초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

요약

우리는 인간 췌장암 세포의 초음파 유도 주사와 초음파 영상에 의한 생체 내 종양 성장의 후속 모니터링에 의해 최소 침습 동종 췌장암 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

췌장암(PCa)은 전 세계적으로 가장 치명적인 암 유형 중 하나입니다. PCa 악성 종양의 원인은 주로 내재적 인 악성 행동과 치료 치료에 대한 높은 내성에 의존합니다. 실제로 많은 노력에도 불구하고 표준 화학 요법과 혁신적인 표적 요법은 전임상 평가에서 임상 환경으로 옮겨 졌을 때 실질적으로 실패했습니다. 이 시나리오에서, 새로 개발된 약물을 시험하기 위해서는 PCa의 생체 내 특성을 더 잘 모방한 전임상 마우스 모델의 개발이 절실히 필요하다. 본 프로토콜은 인간 췌장 종양 세포의 초음파 유도 주사에 의해 수득된 동소성 이종이식으로 대표되는 PCa의 마우스 모델을 생성하는 방법을 기술한다. 이러한 신뢰할 수 있고 최소 침습적 프로토콜을 사용하여 초음파(미국) 영상으로 모니터링할 수 있는 종양 덩어리의 생체 내 생착 및 발달에 대한 증거도 제공합니다. 여기에 설명 된 PCa 모델의 주목할만한 측면은 시간이 지남에 따라 종양 덩어리의 느린 발달이며, 이는 약리학 적 치료의 시작점을 정확하게 식별하고 치료 적 개입의 효과를보다 잘 모니터링 할 수 있습니다. 또한 여기에 설명 된 기술은 고통과 고통을 최소화하고 연구에서 동물의 복지를 직접적으로 향상시키기 때문에 3R 원칙을 구현 한 예입니다.

서문

PCa와 가장 흔한 형태인 췌장 유관 아데노암종(PDAC)은 ^1,2단계에^{관계없이 1년} 생존율이 20% 미만이고 5년 생존율이 8%인 암 관련 사망의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 이 질병은 거의 항상 치명적이며, 발병률이 감소하는 다른 암 유형과 달리 발병률은 향후 몇 년 동안 지속적으로 증가 할 것으로 예상됩니다³. 늦은 암 발견, 빠른 진행 경향 및 특정 요법의 부족과 같은 요인은 PCa⁴의 나쁜 예후를 초래합니다. 보다 정확한 전임상 마우스 모델의 개발 덕분에 암 연구에서 큰 발전을 이루었습니다. 이 모델은 암의 기저에 있는 분자 메커니즘의 이해와^{새로운 치료법 개발에} 적절한 통찰력을 제공했습니다5. 이러한 발전은 최근의 큰 노력에도 불구하고 현재의 화학 요법¹에 내성을 유지하는 PCa에 제대로 적용되지 않습니다. 이러한 이유로 환자의 전망을 개선하기 위한 새로운 접근 방식의 개발이 필수적입니다.

수년에 걸쳐 오늘날 가장 널리 사용되는 모델 인 이종 이식편을 포함하....

프로토콜

현재 프로토콜은 승인 번호 843/2020-PR로 이탈리아 보건부의 승인을 받았습니다. 무균 상태를 보장하기 위해, 동물들은 플로렌스 대학의 연구 동물 사육장(Ce.S.A.L.)의 장벽실 내에서 유지되었다. 모든 절차는 마우스가 플로렌스 대학 (이탈리아)의 LIGeMA 시설에 수용된 동일한 공간에서 수행되었다.

1. 세포 준비

1. 2% L-글루타민과 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)가 포함된 100mm 페트리 접시에서 PCa 세포주의 PCa 세포를 배양합니다.
2. 세포를 5%_CO2로 37°C에서 노르옥시아에서 인큐베이션한다.
3. 트립신으로 세포를 분리하십시오. 계수하고, 접종 1시간 전에 20 μL의 PBS 중 1 x 10⁶ 세포를 재현탁시켰다.

2. 초음파 유도 주사 (US-GI)를위한 마우스 준비

참고: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행되었습니다. 마취 시작부터 마우스 플랫폼에서 마우스를 제거 할 때까지 미국 유도 주사의 전체 절차는 완전한 마....

결과

상기 기재된 프로토콜에 따라, 마우스를 먼저 이소플루란 챔버에서 마취시키고, 동물 플랫폼 상에 놓았다(도 1A). 췌장은 초음파 영상으로 시각화되었습니다 (그림 1B). 50μL 해밀턴 주사기에 20μL의 PBS에 현탁된 1 x 10⁶ PANC1 세포를 로딩하고 바늘 홀더에 놓았습니다(그림 1C). 주사기와 미국 변환기 사이의 최적 각도는 45°였습.......

토론

미국 영상화의 사용이 클리닉에서 널리 퍼져 있지만, 많은 전임상 마우스 모델에서의 종양 발달은 일반적으로 생체발광 영상화¹¹을 사용하여 기술된다. 후자는 종양 생착 및 확장을 평가하는 간접적인 방법이며 신뢰할 수 있는 종양 성장 동역학을 제공하지 않습니다. 본 연구에서는 세포 주입을 수행하고 종양 발달을 모니터링하기 위해 US 이미징을 적용했습니다. 우리가 설명한.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157