwischen P. aeruginosa und E. coli im Tiefbrunnengerät scheint umgekehrt mit der 1,5-fach erhöhten CV-gefärbten Biomassebildung durch P. aeruginosa im Vergleich zu E. coli zu korrelieren (Abbildung 3A-B). Die größere Menge an Biomasse, die von P. aeruginosa auf Tiefbrunnen-Gerätepegs gebildet wird, könnte auch erklären, warum eine höhere Bleichmittelkonzentration erforderlich war, um P. aeruginosa-Biofilme im Vergleich zu E. coli in Tiefbrunnen auszurotten (Abbildung 3A-B, Tabelle 1). Daher zeigen Tiefbrunnen-Biofilm-Eradikationstests, dass beide Arten anfällig für Bleichmittel waren, jedoch bei niedrigeren (2-4-fachen) Bleichmittelkonzentrationen im Vergleich zu Standardgeräten. Dies korreliert umgekehrt mit der 3-fach größeren Peg-Oberfläche und dem Volumen der Deep-Well-Device-PCR-Platten-Pegs. Dies deutet darauf hin, dass bei der Bleichmittelexposition eine größere Biomasseoberfläche die für die Biofilmausrottung erforderlichen Bleichmittelkonzentrationen senken kann.

BZK-Biofilm-Eradikationstests zeigten eine größere Variabilität des wiedergewonnenen Wachstums (_{OD600nm-Werte}) und MBEC-Werte nach Arten im Vergleich zu Bleichergebnissen (Abbildung 4C-D). Diese Variabilität ist nicht unerwartet, da frühere Studien zeigen, dass BZK die Bildung von Biofilmen wirksamer verhinderte als gut etablierte Biofilme ^{ausrottete24,25,26}. Unter Verwendung der Standard-Biofilmvorrichtung zeigten nur mit BZK behandelte Biofilme von P. aeruginosa einen konsistenten MBEC-Wert (2560 μg/ml), der 8-fach unter dem MBEC-Wert (20480 μg/ml) lag, der für diesen Stamm im Tiefbrunnengerät erhalten wurde (Tabelle 1, Abbildung 4C). Diese Ergebnisse spiegeln möglicherweise Unterschiede in den Mengen an P. aeruginosa-Biomasse wider, die auf tiefen, gut befestigten Oberflächen und Kunststoffzusammensetzungen im Vergleich zu den Standard-Gerätepegs gebildet werden. Die BZK-Eliminierung von Biofilmen, die von E. coli sowohl auf der Tiefbrunnen- als auch auf der Standardvorrichtung gebildet wurden, war gleichermaßen schlecht, was zu einer breiten Palette von BZK-MBEC-Werten von 2560-40960 μg/ml für das Tiefbrunnengerät und 320-10240 μg/ml für das Standardgerät führte (Abbildung 4D). Für E. coli wurde diese Variabilität durch den gelegentlichen Fall erklärt, in dem 1-2 Replikationsbohrungen ein geringes, aber statistisch signifikantes Wachstum der Wiederherstellungsmedien zeigten, was den Fehler erhöhte und die BZK MBEC-Bestimmungsgenauigkeit mit beiden Geräten verringerte (Abbildung 4D, Tabelle 1). Diese Variabilität unterstreicht die Unwirksamkeit der Verwendung von BZK bei der Ausrottung von E. coli-Biofilmen, wie bereits in Studien ^{festgestellt24,25,26}. Im Gegensatz dazu konnten P. aeruginosa-Biofilme von BZK in einer definierten Konzentration mit beiden Geräten, jedoch mit einer 8-fachen BZK-Konzentrationsdifferenz zuverlässig ausgerottet werden (Abbildung 4C). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BZK-Eradikations-MBEC-Werte von Biofilmen, die von P. aeruginosa gebildet werden, unterschiedliche MBEC-Werte mit jedem Gerät zeigen, jedoch sind beide Geräte gleichermaßen schlecht bei der Unterscheidung von E. coli-präzisen BZK-Eradikationsphänotypen.

Daher ist das hierin beschriebene Tiefbrunnen-Biofilm-Device-Verfahren im Vergleich zu einem Standard-Biofilm-Gerät ähnlich effektiv für die Bildung reproduzierbarer Biofilme.

Abbildung 1. Schematische Übersicht des Experiments. Tag 0 Isolierung einzelner Kolonien aus kryokonservierten Beständen; Tag 1 Impfung von Wachstumsmedien mit einzelnen Kolonien; Tag 2 Impfung der Biofilmplatte; Tag 3 CV-Färbung oder antimikrobielle Herausforderung; Tag 4 Biofilmbeschallung in Erholungsmedien; und Tag 5 Lesen _OD600nm der Rückgewinnungsplatte, um MBEC-Werte zu bestimmen. Einige Bilder in Abbildung zur Verfügung gestellt von Servier Medical Art (smart.servier.com). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Beispiel-Plattenlayouts für verschiedene Schritte des Protokolls. A ) Der endgültige Plattenaufbau für das anfängliche 24-stündige Biofilmwachstum unter Verwendung von Tag 1-Bakterienkulturen aus zwei Bakterienstämmen (E. coli und P. aeruginosa) mit jeweils drei biologischen Replikaten. Negativkontrollbrunnen (grau) werden als Sterilitätskontrollen verwendet (keine Bakterien hinzugefügt). B) Plattenaufbau für die antimikrobielle Herausforderung von Biofilmen. Verdunkelnde Farben deuten auf eine zunehmende antimikrobielle Konzentration hin. Negativkontrolle sind Vertiefungen ohne Zusatz von Bakterien (Grau) und Positivkontrollen sind Biofilme ohne antimikrobielle Exposition (orange). Biofilm-Peg-Deckel aus Panel A werden zur antimikrobiellen Exposition auf diese Tiefbrunnenplatte übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Die molare Konzentration (M) von CV-gefärbten E. coli BW25113. (A) und P. aeruginosa PAO1 (B) Biofilm-Biomasse, die aus Standardgeräten (Kreise) und Tiefbrunnen (Dreiecke) gewonnen wird. Die CV-Färbung wurde gemessen, indem die Absorption von CV bei 550 nm (_A550nm) abgelesen wurde, und die Tiefbrunnen-A550nm-Messwerte wurden um einen Faktor von 3,809 (₈₀₀ μL / 210 μL) angepasst, um die Volumenunterschiede zwischen den Geräten zu berücksichtigen. Die CV-Molkonzentration (M) wurde durch das Beer-Lambert-Gesetz bestimmt (CV-Konzentration = _A550nm/εl); wobei die Weglänge (l) von 210 μL in der 96 Well Flat Bottom Microtitre-Platte mit 0,56 cm und der Extinktionskoeffizient (ε) von CV in Wasser bei A550nm von ₂₅₁₅₀₀ ^cm-1M-139 bestimmt wurde. Die Ergebnisse stellen 9 technische Replikate aus drei biologischen Replikaten jedes Stammes dar, die als Biofilm gezüchtet wurden, und der Medianwert jedes biologischen Replikats wird in jedem Diagramm als horizontaler Balken angezeigt. Statistisch signifikante Unterschiede in der Biomasse zwischen den Geräten wurden zwischen biologischen Replikat-Medianwerten unter Verwendung eines zweiseitigen gepaarten t-Tests (E. coli p= 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) als Balken mit Sternchen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 

Abbildung 4. Bestimmung der antimikrobiellen MBEC-Konzentration. Bestimmung der antimikrobiellen MBEC-Konzentration für Bleichmittel (A,B) und BZK (C,D) für P. aeruginosa PAO1 (A, C) und E. coli BW25113 (B,D), wenn sie auf Standard-Biofilm-gebundenen Geräten (weiße Balken) und Tiefbrunnen (graue Balken) gezüchtet werden. Die Ergebnisse wurden durch Ablesen des _OD600nm Biofilms bestimmt, der nach der Beschallung in das Erholungsmedium und der Inkubation über Nacht wiederhergestellt wurde. Deep Well _OD600nm wurde um einen Faktor von 3,75 (750 μL / 210 μL) angepasst, um Volumenunterschiede zwischen den Geräten zu berücksichtigen. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei biologische Replikate und Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung zwischen Replikaten bei jeder antimikrobiellen ^{Konzentration39.} Sternchen (*) über jedem Balkendiagramm zeigen statistisch signifikante Unterschiede in den _{OD600nm-Werten} von leeren Steuerelementen mit p-Werten < 0,05 unter Verwendung von zweiseitigen Student's T-Test-Berechnungen. Kreissymbole (o) über jedem Balkendiagramm zeigen Messungen an, bei denen nur 1 oder 2 Replikate statistisch signifikante _{OD600nm-Werte} von leeren Steuerelementen aufwiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

	BZK MBEC (μg/ml)		Bleichmittel MBEC (% v/v)
Dehnung getestet	Deep Well Gerät	Standard-Gerät	Deep Well Gerät	Standard-Gerät
E. coli BW25113	2560-40960	320-10240	0.156	0.625
P. aeruginosa PAO1	20480	2560	0.313	0.625
	Deep Well Gerät	Standard-Gerät	p-Wert**	Falzwechsel (Tiefbrunnen/ Standard)
Dehnung getestet	Mittlerer Lebenslauf M*/ mm2 ± SD	Mittlerer CV M*/ mm2 ± SD
E. coli BW25113	1,99 x 10-8 ± 3,25 x 10-9	3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9	0.0176	-1.52
P. aeruginosa PAO1	8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9	5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9	0.034	1.4

Tabelle 1. Eine Zusammenfassung der durchschnittlichen CV-gefärbten ^{Biomasse-M/mm2-Werte} und der MBEC-Werte für die Biofilmeradikation von E. coli BW25113 und P. aeruginosa PAO1 für BZK und Bleichmittel auf verschiedenen Geräten.
*Mittlere CV M/mm2-Werte, berechnet unter Verwendung des biologischen Medianspiegels, replizieren CV M-Werte (Abbildung 3).
**p-Werte, ermittelt mit dem Two-tailed Student's T-Test.

Diskussion

Diese Studie beschreibt Methoden zur Verwendung einer großvolumigen statischen Biofilmwachstumsvorrichtung mit 96 Well mit hohem Durchsatz, die eine Polypropylen-Tiefbrunnenmikroplatte umfasst, die mit einem halbumrandeten PCR-Plattendeckel für die Biofilmbildung (Tiefbrunnen-Biofilmgerät; Tabelle der Materialien). Wir haben Biofilme, die mit diesem Gerät erzeugt wurden, mit einem kommerziell erhältlichen Polystyrol-Standard-Biofilmgerät (Table of Materials) verglichen. Die Tiefbrunnengerätemethode verwendet die gleichen methodischen Schritte und Lösungen wie die Standardvorrichtung17 bei angepassten Volumina, die für die Tiefbrunnengeräte modifiziert wurden, wodurch sich dieses Gerät ideal für die großflächige Biofilmbildung und ^{experimentelle} Analyse eignet. Das Wachstum von E. coli BW25113 und P. aeruginosa PAO1, zwei gramnegativen Spezies, von denen bekannt ist, dass sie Biofilme bilden, wurden auf ihre Biomassebildung und Desinfektionsmittel (BZK/Bleichmittel) MBEC-Werte untersucht, wobei beide Geräte verwendet wurden. Der Vergleich von CV-gefärbter Biomasse, die auf Heringen aus jedem Gerät gebildet wurde, zeigte, dass sowohl E. coli als auch P. aeruginosa Biofilme mit höherer Biomasse auf dem Tiefbrunnen-Biofilmgerät im Vergleich zum Standardgerät bildeten (Abbildung 3A-B). Die erhöhte Biofilmbiomasse spiegelte die größere Oberfläche von Tiefbrunnenpegs im Vergleich zur Standardoberfläche des Gerätepegs wider. Als wir die Unterschiede in den Peg-Oberflächen (mm2) mit beiden Geräten berücksichtigten, wurden Unterschiede in der Biomassebildung festgestellt, wobei E. coli auf Polystyrol-Standard-Gerätepegs signifikant mehr CV-Biomasse pro ^mm2 bildete als mit den PCR-Röhrenpegs des Tiefbrunnengeräts (Tabelle 1). P. aeruginosa bildete im Vergleich zu Standardgeräten eine größere CV-gefärbte Biomasse^{/Peg mm2} (Tabelle 1). Diese Ergebnisse können artspezifische Unterschiede in der Biofilm-Biomassebildung auf den verschiedenen Geräten hervorheben.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Bleichmittelausrottung von E. coli- und P. aeruginosa-Biofilmen auf Tiefbrunnengeräten bei 2-4-fach niedrigeren Konzentrationen als bei Standardgeräten auftrat (Abbildung 4A-B, Tabelle 1). Die Unterschiede in den MBEC-Werten für Bleichmittel, die von jedem Gerät identifiziert wurden, werden wahrscheinlich durch Unterschiede in den Peg-Formen des Geräts beeinflusst (tiefe "Pegs" sind konische Rohre und Standard-Pegs sind zylindrisch), Unterschiede in der Kunststoffzusammensetzung (Polypropylen gegenüber Polystyrol) und Volumenunterschiede (750 μL gegenüber 200 μL). Zum Beispiel hatte P. aeruginosa im Vergleich zu Standardgeräten eine größere CV M-Biomasse / ^mm2 auf Tiefbrunnen-Gerätepegs, aber E. coli hatte weniger Biomasse auf Tiefbrunnen-Pegs (Abbildung 3). Dies deutet darauf hin, dass die für die Biofilmausrottung erforderlichen Desinfektionsmittelkonzentrationen durch die von jeder Art gebildete Biomasse sowie die verfügbare Oberfläche beeinflusst werden können. Darüber hinaus können Unterschiede in der Form des Gerätepegs verschiedene Wachstumsbedingungen für bestimmte Arten beeinflussen. In unserer Studie kann P. aeruginosa aufgrund ihrer größeren Oberfläche und Belüftung eine größere Biomasse an tiefen Bohrlochpegs bilden, da diese Art im Gegensatz zu E. coli, einem fakultativen Anaerobier, ein obligates Aerobe ist. Bis heute haben wir keine veröffentlichten Studien identifiziert, die die Biofilmbildung von E. coli und P. aeruginosa sowohl auf Polypropylen27,28,29- als auch auf Polystyrol30,31-Materialien direkt miteinander verglichen haben. Berichte über eine robuste Biofilmbildung von E. coli und P. aeruginosa wurden jedoch in unabhängigen Studien festgestellt, in denen entweder Polypropylen- oder Polystyrolmaterialien untersucht wurden. In Bezug auf Pseudomonaden können viele Pseudomonas spp. Kunststoffe wie Polypropylen als potenzielle Kohlenstoffquellen ^verwenden32. Daher ist die Verfügbarkeit dieses Polypropylen-Tiefbrunnen-Biofilmgeräts ein nützlicher Fortschritt in statischen Biofilmstudien. Polypropylen ist chemisch haltbarer als Polystyrol und ein klinisch relevantes Material, da es häufig in medizinischen Implantaten, Nähten und Netzen für Hernien- oder Beckenoperationen verwendet ^wird33,34.

Obwohl Biofilm-Biomasse von beiden Geräten gebildet wurde, hatte das Tiefbrunnengerät eine etwas höhere Variabilität in der Biomasse, basierend auf der CV-Färbemethode und den OD600nm-Biofilm-Eradikations-MBEC-Werten für Bleichmittel und BZK. Dies kann durch 3 Hauptfaktoren erklärt werden: 1) Tiefbrunnengeräte haben eine größere Peg-Oberfläche als Standardgeräte, die im Vergleich zu Standard-Gerätepegs abgewinkelt waren. 2) Beide getesteten Spezies können unterschiedliche Fähigkeiten haben, Polypropylen und Polystyrolmaterialien jedes Geräts zu haften. 3) Das Volumen der in jedem Gerät verwendeten Wachstumsmedien (750 μL Tiefenvertiefung, 200 μL Standard) und der Abstand zwischen dem eingesetzten Stift zu den Wellenseitenwänden unterscheiden sich. Diese Probleme sind kein Problem, wenn nur eine Art von Gerät für alle Biofilmexperimente verwendet wird, aber wenn beide Geräte ausgewählt werden, sollten die Vergleiche, die wir hier durchgeführt haben, durchgeführt werden, um Unterschiede zu ^{identifizieren36,37.} Aufgrund der Unterschiede im Kunststoffmaterial, das in jedem Gerät verwendet wird, sollten die CV-gefärbten Biofilm-Biomasse- und MBEC-Werte nicht direkt zwischen verschiedenen Geräten verglichen werden. Wenn jedoch Methoden und Experimente mit demselben Gerät (Tiefbrunnen oder Standard) durchgeführt werden, sind die Ergebnisse für getestete Spezies und antimikrobielle Mittel vergleichbar.

Dieses Protokoll zeigt, dass selbstmontierte Deep-Well-PCR-Plattengeräte großvolumige Biofilmgeräte zur Messung der Biofilmbildung und -ausrottung sind, die auch kostengünstig sind. Aus Kostensicht liegen Standard-Biofilmgeräte mit 96 gut gebundenen Deckeln im Einzelhandel bei 29-36 US-Dollar (USD) pro Gerät (Table of Materials). Polystyrol-Standard-Biofilmgeräte sind nicht autoklavierbar und aufgrund ihrer plastischen chemischen Eigenschaften weniger tolerant gegenüber Lösungsmitteln / Säuren. Die hierin beschriebenen selbstmontierten Polypropylen-Tieflochplatten, die mit einer separaten 96-Well-PCR-Platte (Table of Materials) ausgestattet sind, kosten insgesamt 14 USD pro montiertem Gerät, was der Hälfte der Standardkosten für Biofilmgeräte entspricht. Es sollte beachtet werden, dass die Preise je nach Region, Händler und Verfügbarkeit variieren können, und unsere Kosten nach institutionellen Rabatten beliefen sich auf $ 9 USD / Deep Well Device. Diese selbstmontierten Tiefbrunnen-Polypropylen-PCR-Plattengeräte haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie für die Sterilisation autoklavierbar sind und 2-4-mal mehr Biofilm-Biomasse bieten als Standardgeräte.

Zusammenfassend zeigen dieses Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse von Biofilm-Wachstumsvergleichen der Tiefbrunnen- und Standard-Biofilmgeräte, dass beide Geräte in der Lage sind, bakterielle Biofilme zu kultivieren, aber Tiefbrunnengeräte bilden 2-4-mal mehr Biofilm. Das Tiefbrunnen-Biofilmgerät bietet eine praktikable und erschwingliche Alternative für großvolumige Biofilmbildungsexperimente mit hohem Durchsatz, wie z. B. Screening-Studien zur Arzneimittelanfälligkeit. Diese Technik kann Biofilme erzeugen, die für nachgeschaltete "-omics"-Extraktionen (proteomisch, metabolomisch, transkriptomisch) oder experimentelle Assays (enzymatisch, fluoreszierend) nützlich sind, die größere Mengen an Biofilmmaterialien für Analysen benötigen. Das Tiefbrunnen-Biofilmgerät wird für Labore empfohlen, die Biofilme in einem Hochdurchsatz-96-Well-Assay mit kostengünstigeren, chemisch haltbaren Kunststoffmaterialien mit größerem Volumen untersuchen möchten, die klinisch relevant sind.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS)	Fisher Scientific	13-678-11F	disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS	Fisher Scientific	13-678-11C	disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack	Fisher Scientific	14-222-766	sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C	Fisher Scientific	P-DW-11-C	microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips	Fisher Scientific	TF-350-L-R-S	sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200	Avantor/ VWR	89094-676	sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g	Fisher Scientific	DF0145-17-0	materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader	Biotek	NEO2MB	microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V	Avantor/ VWR	CPX-952-316R	sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g	Fisher Scientific	C581-100	biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH	Avantor/ VWR	CABDH1115-1LP	media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller	Avantor/ VWR	CA11027-980	serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL	Avantor/ VWR	CA89125-338	multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL	Avantor/ VWR	CA89125-340	multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade	Fisher Scientific	A38-212	CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX	Fisher Scientific	14957H/ 9820-18	materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS	Fisher Scientific	BP229-4	media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g	Avantor/ VWR	97061-204	universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g	Fisher Scientific	AAJ6216614	universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g	Avantor/ VWR	CA97062-598	universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS	Innovotech	19112	material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA	Fisher Scientific	R20410	cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA	Fisher Scientific	R20411	cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS	Fisher Scientific	167008	microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK	Sarstedt	72.1981.202	pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500	Fisher Scientific	FB0875712	materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g	Fisher Scientific	P288-500	PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg	Fisher Scientific	S2713	media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg	Fisher Scientific	S369-1	PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50	Avantor/ VWR	28145-505	non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet	Grocery store	---	materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA	Fisher Scientific	B11922	media components for LB broth
Tween-20, 100 mL	Fisher Scientific	BP337-100	recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS	Avantor/ VWR	37001-520	materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g	Fisher Scientific	BP1422-500	media components for LB broth