Generierung eines orthotopen Xenografts von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen durch ultraschallgeführte Injektion

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erstellung eines minimalinvasiven orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und die anschließende Überwachung des Tumorwachstums in vivo durch Ultraschallbildgebung.

Zusammenfassung

Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCa) stellt eine der tödlichsten Krebsarten weltweit dar. Die Gründe für die PCa-Malignität liegen hauptsächlich in ihrem intrinsischen bösartigen Verhalten und der hohen Resistenz gegen therapeutische Behandlungen. Trotz vieler Bemühungen haben sowohl die Standardchemotherapie als auch innovative Zieltherapien erheblich versagt, wenn sie von der präklinischen Bewertung in die klinische Umgebung überführt wurden. In diesem Szenario ist die Entwicklung präklinischer Mausmodelle, die die in vivo Eigenschaften von PCa besser nachahmen, dringend erforderlich, um neu entwickelte Medikamente zu testen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung eines Mausmodells von PCa, dargestellt durch ein orthotopes Xenograft, das durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Pankreastumorzellen erhalten wird. Mit einem solchen zuverlässigen und minimal-invasiven Protokoll liefern wir auch den Nachweis der In-vivo-Anpflanzung und der Entwicklung von Tumormassen, die durch Ultraschall (US) -Bildgebung überwacht werden können. Ein bemerkenswerter Aspekt des hier beschriebenen PCa-Modells ist die langsame Entwicklung der Tumormassen im Laufe der Zeit, die eine genaue Identifizierung des Ansatzpunktes für pharmakologische Behandlungen und eine bessere Überwachung der Wirkung therapeutischer Interventionen ermöglicht. Darüber hinaus ist die hier beschriebene Technik ein Beispiel für die Umsetzung der 3R-Prinzipien, da sie Schmerzen und Leiden minimiert und das Wohlergehen von Tieren in der Forschung direkt verbessert.

Einleitung

PCa und seine häufigste Form, das Pankreasduktale Adenokarzinom (PDAC), ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen mit einer 1-Jahres-Überlebensrate von weniger als 20% und einer 5-Jahres-Überlebensrate von 8%, unabhängig vom Stadium ^1,2. Die Krankheit verläuft fast immer tödlich, und ihre Inzidenz wird in den nächsten Jahren voraussichtlich kontinuierlich zunehmen, im Gegensatz zu anderen Krebsarten, deren Inzidenz abnimmt³. Faktoren wie die späte Krebserkennung, die Tendenz zur schnellen Progression und das Fehlen spezifischer Therapien führen zu einer schlechten Prognose von^{PCa 4}. Dank der Entwicklung genauerer präklinischer Mausmodelle wurden große Fortschritte in der Krebsforschung erzielt. Die Modelle haben geeignete Einblicke in das Verständnis des molekularen Mechanismus geliefert, der Krebs zugrunde liegt, und in die Entwicklung neuer Therapien⁵. Diese Fortschritte treffen schlecht auf PCa zu, das trotz großer Bemühungen in jüngster Zeit gegen aktuelle chemotherapeutische Therapien resistent bleibt¹. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung neuartiger Ansätze zur Verbesserung der Patientenperspektiven zwingend erforderlich.

Im Laufe der Jahre wurden viele PCa-Mausmodelle entwickelt, darunter Xenotransplantate, die heutzutage die am weitesten verbreiteten Modelle sind⁵. Xenograft-Modelle werden je nach Lage der implantierten Tumorzellen als subkutan heterotopisch und orthotopisch klassifiziert. Subkutane heterotope Xenotransplantate sind einfacher und billiger zu erreichen, übersehen aber bestimmte charakteristische Merkmale von PCa (d.h. die eigentümliche Tumormikroumgebung, die durch die Ansammlung von fibrotischem Gewebe, Hypoxie, Säure und Angiogenese gekennzeichnet ist)^6,7. Dies erklärt, warum subkutane Xenotransplantate oft keine robusten Daten für therapeutische Behandlungen liefern, was bei der Translation in das klinische Umfeld zu Misserfolgen führt⁸. Auf der anderen Seite ähneln orthotope Xenotransplantate der Tumormikroumgebung stärker, was zu einer besseren Nachahmung der natürlichen Entwicklung der Krankheit führt. Darüber hinaus sind orthotope Xenotransplantate besser geeignet, um den metastatischen Prozess und die invasiven Merkmale von PCa zu untersuchen, die in subkutanen Modellen fast nicht auftreten⁹. Insgesamt werden orthotope Xenograft-Mausmodelle heutzutage bevorzugt, um präklinische Arzneimitteltests durchzuführen ^9,10. Orthotope Xenotransplantate verlassen sich normalerweise auf chirurgische Verfahren, um entweder Zellen oder sehr kleine Tumorgewebestücke in die Bauchspeicheldrüse zu implantieren. Tatsächlich wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Arbeiten veröffentlicht, die auf chirurgischen Modellen von PCa basieren¹¹. Die Qualität und das Ergebnis des chirurgischen Eingriffs zur Etablierung eines orthotopen Tumormodells hängen jedoch stark von den technischen Fähigkeiten des Bedieners ab. Ein weiterer wichtiger Punkt für ein erfolgreiches orthotopes PCa-Xenograft für einen translationalen klinischen Ansatz ist die Möglichkeit, lokalisierte Erkrankungen mit vorhersagbarer Wachstumskinetik festzustellen.

Um diese Probleme anzugehen, beschreiben wir hier ein innovatives Verfahren zur Herstellung eines orthotopen PCa-Xenotransplantats, das die ultraschallgesteuerte (US)-gesteuerte Injektion menschlicher PCa-Zellen in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse bei immundefizienten Mäusen nutzt. Dieses Verfahren generiert ein zuverlässiges PCa-Mausmodell. Das Tumorwachstum wird in vivo von der US-Bildgebung verfolgt.

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Protokoll

Das vorliegende Protokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium mit der Zulassungsnummer 843/2020-PR genehmigt. Um aseptische Bedingungen zu gewährleisten, wurden die Tiere im Barriereraum des Forschungstiervivariums (Ce.S.A.L.) der Universität Florenz gehalten. Alle Eingriffe wurden in demselben Raum durchgeführt, in dem die Mäuse in der LIGeMA-Einrichtung der Universität Florenz (Italien) untergebracht waren.

1. Zellpräparation

1. Kultur von PCa-Zellen aus der PCa-Zelllinie in einer 100 mm Petrischale mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 2% L-Glutamin und 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
2. Inkubieren Sie die Zellen in Normoxia bei 37 °C mit 5%_CO2.
3. Lösen Sie die Zellen mit Trypsin. Zählen und resuspendieren Sie 1 x 10⁶ Zellen in 20 μL PBS, 1 h vor der Impfung.

2. Mauspräparation für die ultraschallgesteuerte Injektion (US-GI)

HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Das gesamte Verfahren der US-geführten Injektion, vom Beginn der Anästhesie bis zur Entfernung der Maus von der Tierplattform, dauert etwa 10-12 Minuten plus 5 Minuten für eine vollständige Mauserholung.

1. Kurz vor dem Eingriff Carprofen (NSAID) subkutan (s.c.) in einer Enddosis von 5 mg/kg oder Tramadol in einer Enddosis von 5 mg/kg mit einer Tuberkulinspritze mit einer 27 G-Nadel verabreichen.
   HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll wurden 20 Athymic Nude-Foxn^1nu weibliche Mäuse verwendet. Die Mäuse waren 8 Wochen alt und wogen 20-22 g.
2. Schalten Sie den Imager ein und wählen Sie im Anwendungsmenü des Wandlerbereichs die Option Maus (klein) Bauch . Stellen Sie sicher, dass das Fenster B-Mode (Helligkeitsmodus) angezeigt wird und das System bereit ist, B-Mode-Daten zu erfassen.
   HINWEIS: Der B-Modus ist der Standard-Imaging-Modus des Systems. Das System zeigt Echos in einer zweidimensionalen (2D) Ansicht an, indem es eine Helligkeitsstufe basierend auf der Amplitude des Echosignals zuweist. B-Mode ist der effektivste Modus zur Lokalisierung anatomischer Strukturen.
   1. Rufen Sie den Studienbrowser auf.
   2. Wählen Sie Neue Studie und geben Sie den Namen und die Informationen der Studie ein, z. B. Datum der Studie usw.
   3. Geben Sie alle notwendigen Informationen im Seriennamen ein, d. H. Tierstamm, ID, Geburtsdatum usw.
   4. Tippen Sie auf Fertig; das Programm ist bereit für die B-Mode-Bildgebung.
3. Betäuben Sie die Maus in der Anästhesieinduktionskammer mit 4% Isofluran mit einem Gasfluss von 2 l / min von_O2.
   HINWEIS: Ungefähr 4 Minuten sind ausreichend für die richtige Anästhesie (Atmung ca. 50-60 Atemzüge pro Minute).
4. Sobald die Maus betäubt ist, ändern Sie die Verbindung des Anästhesiegeräts, um das Isofluran in Richtung der Maushandhabungstabelle zu lenken.
5. Legen Sie die betäubte Maus an der rechten Flanke mit der Schnauze in einem Nasenkegel auf den (auf 37 °C erhitzten) Handlingtisch, um sicherzustellen, dass die Maus mit 2% Isofluran mit einem Gasfluss von 0,8 l/min_O2 betäubt wird (Abbildung 1A).
6. Tragen Sie einen Tropfen künstlicher Tränen auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
7. Kleben Sie die rechte Hand, den rechten Fuß und den Schwanz mit Klebegaze fest auf die Elektrodenpads auf der Tierplattform.
   HINWEIS: Die Atemfrequenz der Maus und das Elektrokardiogramm (EKG) werden über die Elektrodenpads aufgezeichnet.

3. Injektion von PANC1-Zellen in die Bauchspeicheldrüse mittels US-GI-Methode

1. Desinfizieren Sie die Maushaut mit 70% Ethanol und halten Sie die Haut der linken Flanke mit Klebegaze gestreckt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Haut gedehnt zu halten, um den Widerstand gegen das Einführen der Nadel zu verringern und Nadelverformungen zu vermeiden.
2. Tragen Sie Ultraschallgel mit einer 20-ml-Spritze (ohne Nadel) auf den Bauch und die linke Flanke der Maus auf.
3. Senken Sie den Schallkopf mit dem Höhenregler des US-Wandlers ab, um die linke Flanke der Maus zu berühren, und platzieren Sie ihn quer zum Körper des Tieres.
4. Bewegen Sie den Schallkopf, um die Bauchspeicheldrüse auf dem Display des Schallkopfes mithilfe der B-Mode-Bildgebung zu visualisieren (Abbildung 1B).
5. Bereiten Sie eine 50-μL-Hamilton-Spritze mit 1 x 10⁶ PANC1-Zellen in 20 μl PBS mit einer 30-mm-28-G-Nadel vor und legen Sie die Spritze auf den entsprechenden Halter (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Vor der Verwendung desinfizieren Sie die Spritzennadel mit 70% Ethanol für einen Zeitraum von 5-10 Minuten.
6. Senken Sie die Spritze mit dem Mikromanipulator des Halters auf die Maushaut, wobei die Nadelabschrägung nach oben und in derselben Ebene wie der Ultraschallwandler liegt, wobei ein Winkel von 45° mit dem Schallkopf gebildet wird (Abbildung 1D).
   HINWEIS: Fahren Sie ab diesem Schritt fort, indem Sie das US-Bild auf dem Display überwachen.
7. Perforieren Sie die Haut mit dem Mikromanipulator, führen Sie die Spritzennadel in die Bauchspeicheldrüse ein und beobachten Sie das US-Bild auf dem Display, um seiner Flugbahn zu folgen (Abbildung 1E).
   HINWEIS: Nehmen Sie vor der Injektion den Schwanz der Bauchspeicheldrüse als Referenz, der sich hinter der Milz und in der Nähe der linken Niere befindet.
8. Sobald die Nadel in die Bauchspeicheldrüse eingeführt wurde, injizieren Sie einen 20 μL Bolus, der die Zellen enthält, direkt in die Bauchspeicheldrüse, indem Sie konstanten Druck auf den Spritzenkolben ausüben (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Das korrekte Injektionsverfahren wird durch das Vorhandensein einer kleinen Blase in der Bauchspeicheldrüse und den Fluss von hypoechogener Flüssigkeit überprüft, die von der Nadelspitze aus kaum sichtbar ist.
9. Lassen Sie die Nadel für 5-10 s an Ort und Stelle, nachdem der gesamte Bolus injiziert wurde, und ziehen Sie sie dann langsam zurück.
10. Entfernen Sie den US-Wandler, reinigen Sie das Gel von der Flanke und setzen Sie die Maus allein in einen neuen Käfig. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.

4.3D US-Bildgebung zur Überwachung von Pankreastumoren bei Mäusen

HINWEIS: Die Bewertung der Tumorentwicklung wurde ab 8 Tagen nach der Zellinjektion mit dem gleichen Instrument durchgeführt, das für die US-geführte Injektion verwendet wurde (aufgeführt in der Materialtabelle). Daher stimmen einige Verfahren, wie die Systemzündung (Schritt 2.2.), die Anästhesie (Schritte 2.3. - 2.6.) und die Platzierung der Maus auf der Tierplattform (Schritt 2.7.), vollständig mit dem überein, was oben im Protokoll beschrieben wurde.

1. Bevor Sie mit dem US-Imaging beginnen, richten Sie die Arbeitsstation wie in Abbildung 2A dargestellt ein.
2. Befestigen Sie den Aufnehmer am 3D-Motorsystem (Abbildung 2A).
3. Schalten Sie den Imager ein und wählen Sie im Studienbrowser Neue Studie aus.
4. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer (4% Isofluran).
5. Legen Sie die betäubte Maus auf der rechten Flanke mit der Schnauze im Narkoserohr auf den auf 37 °C erhitzten Handlingtisch und reduzieren Sie Isofluran auf 2% (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Maus in die gleiche Position wie die US-geführte Injektion gebracht wird, um die gleichen anatomischen Referenzen beizubehalten.
6. Tragen Sie einen Tropfen Tierarztsalbe auf die Augen der Maus auf.
7. Tragen Sie eine Schicht Ultraschallgel auf den Bauch und die linke Flanke der Maus auf.
8. Positionieren Sie den 55-MHz-Wandler in der Querausrichtung, um die linke Flankenhaut so zu berühren, dass die Bauchspeicheldrüse annähernd zentriert ist (Abbildung 2C).
9. Verwenden Sie den 3D-Motor, um Bilder der gesamten Bauchspeicheldrüse in der Querausrichtung aufzunehmen, idealerweise 90-100 Bilder pro Aufnahme (die Anzahl der Bilder kann je nach persönlicher Wahl variieren).
   1. Wählen Sie die 3D-Motorposition auf dem Imager-Touchpad.
   2. Geben Sie die Scanentfernung an, indem Sie den Cursor bewegen, um Bilder der gesamten Bauchspeicheldrüse von beiden Extremitäten aufzunehmen.
   3. Wählen Sie Scan Frames (Bilder scannen ) und beginnen Sie mit der 3D-Aufnahme.
10. Sobald die 3D-Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Schallkopf, reinigen Sie das Gel von der Haut und legen Sie die Maus allein in einen neuen Käfig zur Wiederherstellung. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.

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Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden die Mäuse zunächst in einer Isoflurankammer betäubt und auf die Tierplattform gesetzt (Abbildung 1A). Die Bauchspeicheldrüse wurde mit Ultraschallbildgebung sichtbar gemacht (Abbildung 1B). Eine 50 μL Hamilton-Spritze wurde mit 1 x 10⁶ PANC1-Zellen beladen, die in 20 μL PBS suspendiert und auf den Nadelhalter gelegt wurden (Abbildung 1C). Der optimale Winkel zwischen der ...

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Diskussion

Obwohl der Einsatz der US-Bildgebung in der Klinik weit verbreitet ist, wird die Tumorentwicklung in vielen präklinischen Mausmodellen in der Regel mittels biolumineszierender Bildgebung beschrieben¹¹. Letzteres ist ein indirekter Weg, um die Tumortransplantation und -expansion zu bewerten, und es bietet auch keine zuverlässige Tumorwachstumskinetik. In der vorliegenden Studie haben wir die US-Bildgebung sowohl zur Durchführung der Zellinjektion als auch zur Überwachung der Tumorentwicklung ei...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157